小麥抗條銹基因 Yr1和 Yr2分子檢測體系研究

徐 琪，李 北，薛文波，王琪琳,吳建輝，康振生，韓德俊

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌712100;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100； 3.西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

小麥抗條銹基因 Yr1和 Yr2分子檢測體系研究

徐 琪1,2，李 北1,2，薛文波1,2，王琪琳1,3,吳建輝1,3，康振生1,3，韓德俊1,2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌712100;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100； 3.西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

為建立小麥抗條銹病基因分子檢測體系，分別以 Yr1和 Yr2緊密連鎖的標(biāo)記為檢測標(biāo)記，以Sull-1、CYR29、CYR32、CYR33和V26/CM42為小麥條銹菌鑒別菌株，構(gòu)建 Yr1和 Yr2分子檢測體系，并對181份小麥高代系材料進(jìn)行了抗病鑒定和 Yr1和 Yr2基因分析。結(jié)果表明，gwm372和gwm382可作為 Yr1的檢測標(biāo)記；wmc364可作為 Yr2的檢測標(biāo)記；5個鑒別菌株對 Yr1和 Yr2具有較好的區(qū)分能力。 Yr1和 Yr2基因在181份小麥高代系材料中比例較低，表明這兩個基因在我國小麥抗病育種過程中丟失嚴(yán)重。

小麥；基因； Yr1； Yr2；分子檢測

由條形柄銹菌(Pucciniastriiformisf. sp.tritici,Pst)引起的小麥條銹病是一種氣傳性真菌大區(qū)流行病害，對我國的小麥生產(chǎn)造成了巨大損失[1-3]?？共∑贩N的選育、種植以及抗病基因的合理利用是防控小麥條銹病最為安全、經(jīng)濟(jì)、有效和環(huán)保的措施[4]。建立抗病基因分子檢測體系，不僅可用于大規(guī)模評估小麥生產(chǎn)品種抗病基因的使用狀況和遺傳多樣性水平，還可作為相關(guān)抗病基因的輔助選擇標(biāo)記，提高抗病育種選擇效率。小麥抗條銹基因 Yr1和 Yr2在我國已育成的小麥品種中被發(fā)現(xiàn)并被利用[5-6]，由于缺乏有效的分子檢測手段，使對其利用帶有一定的盲目性。隨著分子標(biāo)記在小麥遺傳改良中的應(yīng)用，對這兩個基因的染色體定位[7]和分子標(biāo)記開發(fā)等研究取得了一定進(jìn)展[8]。王 海[9]、劉 燕等[10]與Bansal等[11]均在2A染色體上發(fā)現(xiàn)了與 Yr1連鎖的SSR標(biāo)記，林 鳳等[12]在7B染色體上發(fā)現(xiàn)與 Yr2連鎖的SSR標(biāo)記。

為使 Yr1和 Yr2在中國小麥抗條銹病育種中發(fā)揮應(yīng)有的作用，本研究通過對 Yr1和 Yr2基因檢測體系輔助標(biāo)記的確定及其抗病性鑒定，建立 Yr1和 Yr2抗病基因檢測體系，并藉此分析這兩個基因在當(dāng)前我國小麥品系中的分布狀況，為豐富我國小麥品種抗病基因多樣性和抗病品種的持久利用提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試小麥材料為： Yr1的載體品種Chinese 166，以AvocetS為背景的Yr單基因系A(chǔ)vSYr1NIL， Yr2載體品種Heines VII和 SieteCerros T66；感病對照品種為AvocetS和銘賢169；來自全國各麥區(qū)的181個小麥高代系材料。所有材料均由西北農(nóng)林科技大學(xué)小麥條銹病研究室提供。

供試條銹菌菌株為V26/CM42、Sull-1、CYR29、CYR32和CYR33，由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物病理研究所提供。

