小麥莖基腐鐮孢菌致病力的快速測(cè)定

鄧淵鈺，孫海燕，李 偉，張愛(ài)香，陳懷谷

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，江蘇南京 210014)

小麥莖基腐鐮孢菌致病力的快速測(cè)定

鄧淵鈺，孫海燕，李 偉，張愛(ài)香，陳懷谷

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，江蘇南京 210014)

為建立快速、簡(jiǎn)便測(cè)定小麥莖基腐鐮孢菌致病力的方法，將5 mm的菌碟套接在催芽3 d的小麥胚芽基部，接種后的小麥置于墊有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，25 ℃下光暗(12 h/12 h)交替培養(yǎng)5 d后測(cè)量麥苗的長(zhǎng)度，以小麥苗長(zhǎng)的降低率作為鐮孢菌致病力的指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用該方法對(duì)12個(gè)菌株的致病力的測(cè)定結(jié)果與濕紙巾法有很強(qiáng)的相關(guān)性。經(jīng)該方法測(cè)定，CF0915菌株的野生型和 Tri5基因敲除突變體的致病力有顯著差異。

小麥莖基腐病；鐮孢菌；致病力測(cè)定

小麥莖基腐病是由鐮孢菌(Fusariumspp.)引起的除赤霉病之外的另一種重要小麥病害，該病害已對(duì)多個(gè)國(guó)家的小麥生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的影響[1]。鐮孢菌在小麥的莖基部開(kāi)始侵染，并沿著莖向上擴(kuò)展，使莖基向上的多個(gè)節(jié)和節(jié)間出現(xiàn)褐變，病變的組織尤其是根莖交界處出現(xiàn)干腐的癥狀。該病害發(fā)生部位低，在小麥生長(zhǎng)早期不易被發(fā)現(xiàn)，但在小麥成熟期往往會(huì)導(dǎo)致枯白穗,造成直接的產(chǎn)量損失[2-3]，該病害還導(dǎo)致單端孢霉烯毒素在麥粒中積累,危害人和動(dòng)物的健康[4-5]。20世紀(jì)小麥莖基腐病在我國(guó)僅有零星發(fā)生，但近年來(lái)已在我國(guó)的河南、河北、山東、安徽和江蘇等小麥主產(chǎn)省的部分地區(qū)造成嚴(yán)重危害[6]。據(jù)我們實(shí)地考察，江蘇沿海部分田塊由小麥莖基腐病造成的枯白穗率超過(guò)30%。在世界范圍內(nèi)，引起小麥莖基腐病的病原菌有禾谷鐮孢菌綜合物種(F.graminearumcomplex)、假禾谷鐮孢菌(F.pseudograminearum)和黃色鐮孢菌(F.culmorum)等[7-9]。在我國(guó)，小麥莖基腐病的優(yōu)勢(shì)病原菌為禾谷鐮孢菌綜合物種中的禾谷鐮孢菌(F.graminearum)和亞洲鐮孢菌(F.asiaticum)[10]，假禾谷鐮孢菌也有明顯的上升趨勢(shì)[11-12]。

病原菌致病力的測(cè)定對(duì)于病原的鑒定、病原菌的致病機(jī)理、病原菌與寄主的互作關(guān)系以及病害的防控等研究至關(guān)重要。目前針對(duì)小麥莖基腐病病原菌致病力的測(cè)定方法還未見(jiàn)報(bào)道。已有多種用于鑒定小麥品種對(duì)莖基腐病抗性的方法，這些方法也可用于病原菌致病力的測(cè)定[13-18]。但除了Yang等[18]的濕紙巾法可以在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行外，其他都需要在溫室中以盆栽方式進(jìn)行，不僅操作繁瑣，工作量大，周期長(zhǎng)，所需條件受季節(jié)影響也較大。本課題組在前期工作中，發(fā)現(xiàn)胚芽期小麥接種莖基腐鐮孢菌后，生長(zhǎng)受抑程度與所接病原菌的致病力直接相關(guān)?；谶@一發(fā)現(xiàn)，本研究擬建立可在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的快速測(cè)定小麥莖基腐鐮孢菌致病力的方法，以期為與小麥相關(guān)的鐮孢菌的研究提供更多便利。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試菌株包括9株亞洲鐮孢菌(Fusariumasiaticum)和3株禾谷鐮孢菌(Fusariumgraminearum)，均由本課題組于2009-2012年從小麥莖基腐病樣品中分離所得，并經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定。其中CF0915菌株致病性較強(qiáng)，屬于亞洲鐮孢菌(F.asiaticum)，分離自江蘇省南京市的小麥莖基腐病樣品。CF0915菌株的 Tri5基因敲除突變體CF0915-Δtri和 Tri5基因回補(bǔ)突變體CF0915-Δtri+Tri由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[19]。供試的小麥品種為揚(yáng)麥158。

