小麥航天誘變抗條銹病突變體的篩選與鑒定

2016-12-30 05:56:31呂興娜杜久元蘇萍萍王琪琳吳建輝黃麗麗康振生韓德俊

麥類作物學報 2016年12期

呂興娜,杜久元,蘇萍萍,王琪琳,吳建輝,黃麗麗,康振生,韓德俊

(1.西北農林科技大學旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100； 2.西北農林科技大學農學院，陜西楊凌 712100； 3.甘肅省農科院小麥研究所，甘肅蘭州 730070； 4.西北農林科技大學植物保護學院，陜西楊凌 712100)

小麥航天誘變抗條銹病突變體的篩選與鑒定

呂興娜1,2,杜久元3,蘇萍萍1,2,王琪琳1,4,吳建輝1,4,黃麗麗1,4,康振生1,4,韓德俊1,2

航天誘變后代遺傳變異評價和表型鑒定對航天誘變育種材料的篩選具有重要意義。為了從小麥品種蘭天15和鄭麥9023的航天誘變后代中篩選出抗條銹病突變體，采用21對核心引物對其航天誘變后代與親本的遺傳相似性進行評估，用條銹菌菌株CYR32、CYR33和V26/G22對航天誘變后代進行苗期和成株期抗病性鑒定。結果表明，蘭天15的航天誘變衍生系與親本間差異標記數量較多，且抗條銹性和芒的有無等性狀發生了遺傳分離，推測可能存在異花授粉導致的遺傳重組；鄭麥9023的航天誘變衍生系與親本差異標記數量均不超過2個，且苗期抗病性等絕大部分性狀均與親本相同，僅成株期抗病性較其親本有明顯提高，推測成株期抗病性變異可能來自航天誘變。結果表明，鄭麥9023部分具有成株期抗病性的優良選系，可用于小麥抗條銹育種。

小麥；航天誘變；條銹病抗性突變體；遺傳相似性

由條型柄銹菌小麥?；?Pucciniastriiformisf.sp.tritici)引起的小麥條銹病是一種氣流傳播病害，分布廣泛，嚴重威脅小麥高產和穩產[1-2]，選育抗病品種是控制小麥條銹病最為經濟、有效的途徑[3-4]。因此，必須不斷發掘新抗源以滿足小麥育種對抗源的需求。

利用誘變技術誘發基因突變，可產生自然界原來沒有的或一般常規方法難以獲得的新類型、新性狀、新基因[5-6]。從突變體中選育新種質，是現代育種技術體系的有效手段，對作物品種改良具有獨特的作用。隨著航天技術的發展，利用空間環境誘發農作物產生性狀變異，從中篩選優良突變體的航天誘變育種，為農作物的種質創新提供了新的技術并取得了顯著成效[7]。我國于1987 年開始進行空間誘變育種，至今已搭載了水稻、小麥、大豆、油菜等9大類作物[8-9]。選育出的特早熟、優質、抗病新品系太空5號和太空6號[10]、植申1號[11]等小麥品種(系)已進入生產應用。然而，當前的航天誘變育種多停留在“送種子上天，返地后篩選”的初級階段，太空育種的系統選育方法和理論研究明顯滯后，特別是航天搭載誘變獲得的突變個體與其原始親本的遺傳學比較和分子生物學分析較少，絕大部分突變發生位點未知。杜久元等[12]利用衛星搭載，將不同小麥品種送入太空處理，從返回的航天誘變小麥中系統選育了突變衍生系，本研究擬對蘭天15和鄭麥9023的航天誘變材料進行誘變衍生系與其親本的遺傳相似性評估，并進行苗期和成株期抗條銹病鑒定及芒的有無調查，以期從中篩選出小麥抗條銹病新種質。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為小麥品種蘭天15和鄭麥9023及其航天誘變材料。蘭天15于2011 年11 月搭載于神州八號飛船；鄭麥9023于2005年9月搭載于中國第22顆返回式衛星，均由甘肅農科院杜久元研究員提供。條銹菌小種為CYR32、CYR33和從貴農22小麥標樣中分離得到的對 Yr26有毒性的致病型V26/G22，由西北農林科技大學小麥銹病實驗室經單孢分離獲得，并經一套中國小麥條銹病鑒別寄主鑒定后，隔離繁殖備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 航天誘變材料的系譜選育