1.2 抗病性鑒定

13的方法，于2013年11月在西北農(nóng)林科技大學(xué)溫室中進(jìn)行苗期抗病性鑒定，接種后15 d對發(fā)病情況進(jìn)行初次調(diào)查，此后每3 d調(diào)查一次，調(diào)查3次以上。每個小種的鑒定結(jié)果取3次調(diào)查中反應(yīng)型最高者。于2014年5月分別在接種CYR32和CYR33混合小種的楊凌人工誘發(fā)病圃和甘肅天水自然病圃進(jìn)行成株期抗條銹病鑒定。當(dāng)病圃中銘賢169進(jìn)入條銹病盛發(fā)期時，參照文獻(xiàn)14的方法，調(diào)查小麥倒二葉的抗病反應(yīng)型(infection type,IT)和嚴(yán)重度(severity，S)。反應(yīng)型按0～9級標(biāo)準(zhǔn)：0～6抗病(R)；7～9感病(S)。以0、1%、5%、10%、20%、60%、80%和100%八級標(biāo)準(zhǔn)記錄嚴(yán)重度。

1.3 Yr1和 Yr2分子檢測輔助標(biāo)記

根據(jù)文獻(xiàn)11和15分別合成2A染色體上與 Yr1連鎖的標(biāo)記stm673acag、gwm372和gwm382的引物，篩選該基因的檢測標(biāo)記。根據(jù)文獻(xiàn)16合成7B染色體上與 Yr2連鎖的SSR標(biāo)記wmc364的引物，驗(yàn)證 Yr2基因的檢測標(biāo)記。相關(guān)引物信息見表1。

表1 檢測 Yr1和 Yr2基因的分子標(biāo)記相關(guān)引物信息

Table 1 Information of detection markers related to Yr1 and Yr2 gene

Yr基因Yrgene引物Primer序列(5′?3′)Primersequence(5′?3′)產(chǎn)物大小Productsize/bp文獻(xiàn)ReferenceYr1stm673acagF：TAACTCACAACACGTTCTGGTCGT+124[11]R：ACACACACACACACAGAGAGAG-120gwm372F：AATAGAGCCCTGGGACTGGG+700[15]R：GAAGGACGACATTCCACCTGgwm382F：GTCAGATAACGCCGTCCAAT+96[15]R：CTACGTGCACCACCATTTTG-92Yr2wmc364F：ATCACAATGCTGGCCCTAAAAC+207[16]R：CAGTGCCAAAATGTCGAAAGTC-201

+：目標(biāo)Yr基因存在時其連鎖的分子標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物大??；-：目標(biāo)Yr基因不存在時其連鎖標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物大小。

+:Size of the product when the targetYrgene present; -:Size of the product when the targetYrgene absent.

標(biāo)記gwm372的PCR反應(yīng)體系為：10×Buffer 2 μL，MgCl22.5 μl，dNTPs 0.4 μL，Primer 0.5 μL，DNA 100 ng，Taq酶0.3 μL，用ddH2O補(bǔ)充體系到15 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃變性4 min；94 ℃變性45 s，65 ℃退火45 s，每循環(huán)一次降1 ℃，72 ℃延伸45 s，10個循環(huán)；94 ℃變性45 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，25個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。標(biāo)記gwm382、stm673acag和wmc364反應(yīng)體系及程序分別參照文獻(xiàn)9、11、12。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 Yr1分子檢測結(jié)果

由圖1A可知，在AvSYr1NIL和Chinese 166中，以gwm 382為引物均可擴(kuò)增出96 bp的條帶，而在不含有 Yr1的AvocetS和銘賢169中的擴(kuò)增產(chǎn)物為92 bp；以gwm372為引物在Chinese 166中擴(kuò)增出一條700 bp的條帶，而在陰性對照銘賢169中不能擴(kuò)增出該條帶(圖1B)。stm673acag標(biāo)記在攜帶 Yr1的Chinese 166中，擴(kuò)增條帶為120 bp，在陰性對照銘賢169中，擴(kuò)增條帶為124 bp，但在陽性對照AvSYr1NIL和陰性對照AvocetS中的擴(kuò)增產(chǎn)物都是120 bp，說明該標(biāo)記的多態(tài)性差異不足以區(qū)分不同背景材料中該基因存在與否。由此認(rèn)為，gwm382與gwm372兩個標(biāo)記可用于 Yr1基因檢測體系的輔助標(biāo)記。

以gwm382和gwm372標(biāo)記對181份小麥材料進(jìn)行分子檢測發(fā)現(xiàn)，10份材料可擴(kuò)增出gwm382的特征條帶，8份材料可擴(kuò)增出gwm372的特征條帶(表2)，其中，臨優(yōu)8110和滄麥2011-194兩個品種，gwm382檢測為陽性，gwm372檢測為陰性，其余171份小麥材料，上述兩個標(biāo)記檢測均為陰性，表明攜帶 Yr1的可能性不大。

