杜鵑花根部共生真菌的分離與鑒定

摘要：對杜鵑花（Rhododendron simsii Planch.）根部土壤微生物進行了篩選，依據形態特征和rDNA ITS序列信息，對比臨近根部土壤中的真菌，共分離出5種真菌。結果表明，枝孢霉（Cladosporium cladosporioides）、頭孢霉（Cephalosporium sp.）、擬盾殼霉（Paraconiothyrium hawaiiense）均為與杜鵑花共生的真菌類型。該研究為后續杜鵑花和根際微生物共生機制的研究奠定了基礎。

關鍵詞： 杜鵑花（Rhododendron simsii Planch.）；共生真菌；形態學鑒定；ITS序列

中圖分類號：S685.21；Q949.32 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）17-4577-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.17.054

Abstract： Based on morphological characteristics and ITS sequence information， five kinds of fungi have been isolated from roots of Rhododendron simsii Planch， which was identified to be Cladosporium cladosporioides， Cephalosporium sp. and Paraconiothyrium hawaiiense. This research laid a foundation for the further study of symbiosis growth responses of host plant Rhododendron and its fungal partner.

Key words： Rhododendron simsii Planch.； symbiotic fungia； morphological identification； ITS sequence

杜鵑花（Rhododendron simsii Planch.）是杜鵑花科（Ericaeae）杜鵑花屬（Rhododendron L.）植物，被譽為“花中西施”和“木本花卉之王”。杜鵑花科約305屬3 350種，主要分布于南北半球的溫帶及北半球亞寒帶，少數屬分布在北極和熱帶高山， 中國有570余種杜鵑花品種，特有種達400多種[1]。杜鵑花兼有生態保護、美學觀賞、藥用治療、科學研究等多重功效，其水土保持功能在山地生態系統維持中的作用舉足輕重[2]。

杜鵑花科植物能與共生真菌形成歐石楠類菌根（Ericoid mycorrhizal，ERM），ERM可提高杜鵑花幼苗的移植成活率，增加杜鵑花對有毒金屬物質的耐受性，并能促進杜鵑植株的生長及養分的吸收[3，4]。于芳等[5]從野生云錦杜鵑根系中分離得到4種真菌，對云錦杜鵑幼苗的苗高、葉片數、主根數、根長、葉綠素、干重及總生物量均有顯著的促進效應。在土壤營養貧瘠的石楠灌叢生態系統中，ERM菌根會促進杜鵑對頑氮和磷的吸收[6，7]。本研究分離鑒定杜鵑（Rhododendron simsii Planch.）的根部共生真菌，以期為杜鵑花屬植物與微生物互作研究和杜鵑幼苗的培育提供理論依據，同時為菌根真菌在杜鵑培育過程中的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

選取黃岡大別山博物館前一株生長旺盛的杜鵑花根部土壤，裝入滅菌袋中封存，并編號為“根際土壤”；同時采集同株杜鵑花1 m外同樣深度的土壤作為“對照土壤”。

1.2 方法

1.2.1 根際真菌的培養和分離 取1 g根際土壤和對照土壤，分別溶于10 mL無菌水中，稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5 g/mL系列梯度，于4 ℃冰箱保存備用。取0.1 mL真菌懸液，接種于涂布50 μg/mL氨芐青霉素的PDA培養基上，于28 ℃培養，每隔24 h觀察菌落的生長情況。

分離“根際土壤”平皿中有而“對照土壤”平皿中沒有的菌，分別接種在新的PDA培養基上，于28 ℃培養，每隔12 h觀察真菌的生長情況。待真菌菌斑的面積占據平皿的一半時停止培養。

1.2.2 菌落的形態學鑒定 依據平皿內菌落的顏色、質地、有無分泌物、菌落尺寸等指標觀察每種真菌的形態特征。利用棉蘭染色法并結合光學顯微鏡對單菌落的菌絲結構進行形態學鑒定，依據菌絲結構確定分離真菌的菌落種屬。

1.2.3 菌落的分子生物學鑒定 挑取新鮮菌絲接種于PDB液體培養基中，28 ℃培養5～7 d。4 000 r/min離心回收真菌菌絲體，用無菌水沖洗5次以除凈菌絲表面黏附的培養基及其他雜質，用濾紙吸干多余水分。將菌絲在預冷的研缽液氮研磨至粉末，用2×CATB緩沖液（20 g/L CATB，10 g/L PVP-360，100 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L EDTA，0.7 mol/L NaCl，0.1% β-巰基乙醇）提取真菌基因組DNA，-20 ℃下保存備用。