按照系譜法選育航天誘變后代。M1代種子按1 m行長、0.2 m行距、0.05 m株距點播，種植2行親本為對照，分單株收獲、考種；M2代及其衍生系單株點播，成株期進行抗條銹病鑒定，將M2代及其衍生系群體中出現明顯抗感分離的家系，選擇具有代表性的抗病株系分單株編號收獲，結合農藝性狀，篩選抗條銹病株系。本研究中，蘭天15的M3代材料來源于M2代編號為LT15-2的家系，鄭麥9023的M5代材料來自M2代編號為ZM-39的家系，LT15-2與ZM-39在M2代均為抗感分離明顯的家系。1.2.2 航天誘變材料與其親本的遺傳相似性評估

參照王立新等[13]評估小麥純度的方法，用小麥染色體上特異性和穩定性較好的21對核心引物[14]對篩選的突變體與其親本進行遺傳相似性評估，以確定其遺傳變異是否存在異花授粉導致的遺傳重組。引物詳細信息見表1。

1.2.3 苗期抗條銹病鑒定

在溫室以 Avocet S為感病對照，在二葉期采用抖粉法[15]分別接種CYR32和V26/G22條銹菌小種，黑暗保濕 24 h 后，轉到溫室生長。接種后約 15 d 左右，待感病對照充分發病時，按照 Line 等[16]的標準記載反應型(IT)，此后每 5 d 調查一次，共調查 3 次，以最高反應型作抗病性評價。每個小種鑒定進行3次生物學重復，以最高反應型為準。

1.2.4 成株期抗條銹病鑒定

小麥成株期抗病鑒定分別于 2013-2014 和2014-2015兩個生長季，分別在陜西楊凌西北農林科技大學實驗農場(34°16′N，108°4′E)和甘肅省天水市秦州區平南鎮萬家莊村(34°27′N，105°56′E)進行。每份供試小麥品種種植兩行，每隔 20 個品種種植兩行小偃 22 做為感病對照，感病品種銘賢169為誘發行。3月上旬，在楊凌人工病圃的誘發行接種條銹菌小種 CYR32和CYR33；4月中旬開始監測病圃發病狀況，5月上、中旬條銹病盛發期，記載各供試小麥品種旗葉和倒二葉的反應型和嚴重度。天水自然誘發圃于5月下旬條銹病進入盛發期后，記載小麥成株期抗病反應型和嚴重度。按照 Line等[16]0～9級標準記載反應型，0～3為抗病(R)，4～6為中抗(MR)，7為中感(MS)，8～9為感病(S)。按照李振岐等[17]的方法，調查30 株小麥的嚴重度，分為1%、5%、10%、20%、40%、60%、80%和100%共8個等級，每隔5～7 d 記錄 1 次，調查 3 次，最終結果按照最高反應型和嚴重度為準。

表1 21對引物的詳細信息

Table 1 Detailed information of 21 primers

引物Primer引物類型Primertype染色體位置Chromosomallocation退火溫度Tm/℃片段大小Fragmentsize/bpcwm65EST?SSR1A65220～260barc80Genomic?SSR1BL65100～125cfd72Genomic?SSR1D65210～240gwm294Genomic?SSR2AL6550～120gwm429Genomic?SSR2BS58190～230gwm261Genomic?SSR2DS65160～200gwm155Genomic?SSR3AL60120～160gwm285Genomic?SSR3BS65210～250gdm72Genomic?SSR3DL60110～150gwm610Genomic?SSR4AL60160～175ksum62EST?SSR4B65160～220barc91Genomic?SSR4DL60110～160cwem40EST?SSR5A58110～180gwm67Genomic?SSR5BS6070～100cfd29Genomic?SSR5DL63180～200gwm334Genomic?SSR6AS50100～150barc198Genomic?SSR6BL65110～160cfd76Genomic?SSR6DL68140～170cfa2028Genomic?SSR7AS65220～240gwm333Genomic?SSR7BL63150gwm437Genomic?SSR7DL5090～140

2 結果與分析

2.1 航天誘變后代的遺傳相似性

用21對引物對航天誘變衍生系與親本進行遺傳背景相似性評估。參照小麥純度檢測標準[13]，差異標記≥3表示與親本遺傳相似性低，存在異花授粉的可能性。結果表明，蘭天15的M3代誘變衍生系與親本差異標記均≥3，最多可達12個(表2)，推測可能存在異花授粉。鄭麥9023的M5代誘變衍生系與親本差異標記均≤2(表3)，與親本遺傳相似性高。圖1、圖2分別為利用引物gwm333對蘭天15衍生系和鄭麥9023衍生系的部分PCR擴增、電泳結果。圖1中，衍生系與對照相比明顯出現了多種變異，部分蘭天15的航天誘變M3代衍生系擴增條帶數目增加，10個衍生系中只有3個與親本擴增產物一致。圖2中10個鄭麥9023的M5代誘變衍生系均與親本帶型一致。

1～10:M3衍生系;CK:蘭天15;M:DS100 marker。

1-10:M3 derives;CK:Lantian 15;M:DS100 marker.