1.2 方 法

1.2.1 接種體的制備

菌碟的制備：將小麥莖基腐鐮孢菌接種于PDA平板上，25 ℃黑暗培養(yǎng)6 d，在菌落邊緣用打孔器制取直徑為5 mm的菌碟。

孢子液的制備：將小麥莖基腐鐮孢菌接種于6%的綠豆湯培養(yǎng)基中，25 ℃下震蕩培養(yǎng)4 d, 在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定其中的分生孢子數(shù)量，然后用無(wú)菌水將分生孢子稀釋至1.0×106個(gè)·mL-1，接種前加入適量的吐溫-20使其濃度為0.1%(v/v)[15]。

病麥粒的制備：將300 g小麥種子在水中浸泡4 h，瀝干其表面的水分后分裝至3個(gè)250 mL的三角瓶，滅菌；分別接入CF0915、CF0915-Δtri和CF0915-Δtri+Tri菌株，每個(gè)菌株接3個(gè)直徑為5 mm的菌碟， 25 ℃培養(yǎng)，待麥粒上均勻地長(zhǎng)滿菌絲(28 d)后保存至4 ℃冰箱。

1.2.2 接種方式的比較

將小麥種子用1% NaClO溶液消毒后置于25 ℃下催芽3 d，挑選胚芽長(zhǎng)度為1.2 cm左右的幼苗分別用以下3種方式接種，然后按1.2.3所述，在室溫下(25 ℃左右)培養(yǎng)5 d，調(diào)查發(fā)病情況，選取發(fā)病程度最高的接種方式進(jìn)行后續(xù)研究。

接種方式一(套菌碟)：在制備好的菌株CF0915的菌碟中央用200 μL的加樣器吸頭尖端扎一小孔，將小麥胚芽的尖端插入小孔并推動(dòng)菌碟至胚芽的基部，使得每棵小麥的胚芽上套有一個(gè)菌碟并且菌碟的菌絲面與小麥的種子接觸。

接種方式二(孢子液浸泡)：將小麥幼苗在菌株CF0915的孢子液中浸泡2 min后取出。

接種方式三(滴加孢子液)：將小麥幼苗先放置在培養(yǎng)皿中，在每棵幼苗的胚芽和種子的夾角處滴加10 μL菌株CF0915的孢子液。

1.2.3 小麥的培養(yǎng)和病菌致病力的測(cè)定

在9 cm培養(yǎng)皿中墊2層濾紙，濾紙上加5 mL無(wú)菌水使其濕潤(rùn)；在每個(gè)培養(yǎng)皿中均勻放置10棵已接種的小麥(套菌碟或孢子液浸泡)或放置小麥后接種(滴加孢子液)；蓋上培養(yǎng)皿蓋，置于25 ℃下光暗交替(14 h/10 h)培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)不接種的對(duì)照。

培養(yǎng)5 d后，觀察每個(gè)培養(yǎng)皿中小麥幼苗的生長(zhǎng)和發(fā)病情況，測(cè)量小麥的苗長(zhǎng)(莖基部至葉尖的長(zhǎng)度)，每個(gè)培養(yǎng)皿中10棵小麥苗長(zhǎng)的平均值為一次重復(fù)，共設(shè)4次重復(fù)。以生長(zhǎng)抑制率作為病菌致病力的指標(biāo)。生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照小麥苗長(zhǎng)-接菌小麥苗長(zhǎng))/(對(duì)照小麥苗長(zhǎng)-接種時(shí)胚芽的長(zhǎng)度)×100%。