采用rDNA ITSII的上下游通用引物（ITS86 F：5′-GTGAATCATCGAATCTTTGAAC-3′；ITS4R：5′- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對真菌基因組DNA進行PCR擴增，回收目的片段TA克隆后送金斯瑞生物技術有限公司測序。測序序列在NCBI數據庫內進行Blast序列比對，進一步鑒定所分離真菌的種類。

2 結果與分析

2.1 形態學鑒定結果

本次研究共分離出5株真菌，菌落特征見表1。由表1可知，wzh1和wzh2菌株為黑色，wzh3為灰白色，而wzh4和wzh5分別為淡黃色和白色。5株真菌中，僅wzh4具有絨氈結構，其余4株菌均具有絨毛結構。wzh1、wzh2、wzh3的菌落均為圓形隆起，而wzh4和wzh5的菌落則是不規則突起。wzh1、wzh2、wzh4無液體分泌物，而wzh3和wzh5則分別具有淡紅色和乳白色的液體分泌物。

從平皿內挑取菌絲體，經棉蘭染色后置于光學顯微鏡下（100×）觀察，5株真菌菌絲體的形態特征見圖1。綜合菌落的外形分析和菌絲體的形態特征，參照菌落的形態學描述，初步確定所分離的5株杜鵑花根際微生物屬子囊菌屬。

2.2 分子生物學鑒定結果

利用改進的CTAB法提取真菌基因組DNA，檢測結果帶型完整，亮度高，適合下游ITS擴增（圖2）。利用通用引物ITS和ITS4對基因組DNA進行PCR擴增，退火溫度58 ℃，該引物組合所擴增的DNA片段包括ITS1和ITSII區，以及兩個區域之間的5.8S rDNA區域。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測，wzh1、wzh2、wzh3、wzh4擴增的DNA片段約700 bp，而wzh5擴增出的DNA片段約1 000 bp（圖3）。

圖4為5株真菌的ITS序列信息，去除載體序列后在NCBI數據庫內進行Blast比對。結果表明，wzh1、wzh2均與枝孢霉（Cladosporium cladosporioides）的ITS序列KJ596320.1相似度達98%，而wzh3與枝孢霉的HQ631003序列相似度為99%，因此這3株菌株可能均為枝孢霉菌。以wzh3為基準，wzh1序列僅有12個位點堿基突變，而wzh2僅有7個堿基位點突變（圖5）。wzh4菌落的ITSI-5.8S-ITSII序列與序列HQ630973.1相似度達99%，即wzh4菌為頭孢菌（Cephalosporium sp.）。wzh5的序列與擬盾殼霉菌（Paraconiothyrium hawaiiense）的KF881749.1序列相似度達99%。

3 小結

杜鵑花菌根真菌能夠促進杜鵑花科植物營養吸收，這是由于：①真菌與杜鵑根部接觸擴大了杜鵑根部與土壤接觸的面積；②推測根內真菌有類似固氮菌的作用，能把不能利用的硝態氮轉化為容易吸收的其他氮源形式；③真菌能產生許多水解和氧化的酶類物質，如蛋白酶、纖維素酶、半纖維素降解酶、杜鵑花幾丁質酶和磷酸酶等，這些酶類可以幫助真菌分解植物細胞壁以吸收植物殘體細胞中的營養物質，最終使寄主更好地吸收土壤中的有機氮源和磷源等營養物質[8，9]。因此，杜鵑花根際共生真菌的分離鑒定，并利用菌根真菌促進杜鵑花的培育至關重要。

菌根真菌的形態特征復雜，生理指標和形態特征易隨發育階段及生境狀況的變化而改變，且不穩定，常造成形態描述的誤差，因此形態學鑒定存在很大的局限性。孢壁層次作為分類鑒定的主要依據已被人們廣泛接受，但孢壁的特征及層次很容易受到孢子發育階段、浮載劑類型及貯藏時間等的影響，從而增加了對菌根真菌種類進行鑒定的難度。此外，形態學鑒定容易忽略一些不產孢子的種類，從而低估菌根真菌的物種多樣性。對ITS區進行序列分析不僅豐富了真核生物核糖體基因ITS的序列信息，為病原菌的分類鑒定及系統發育等研究提供了十分重要的依據，而且為建立病原菌的分子監測與疫病的快速診斷技術奠定了基礎[10-13]。

本研究結果表明，分離鑒定的5株真菌中，wzh1、wzh2、wzh3均為枝孢霉，wzh4和wzh5分別為頭孢霉和擬盾殼霉，對杜鵑花植株生長及養分吸收的促進作用有待進一步研究。

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