圖1 蘭天15及其部分M3代衍生系的gwm333擴增結果

Fig.1 PCR profile of gwm333 in Lantian 15 and some M3 derives

1～10:M5衍生系;CK:鄭麥9023; M:DS100 marker。

1-10:M5 derive;CK:Zhengmai 9023;M: DS100 marker.

圖2 鄭麥9023及其部分M5代衍生系的gwm333擴增結果

Fig.2 PCR profile of gwm333 in Zhengmai 9023 and some M5 derivers

2.2 航天誘變后代的農藝性狀

2.2.1 蘭天15誘變衍生系農藝性狀

經過苗期接種鑒定，蘭天15對CYR32、V26/G22兩個小種均表現為感病，其M2代抗病性出現分離，有5個衍生系對小種CYR32表現抗病，9個衍生系對小種CYR32表現抗感分離，其余衍生系均表現感病。1個衍生系對小種V26/G22表現抗病，其余衍生系均表現感病。

由表2可知，蘭天15 的16個M2代的167份M3代衍生系的抗銹性和芒的有無發生了不同程度的分離。

2.2.2 鄭麥9023航天誘變衍生系的抗條銹性

經過苗期分小種鑒定，親本鄭麥9023及46份M5代誘變衍生系對CYR32和V26/G22兩個小種均表現為感病。成株期鑒定結果(表3)表明，親本鄭麥9023在楊凌和天水兩年兩地的鑒定均表現高感，46份M5代誘變衍生系材料均表現抗病，嚴重度為5%～10%。

表2 蘭天15航天誘變衍生系分子標記和農藝性狀差異

Table 2 Differences in molecular markers and agronomic traits of space mutagenesis of Lantian 15

M2代編號M2lineNo．M3代株系數No．ofM3lines差異標記數目DifferenceNo．成株期抗銹性(抗/感/分離)Separationofadultresistance(R/S/Separate)芒的分離(有芒/無芒/分離)Separationofawn(Awn/Awnless/Separate)蘭天150R無芒LT15?2?3225～918/2/221/0/1LT15?2?4267～96/6/1426/0/0LT15?2?5138～1012/1/013/0/0LT15?2?996～93/5/18/0/1LT15?2?1995～93/6/08/0/1LT15?2?2455～75/0/00/0/5LT15?2?2587～98/0/08/0/0LT15?2?27123～97/0/50/0/12LT15?2?2886～123/5/08/0/0LT15?2?30136～82/11/013/0/0LT15?2?3184～74/4/00/8/0LT15?2?4176～117/0/00/7/0LT15?2?5035～71/2/03/0/0LT15?2?57106～127/1/20/10/0LT15?2?5976～93/3/13/3/1LT15?2?8278～103/3/13/3/1

R:Resistance;S:Susceptible.

3 討論

3.1 航天誘變材料遺傳變異評估的必要性

航天誘變變異方向不定[18]，可能產生花器官變異，使穎殼張開[19]，如果不進行嚴格套袋，可能導致異花授粉，使誘變衍生系出現混雜。因此分析航天誘變材料與親本遺傳背景的相似性至關重要。本研究借鑒小麥純度檢測的分子檢測方法進行遺傳相似性評估，所采用的21對全基因組的引物多態性信息量高，具有較強分辨率，可完成95%～100%的品系的種子純度檢測[14]。分子檢測結果表明，蘭天15的M3代衍生系與親本之間的差異標記數目達3～12個，初步判斷該誘變系群在早代發生了異花授粉，其性狀變異可能來自遺傳重組。鄭麥9023的M5代誘變衍生系群內，差異標記數量極少，最多不超過2個，該誘變系群存在異花授粉的可能性較低。為了驗證分子檢測結果，本研究對誘變系群進行了田間部分農藝性狀調查，結果發現，被測蘭天15的M3代誘變衍生系不僅芒的性狀出現明顯分離，株高，葉色等多個農藝性狀與親本均有差異且后代呈規律性分離，進一步證明蘭天15誘變系群存在遺傳重組導致性狀變異的可能。調查中發現，在小麥開花期間，部分衍生系穎殼明顯外張，推測可能由此導致異花授粉。被測鄭麥9023的M5代誘變衍生系的農藝性狀與其親本基本一致，只有部分衍生系成株期抗病性明顯提高，據此認為，其抗病性改變可能是航天誘變的結果。突變發生的位點及突變導致抗病性改變的機制有待進一步研究。針對航天誘變后代衍生系可能出現異花授粉的情況，今后將對新創制的材料進行嚴格地套袋，并進行開花習性的調查，對花器官發生變異的植株進行重點保護。