1.2.4 培養(yǎng)溫度的選擇

小麥用1.2.2中發(fā)病程度最高的方式接種，分別于15、18、21、24、27和30 ℃下培養(yǎng)7 d，測(cè)量小麥的苗長(zhǎng)，比較不同溫度下病菌對(duì)小麥的生長(zhǎng)抑制率。

1.2.5 培養(yǎng)時(shí)間的選擇

小麥用1.2.4的方法接種，于25 ℃下分別培養(yǎng)3、4、5、6、7 d，測(cè)量小麥的苗長(zhǎng)，比較培養(yǎng)不同時(shí)間病菌對(duì)小麥的生長(zhǎng)抑制率。

1.2.6 本方法與濕紙巾法的比較

對(duì)隨機(jī)選取的12個(gè)小麥莖基腐鐮孢菌菌株，進(jìn)行本試驗(yàn)最優(yōu)條件和略作修改的濕紙巾法的致病力測(cè)定。濕紙巾法除了小麥幼苗的接種采用本文所述的套菌碟的方式外，其余的均參照楊學(xué)明的方法[18]。對(duì)兩種方法所測(cè)結(jié)果進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。

1.2.7 Tri5基因敲除和回補(bǔ)突變體致病力的測(cè)定

用本試驗(yàn)最優(yōu)條件對(duì)CF0915的野生菌株(CF0915-WT)和CF0915的 Tri5基因敲除突變體(CF0915-Δtri)及其回補(bǔ)突變體(CF0915-Δtri+Tri)進(jìn)行致病力測(cè)定，并將此測(cè)定結(jié)果與本課題組前期盆栽和小麥穗部接種的致病力測(cè)定結(jié)果[19-20]進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 關(guān)鍵技術(shù)與條件的優(yōu)化

2.1.1 接種方式

由圖1可知，接種后5 d，用套菌碟方式接種的小麥幼苗的苗長(zhǎng)顯著低于對(duì)照，并有87.5%的幼苗出現(xiàn)莖基變褐的癥狀；用孢子液浸泡方式接種的小麥幼苗的生長(zhǎng)也顯著受到抑制，72.5%的幼苗莖基變褐；用滴加孢子液方式接種的小麥幼苗的苗長(zhǎng)與對(duì)照差異不顯著，但有30%的幼苗莖基變褐。套菌碟方式最利于小麥發(fā)病。

圖柱上不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05) 。

Different letters above the columns indicate significant difference among different treatments (P<0.05).

圖1 不同接種方式對(duì)小麥苗長(zhǎng)的影響

Fig.1 Effect of different inoculation ways on length of wheat seedling

圖柱上不同字母表示接種與不接種處理間差異顯著(P<0.05)。圖3同。

Different letters above the columns indicate significant difference between inoculated and uninoculated(P<0.05).The same as in Fig.3.

圖2 不同培養(yǎng)溫度對(duì)小麥幼苗長(zhǎng)和生長(zhǎng)抑制率的影響

Fig.2 Effect of different temperatures on length of wheat seedling and growth inhibition ratio

2.1.2 培養(yǎng)溫度

由圖2可知，小麥培養(yǎng)7 d后，幼苗在24 ℃時(shí)最高，說(shuō)明此溫度最適合小麥生長(zhǎng)。用套菌碟的方式接種，在15～27 ℃的范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，病菌對(duì)幼苗的生長(zhǎng)抑制率顯著增強(qiáng)，27 ℃時(shí)達(dá)最高(42.5%)。當(dāng)溫度升至30 ℃時(shí)，病菌對(duì)小麥幼苗的生長(zhǎng)抑制率則明顯減弱，說(shuō)明27 ℃時(shí)病菌的致病力最強(qiáng)。綜合幼苗的生長(zhǎng)和病菌致病力，24～27 ℃為最適溫度。