M:DS100 marker; 1:AvSYr1NIL; 2:Chinese 166; 3:優(yōu)抗13; 4:蘭天 99-5-10; 5:中麥13; 6:漯7014; 7:AvoceyS; 8:銘賢169。

M:DS100 marker; 1:AvSYr1NIL; 2:Chinese 166; 3:Youkang 13; 4:Lantian 99-5-10; 5:Zhongmai 13; 6:Luo 7014; 7:AvoceyS; 8:Mingxian 169.

圖1 gwm382(A)和gwm372(B)對部分小麥材料的檢測結(jié)果

Fig.1 Patterns of some wheat materials detected by gwm382(A) and gwm372(B)

2.2 Yr1抗條銹性及其分析

苗期抗條銹鑒定結(jié)果(表2)表明， Yr1載體品種均抗CYR29和V26/CM42，而對Su1l-1、CYR32和CYR33表現(xiàn)為感病；成株期對復(fù)合小種表現(xiàn)為中感。表明 Yr1對中國小麥條銹菌具有一定的?；剐?。

對181份小麥高代系中 Yr1標(biāo)記呈陽性的10份材料進(jìn)行抗條銹性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，臨優(yōu)8110、新060109、商丘355和滄麥2011-194苗期不抗CYR29和V26/CM42，不符合 Yr1抗譜特征，優(yōu)抗13、蘭天99-5-10、蘭天04-257、蘭天06-167、09M2686-3和W27-8-1-4-3的抗性與 Yr1載體品種相同。W57-8-1-4-3、09M2686-3和蘭天04-257苗期對所有參試小種均表現(xiàn)良好抗性，且兩年兩地成株期均表現(xiàn)較高的抗性，推測這3份材料除攜帶 Yr1基因外，還攜帶其他苗期抗病基因和/或成株期抗病基因。蘭天06-167的苗期抗譜與 Yr1單基因系和Chinese 166一致，但成株期卻表現(xiàn)出高抗，推測其除了具有 Yr1基因外，可能攜帶成株期抗病基因。

2.3 Yr2分子檢測結(jié)果

由圖2可知，含有 Yr2基因的小麥品種HeinesVII和SieteCerrors T66均可擴(kuò)增出207 bp條帶，不攜帶 Yr2的材料AvocetS和銘賢169等材料的擴(kuò)增產(chǎn)物為201 bp，表明wmc364可以作為 Yr2的檢測標(biāo)記。

1:AvocetS; 2:銘賢169; 3:揚(yáng)麥20號; 4:煙農(nóng)104; 5:Heines VII; 6:Siete Cerros T66; 7:臨選8085; 8:皖西麥2012-18; M:DS100 marker。

1:AvocetS; 2:Mingxian 169; 3:Yangmai 20; 4:Yannong 104; 5:Heines VII; 6:Siete Cerros T66; 7:Linxuan 8085; 8:Wanximai 2012-18; M:DS100 marker.

圖2 分子標(biāo)記wmc364對部分小麥材料的檢測結(jié)果

Fig.2 Pattern of some wheat materials detected by wmc364

2.4 Yr2抗條銹性及其分析

兩個 Yr2載體品種Heines VII和SieteCerros T66苗期只抗Su1l-1小種，而對CYR29、CYR32、CYR33和V26/CM42均表現(xiàn)為感病；成株期對復(fù)合小種表現(xiàn)為感病。表明 Yr2對中國小麥條銹菌部分小種具有?；共⌒?。對181份小麥高代系中 Yr2呈陽性的7份材料進(jìn)行抗條銹性分析，結(jié)果表明，煙麥12和濟(jì)麥7251苗期不抗Su1l-1，其抗譜與 Yr2載體品種不一致；蘭天05-140、臨選8085、晉A171、臨遠(yuǎn)8號和皖西麥2012-08與 Yr2載體品種的抗譜一致。

表2 部分材料的PCR擴(kuò)增及其抗條銹性鑒定

Table 2 Results of PCR for Yr1, Yr2 and resistance to strip rust of partial matarials