表3 鄭麥9023航天誘變M5代抗條銹性評價及差異標記數目

Table 3 Resistance of Zhengmai 9023 progenies of wheat space mutagenesis to stripe rust and the different numbers of markers

M5代選系編號M5LineNo．苗期抗性SeedinginfecttypeCYR32V26成株期抗性Adultresistance2014(Y)2014(T)2015(Y)2015(T)抗性評價Resistanceevolution差異標記數目DifferentNo．鄭麥9023SSS60S80S40S60S0ZM?39?26?4?5?1SSR5R10R10R10APR1ZM?39?26?5?5?3SSR10R10R10R10APR1ZM?39?26?19?6?1SSR10R10R10R10APR1ZM?39?40?19?10?6SSR5R10R10R10APR2ZM?39?40?3?1?2SSR10R10R5R10APR2ZM?39?40?8?2?7SSR10R10R10R10APR1ZM?39?63?20?9?5SSR10R10R10R10APR1ZM?39?63?20?10?1SSR5R10R5R10APR1ZM?39?63?12?9?7SSR10R10R10R10APR1

R：抗病；S：感病；R或S后面的數字代表嚴重度；APR：成株期抗?。籝：楊凌；T：天水。

R:Resistance; S:Susceptible;Values following R or S mean severity;APR:Adult plant resistance; Y:Yangling; T:Tianshui.

航天搭載處理導致植物突變的機制目前尚不明確。張志勇等[20]利用重測序技術對水稻航天誘變突變體及其野生型進行全基因組測序，結果發現，航天誘變對水稻基因組的改變以單堿基變化為主，因此本研究使用一定數量的分子標記進行遺傳相似性檢測，可降低航天誘變引起的變異對檢測結果的影響。通過本研究建立了篩選航天誘變后代衍生系的技術體系，在利用系譜法選育誘變突變體衍生系過程中，應結合遺傳相似性的評估。

3.2 航天誘變育種是創制新種質的重要途徑

空間搭載小麥因太空環境的特殊性可以產生罕見的突變體，是獲得新基因的重要途徑之一。曹麗等[21]研究表明，航天搭載能夠使小麥產生株高的變異。王美芳等[22]研究表明，航天誘變可引起小麥株高、葉色、穗長、產量性狀、品質性狀等方面的變異。趙洪兵等[23]通過航天搭載發現了葉綠素缺失突變體，對發掘光合作用相關基因具有重要意義。本研究中，鄭麥9023的部分航天誘變后代衍生系的成株期抗性明顯提升且抗病性穩定，經遺傳相似性分析，未發現異花授粉，說明航天誘變產生了抗條銹性的變異?？蓪⑦@些抗性明顯提高的衍生系應用于抗條銹育種。

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Screening and Identification Resistance to Stripe Rust from Space Mutagenesis of Wheat

Lü Xingna1,2,DU Jiuyuan3,SU Pingping1,2,WANG Qilin1,4,WU Jianhui1,4,HUANG Lili1,4,KANG Zhensheng1,4,HAN Dejun1,2

(1.State Key Laboratory of Crop Stress Biology in Arid Areas,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China; 2.College of Agronomy,Northwest A&F University,Yangling ,Shaanxi 712100,China; 3.Wheat Research Institute,Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou,Gansu 730070,China; 4.College of Plant Protection,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China)

The evaluation of the genetic variation and the phenotype identification of space mutation progeny is of great significance to space mutation breeding. To select the stripe rust mutants from the space mutagenesis of Liantian 15 and Zhengmai 9023,the genetic similarity between the space mutagenesis and their parents were assessed through 21 pairs of core primers and the stripe rust resistance were assessed through inoculating the prevalent stripe rust race CYR32，CYR33 and the main pathotype V26/G22 in the seedling stage in the greenhouse and in the adult plant stage in the field,respectively. And the agronomic traits were investigated in the field. The results showed that more than three molecular markers in the space mutagenesis of Liantian 15 were different from those in the mutagenic parents and the separation existed in the stripe rust resistance,the character of their awns and other agronomic traits. We speculated the variation of the characters resulted from cross pollination in Liantian 15. In the mutagenesis of Zhengmai 9023,less than two molecular markers were different from their parents,and the stripe rust resistance at the seedling stage to the tested races and most agronomic traits was consistent with Zhengmai 9023. However,the resistance to stripe rust of adult plant was improved. It can be concluded that the variation of adult plant resistance resulted from space mutation. The mutagenesis with adult resistance to stripe rust of Zhengmai 9023 can be useful in the future stripe rust resistance breeding.

Wheat; Space mutation; Stripe rust resistance mutant; Genetic similarity