2.1.3 培養(yǎng)時(shí)間

用套菌碟的方式接種，25 ℃培養(yǎng)，2～3 d后即能觀察到小麥幼苗的生長(zhǎng)受到抑制，并有少數(shù)幼苗出現(xiàn)莖基變褐的癥狀。隨著時(shí)間推移，小麥生長(zhǎng)受抑程度加重，莖基變褐幼苗增加。由圖3可知，接種后4～6 d間，小麥幼苗的生長(zhǎng)抑制率增幅較大；接種6 d以后，生長(zhǎng)抑制率仍有所增加，但增幅明顯降低。用套菌碟的方式接種，在25 ℃下培養(yǎng)5 d即可鑒定病菌的致病效果。

2.2 兩種方法對(duì)小麥莖基腐鐮孢菌致病力的測(cè)定結(jié)果

由本研究方法和濕紙巾法對(duì)12個(gè)菌株致病力的測(cè)定結(jié)果(表1)可知，兩種方法的Pearson相關(guān)系數(shù)為0.826 4，P值為0.000 9，說(shuō)明兩種方法所得結(jié)果有較好的一致性。

圖3 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)小麥幼苗長(zhǎng)及生長(zhǎng)抑制率的影響

Table 1 Virulence of twelve isolates assessed by two methods

菌株Isolate本方法Thismethod濕紙巾法Wet-towelmethod小麥的生長(zhǎng)抑制率Growthinhibitionratioofwheat/%小麥的病情指數(shù)DiseaseindexofwheatCF090188.6498.75CF091540.6374.58CF092725.0457.08CF093044.0151.79CF093863.4375.00CF094060.3966.67CF094711.8131.51CF094935.4369.95CF097436.5557.24CF097916.6461.25CF110635.5951.61CF112125.0746.25

2.3 CF0915菌株 Tri5基因敲除和回補(bǔ)突變體的致病力

經(jīng)本方法測(cè)定，CF0915菌株的 Tri5基因敲除突變體的致病力顯著低于野生型，而其 Tri5基因回補(bǔ)突變體的致病力則有較大程度的恢復(fù)，與野生型差異不顯著。這與盆栽試驗(yàn)和穗部接種試驗(yàn)的結(jié)果一致(表2)。

3 討 論

本研究以小麥莖基腐鐮孢菌能抑制胚芽期小麥的生長(zhǎng)為依據(jù)，建立了新的小麥莖基腐鐮孢菌致病力測(cè)定方法。與已報(bào)道的小麥莖基腐病菌致病力的測(cè)定方法相比，本方法具有快速簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。傳統(tǒng)的方法(盆栽法)所需的包括場(chǎng)地、溫度和濕度等條件不易得到滿足，并且需要對(duì)培養(yǎng)基質(zhì)進(jìn)行滅菌、裝填等操作。本方法為室內(nèi)試驗(yàn)，試驗(yàn)材料的培養(yǎng)在培養(yǎng)皿中進(jìn)行，占用空間小，無(wú)需用培養(yǎng)基質(zhì)，全程條件可控。盆栽法與濕紙巾法以小麥的病情指數(shù)作為鐮孢菌致病力的指標(biāo)，病情指數(shù)由病情分級(jí)計(jì)算而得，而病情分級(jí)的判斷受主觀影響較大。本方法所用的生長(zhǎng)抑制率雖然是一種間接的指標(biāo)，但其數(shù)據(jù)的獲得更加直接和客觀。盆栽法的試驗(yàn)周期通常為35～60 d，濕紙巾法的試驗(yàn)周期為15 d，而本方法在最優(yōu)條件下的試驗(yàn)周期僅為5 d。本方法的可靠性已通過(guò)與濕紙巾法的測(cè)定結(jié)果比較得到驗(yàn)證。除了致病力測(cè)定外，本方法也可為研究有關(guān)基因在致病過(guò)程中的作用提供便利，如本課題組先前通過(guò)盆栽試驗(yàn)和小麥穗部接種試驗(yàn)證明了 Tri5基因?qū)︾犳呔虏×Φ呢暙I(xiàn)，用本方法也得到了相同的結(jié)果。