小麥材料Wheatmaterial苗期反應(yīng)型SeedlinginfectiontypeSull?1CYR29CYR32CYR33V26/CM42成株期抗病性AdultplantresistanceYTPCR檢測結(jié)果PCRresultgwm382gwm372wmc364YrgeneAvSYr1NIL82981S30S60++-Yr1Chinese16691982S30S60++-Yr1HeinesVII19888S60S80--+Yr2SieteCerrosT6619988S60S80--+Yr2AvocetS99999S80S100----銘賢169Mingxian16999999S100S100----W57?8?1?4?321332RR++-Yr109M2686?311200RR5++-Yr1優(yōu)抗13Youkang1393882S60S80++-Yr1蘭天99?5?10Lantian99?5?1021364S30S60++-Yr1蘭天04?257Lantian04?25712132RR++-Yr1蘭天06?167Lantian06?16781872R5R5++-Yr1臨優(yōu)8110Linyou811098878S30S80+---新060109Xin06010988788S60S80++--商丘355Shangqiu35578888S60S80++--滄麥2011?194Cangmai2011?19499788S60S100+---蘭天05?140Lantian05?14023337S30S30--+Yr2臨選8085Linxuan808518777S40S80--+Yr2晉A171JinA17128878S50S60--+Yr2臨遠(yuǎn)8號Linyuan839887S30S80--+Yr2皖西麥2012?18Wanximai2012?1828889S30S80--+Yr2煙中12Yanzhong1278887S80S80--+-濟(jì)麥7251Jimai725187888S60S80--+-

R:抗病; S:感病; R、S后面的數(shù)字代表嚴(yán)重度；Y：楊凌；T：天水。

R:Resistance; S:Susceptible; R，S：Values following R and S mean severity；Y：Yangling；T：Tianshui.

3 討 論

利用已知Yr基因的分子標(biāo)記結(jié)合抗病譜，建立準(zhǔn)確、高效的小麥抗條銹病基因檢測體系，可為抗病基因的高效利用和遺傳多樣性評估提供技術(shù)支持。目前，在小麥抗條銹病基因中，已經(jīng)建立了 Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr17、Yr18、Yr26等多個Yr基因的快速檢測體系[14,17-18]。本研究通過對 Yr1的單基因系和/或載體品種的檢測，證明gwm372和gwm382可作為 Yr1的檢測分子標(biāo)記。stm673acag在遺傳距離上比gwm372和gwm382更近，但該標(biāo)記的多態(tài)性受小麥遺傳背景影響較大，不宜作為 Yr1的檢測標(biāo)記。wmc364在攜帶 Yr2載體品種Heines VII、SieteCerros T66和高代系中表現(xiàn)出了一致的多態(tài)性，可作為 Yr2檢測體系輔助標(biāo)記。在鑒別菌株方面，本研究以Sull-1、CYR29、CYR32、CYR33和V26/CM42為系列鑒別菌株，發(fā)現(xiàn) Yr1載體品種和單基因系苗期均對CYR29和V26/CM42表現(xiàn)抗病性，而對Sull-1、CYR29、CYR32和CYR33表現(xiàn)為感病； Yr2載體品種苗期對Sull-1表現(xiàn)抗性，對另外4個小種都表現(xiàn)感病。表明5個鑒別菌株對 Yr1和 Yr2具有很好的區(qū)分能力。研究發(fā)現(xiàn)，小麥材料臨優(yōu)8110、新060109、商丘355、滄麥2011-194的 Yr1檢測標(biāo)記呈陽性，煙中12和濟(jì)麥7251對 Yr2檢測標(biāo)記呈陽性，但其抗譜與相應(yīng)對照材料并不一致，具體原因有待進(jìn)一步研究。