表2 CF0915的 Tri5基因敲除和回補(bǔ)突變體的致病力

Table 2 Virulence of Tri5-deletion and complemented mutants of CF0915

菌株Strain本方法Thismethod盆栽試驗(yàn)Potexperiment穗部接種試驗(yàn)Headinoculationexperiment小麥的生長(zhǎng)抑制率Growthinhibitionratioofwheat/%小麥的病情指數(shù)Diseaseindexofwheat病小穗數(shù)*Numberofdiseasedspikelets*CF091538.58a74.72a14.53aCF0915-Δtri8.76b35.57b2.37bCF0915-Δtri+Tri31.88a71.40a10.90a

同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(P<0.05)；*:接種后28 d測(cè)定。

Different letters following dates in the same column mean significant difference(P<0.05);*:Tested at 28th day after inoculation.

套菌碟的接種方式具有一定的新穎性，它利用小麥胚芽的形態(tài)特點(diǎn)，將菌碟固定在小麥的莖基部，使菌絲與培養(yǎng)基和寄主植物同時(shí)接觸，這種接種方式不僅實(shí)現(xiàn)了病原菌對(duì)寄主的快速和持續(xù)侵染，還可以為研究營(yíng)養(yǎng)和相關(guān)環(huán)境條件對(duì)病原菌致病力的影響提供手段。浸泡孢子液的接種方式雖然使小麥致病的效率不如套菌碟高，但適當(dāng)延長(zhǎng)小麥接種后的培養(yǎng)時(shí)間，對(duì)病原菌致病力的測(cè)定也能得到良好的結(jié)果，由于其操作相對(duì)簡(jiǎn)單，較適合于對(duì)大批量菌株的測(cè)定。

雖然本方法對(duì)小麥莖基腐鐮孢菌致病力的測(cè)定具有優(yōu)勢(shì)，但是由于其歷時(shí)較短，小麥接種后主要表現(xiàn)為生長(zhǎng)受到抑制，而不同品種之間的其他癥狀的差異還不能充分表現(xiàn)，所以在對(duì)小麥品種對(duì)莖基腐病的抗性鑒定方面，本方法不如盆栽法準(zhǔn)確。

通過(guò)本方法對(duì)多個(gè)菌株的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)不同菌株之間致病力有很大的差異，大多數(shù)菌株對(duì)小麥的生長(zhǎng)抑制率為25～50%，少數(shù)菌株對(duì)小麥的生長(zhǎng)抑制率在25%以下或50%以上，因此在利用本方法進(jìn)行致病力測(cè)定時(shí)，建議將對(duì)小麥的生長(zhǎng)抑制率低于25%的評(píng)為弱致病力菌株，生長(zhǎng)抑制率為25～50%的評(píng)為中等致病力菌株，生長(zhǎng)抑制率高于50%的評(píng)為強(qiáng)致病力菌株，同時(shí)可以選用致病力中等的菌株作為參照。

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Rapid Virulence Assessment ofFusariumPathogens Causing Crown Rot of Wheat

DENG Yuanyu,SUN Haiyan,LI Wei,ZHANG Aixiang,CHEN Huaigu

(Institute of Plant Protection, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing, Jiangsu 210014, China)

A simple and rapid method for virulence assessment ofFusariumspp. causing crown rot of wheat was established.Three-day old wheat seedling was inoculated with the pathogen by inserting the whole germ through the center of a 5-mm mycelial plug; inoculated seedlings were put onto a Petri dish matted with water-saturated filter papers and cultivated at 25 ℃ with alternation of light and dark(12 h/12 h) for 5 d; the shoot length of each seedling was measured, and the reduction rate of wheat shoot length was taken as the indicator of pathogen virulence. Result showed that the virulence of twelve isolates assessed by this new method has strong relationship with that assessed by the method of wet-towel. Assessed by this new method, the virulence of wide type and Tri5-deletion mutant of isolate CF0915 showed significant difference.

Crown rot of wheat；Fusariumspp.；Virulence assessment

時(shí)間：2016-11-04

2016-03-09

2016-04-20

國(guó)家小麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-3-1-17); 國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))專項(xiàng)(201503112)

E-mail：dengyy100@qq.com

陳懷谷(E-mail:huaigu@jaas.ac.cn)

S512.1；S435

A

1009-1041(2016)11-1547-06

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