Yr1和 Yr2基因?qū)Ξ?dāng)前流行的條銹菌小種已經(jīng)失去抗性，但這兩個基因在我國育成小麥品種中曾經(jīng)應(yīng)用十分廣泛。張玉薇等[7]對我國2006-2010年間的75個國審品種抗條銹基因推導(dǎo)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)攜帶 Yr1和 Yr2的品種分別占到13.6%和20.0%。代君麗等[8]發(fā)現(xiàn) Yr1和 Yr2在我國農(nóng)家品種中可達(dá)到21.6%，王吐虹等[9]對我國40個農(nóng)家品種進(jìn)行基因推導(dǎo)，發(fā)現(xiàn) Yr1和 Yr2出現(xiàn)頻率分別為25%和50%。本研究結(jié)果表明，181份小麥高代系材料中，10份小麥品種(系)攜帶 Yr1基因，8份材料攜帶 Yr2基因。表明這兩個基因在育種過程中逐漸被放棄使用，需要著重關(guān)注。

抗病基因合理布局與科學(xué)利用是持續(xù)治理小麥條銹病流行的重要策略[18]。本研究發(fā)現(xiàn)， Yr1和 Yr2基因分別對Sull-1和CYR29等部分小種具有良好的抗性，這些小種或致病類型在當(dāng)前小麥條銹病菌源結(jié)構(gòu)中所占比列較低，但從抗病基因多樣性角度，合理利用 Yr1和 Yr2，在穩(wěn)定和調(diào)控病原菌毒性結(jié)構(gòu)上仍具有實(shí)際價值。曾慶東等[19]就小麥條銹病已知基因?qū)Ξ?dāng)前流行小種的有效性分析的研究表明，多基因聚合品種Ibis( Yr1， Yr2)和Maris Huntsman( Yr2,Yr3a,Yr4a,Yr13)在成株期表現(xiàn)出良好的抗銹性。Eriksen等[20]研究表明，持久抗病小麥品種Savannah，聚合了 Yr1、 Yr2、 Yr9和 Yr32，其抗病性明顯提高，且抗譜較寬。因此， Yr1和 Yr2基因仍然具有很高的應(yīng)用價值。常規(guī)的傳統(tǒng)抗病育種中，由于 Yr1和 Yr2基因的抗性“喪失”，在實(shí)際的育種中難以選擇。隨著 Yr1和 Yr2基因輔助選擇標(biāo)記的開發(fā)和利用，可提高其在育種過程中的選擇效率，培育出抗病性更加持久的小麥品種[21]。隨著新的毒性小種不斷出現(xiàn)，通過基因聚合提高抗病基因利用率是解決抗病基因數(shù)量有限問題的有效策略。

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Establishment of Resistance Evaluation System for the Wheat Stripe Rust Resistance Genes Yr1 and Yr2

XU Qi1,2,LI Bei1,2,XUE Wenbo1,2,WANG Qilin1,3,WU Jianhui1,3,KANG Zhensheng1,3,HAN Dejun1,2

(1.State Key Laboratory of Crop Stress Biology in Arid Areas,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China; 2.College of Agronomy,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China; 3.College of Plant Protection,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China)

The establishment of molecular detection system about wheat stripe rust resistance genes can provide technical support for the efficient using of the resistance genes and gene aggregation. With Yr1 and Yr2 closely linked markers as the molecular markers,Sull-1,CYR29,CYR32,CYR33 and V26/CM42 for wheat stripe rust as identify strains,we construct Yr1 and Yr2 molecular detection system respectively. The evaluation of disease resistance and Yr1 and Yr2 gene analysis of 181 wheat high generation lines were carried out. The results showed that gwm372 and gwm382 could be used as detection markers for Yr1,and wmc364 could be used as a detection marker for Yr2. Five differential strains could be better applied to distinguish Yr1 and Yr2. The results of molecular detection of 181 wheat lines showed that the frequencies of Yr1 and Yr2 gene were very low,which suggested that these two genes were seriously lost in the process of wheat resistance breeding in China.

Wheat; Gene; Yr1; Yr2; Molecular detection

麥類作物學(xué)報 2016，36(12)：1611?1616JournalofTriticeaeCropsdoi：10．7606/j．issn．1009?1041．2016．12．09

2016-04-02

2016-04-18

國家“十二五”科技支撐計劃項(xiàng)目(2012BAD19B04)；國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201203014); 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31371924)；高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智計劃資助項(xiàng)目(B07049)

E-mail：xuqi19900916@126.com

康振生(E-mail:kangzs@nwsuaf.edu.cn)；韓德俊(E-mail:handj@nwsuaf.edu.cn)

時間：2016-12-07

S512.1；S330

A

1009-1041(2016)12-1605-06

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