纖維素酶/木聚糖酶產生菌株的篩選及其降解小麥秸稈的研究

摘要：從自然環境中篩選出1株可同時分泌纖維素酶和木聚糖酶的菌株，并對其降解小麥（Triticum aestivum L.）秸稈的特性進行分析。結果表明，ZH-19菌株可同時高產纖維素酶和木聚糖酶。經形態特征和ITS保守區測序分析確定該菌株為Penicillium thiersii。菌株降解小麥秸稈的過程中，纖維素酶活和木聚糖酶酶活分別在第6天和第7.5天達到其最大值，分別為145.54、93.20 U/mL；纖維素比半纖維素降解的速率要快，表明在小麥秸桿降解過程中，可能需要纖維素酶、半纖維素酶的協同作用，才能實現對木質纖維素的最大降解。

關鍵詞：小麥（Triticum aestivum L.）秸稈；發酵；木質纖維素；降解；機理

中圖分類號：Q813 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）17-4584-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.17.056

Abstract： A novel strain of Penicillium thiersii ZH-19 producing cellulase and xylanase was isolated from natural environment and its characterization of degrading wheat（Triticum aestivum L.） straw were studied. The results showed that ZH-19 could produce cellulase and xylanase. This strain was Penicillium thiersii which identified by morphology and ITS sequence. The cellulase activity reached the maximum of 145.54 U/mL at the 6th day， while xylanase activity reached the maximum level of 93.20 U/mL at the 7.5th day during the degradation process of wheat straw by P. thiersii ZH-19. Further investigation revealed that hemi-cellulose in the wheat straw was preferably degraded，and followed by cellulose，however，cellulose was degraded rapidly than that of hemi-cellulose. It indicated that the degradation process of wheat straw by P. thiersii ZH-19 possibly needed the cooperation of cellulase and xylanase.

Key words： wheat（Triticum aestivum L.） straw；Penicillium thiersii；cellulase；xylanase；degradation

木質纖維素是自然界中最豐富的可再生資源，全球年產量約為1 000億t[1]，其中11%（約110億t）由農業產生。中國是世界上的農業大國，據估計，每年中國農作物秸稈總產量大于7.8億t，其中玉米秸稈2.4億t，稻谷秸稈1.8億t，小麥秸稈1.1億t，花生和薯類和其他廢棄物等2億t[2]。中國作物秸稈資源豐富，品種多、數量大、分布廣但不均勻，這為研究和充分利用木質纖維素提供了物質基礎。然而，秸稈產量隨季節變化較大，且價值低、體積大、不便運輸。秸稈的自然降解過程又極其緩慢，充分、有效地利用這類資源相當困難，導致60%以上的秸稈未被有效利用，隨處堆放或就地焚燒，造成了極大的環境污染和嚴重的資源浪費[3]。秸稈主要含有半纖維素、纖維素、木質素和可溶性固形物。其中纖維素、半纖維素和木質素含量分別約為40%～50%、25%～25%和10%～20%，當前，如何將纖維素轉化為可利用的能源產品一直是研究者重點關注的領域。

纖維素酶是一類能夠將纖維素降解為葡萄糖的多組分酶系的總稱，它們協同作用，分解纖維素產生寡糖和纖維二糖，最終水解為葡萄糖[4]。木聚糖是植物半纖維素的主要成分，是一種多聚五碳糖，且多以異質多糖形式存在，與纖維素分子之間存在氫鍵連接和物理混合。木聚糖酶是一類降解木聚糖分子的復雜酶系，包括內切β-1，4-木聚糖酶、β-D-木糖苷酶、α-L-呋喃型阿拉伯糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、酚酸酯酶等[5]。

產纖維素酶和半纖維酶的菌很多，近年來報道的有曲霉、木霉、青霉、裂褶菌、芽孢桿菌等。陳和秀等[6]以甘蔗渣和麩皮為固體發酵培養基，優化得到一株曲霉的固態發酵產酶條件。Senthilkumar等[7]、Gutierrez-Correa等[8]通過研究分別得到費舍爾曲霉（Aspergillus fischeri）、里氏木霉（Trichoderma reesei）和黑曲霉（Aspergillus niger）混合菌固態發酵產木聚糖酶的最適條件。綜合以上研究發現，固態發酵得到的纖維素酶和半纖維酶的酶活均較低[9]。本研究從多年存放的小麥（Triticum aestivum L.）秸稈和枯爛樹葉中篩選獲得了一株具有良好降解小麥秸稈的菌株Penicillium thiersii，并對其降解小麥秸稈的特性進行了研究，以期為纖維素轉化為可利用的能源產品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

小麥秸稈和枯爛樹葉分別取自河南孟州和江蘇連云港的農家或農田，均為露天自然堆放1年以上。木聚糖、木糖、葡萄糖、結晶纖維素和其他主要化學試劑等購自國藥集團化學試劑有限公司；麩皮在當地市場購買。

1.2 培養基

用于篩選細菌的培養基為肉湯培養基：牛肉膏 10 g/L、蛋白胨 10 g/L、酵母粉 5 g/L、NaCl 5 g/L， pH 7.0～7.2。

用于篩選真菌的培養基為查氏培養基：KNO3 3 g/L、K2HPO4 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KCl 0.5 g/L，自然pH。

用于篩選酵母的培養基為YPD培養基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母粉10 g/L，自然pH。

分離篩選培養基：1 mol/L NaOH預處理的小麥秸稈10 g/L，瓊脂15 g/L。

發酵培養基：1 mol/L NaOH預處理的小麥秸稈20 g/L、蛋白胨5 g/L、K2HPO4 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KCl 0.5 g/L，自然pH。

1.3 秸稈降解菌的分離

在采集的小麥秸稈和樹葉等樣品中加入無菌水振蕩，取適量涂布于秸稈分離篩選瓊脂平板。挑取單菌落至培養基平板上劃線純化分離3次，得到純菌種。將菌種轉至相應液體搖瓶培養基，于第0、1.5、3.0、4.5、6.0、7.5、9.0、10.5天分別測定小麥秸稈中纖維素、半纖維素和木質素的降解率以及木聚糖酶、纖維素酶的酶活。

1.4 菌種鑒定

直接觀察菌株在PDA平板上的生長變化；從平板上挑菌體少許，涂于載玻片上，置于顯微鏡下觀察。

分子鑒定：提取真菌的基因組DNA，采用真菌5.8S rDNA通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCT GCCG-3′）及ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[10]擴增菌株整個ITS序列（內部轉錄間隔區）序列，PCR產物經膠回收純化、過PCR柱純化，與pGEM-T連接后，轉化到E.coli JM109中，培養至對數生長期，提取質粒并純化后提交生工生物工程（上海）股份有限公司。測序結果經DNAMAN軟件去載體后，將所得的ITS rDNA序列提交到GenBank數據庫，利用Blastn工具進行序列比對，對菌株進行鑒定。應用Clustal X（Version 1.83）軟件進行同源性分析，用Treeview（Version 3.2）軟件構建進化樹。

1.5 酶活測定

小麥秸稈發酵液經5 400 r/min離心15 min，上清液即為粗酶液。CMC酶活力的測定參考文獻[11]。

纖維素酶活公式：

X為纖維素酶活（U/mL）；W為葡萄糖生成量（mg）；V為反應液中酶液加入量；5.56為1 mg的葡萄糖的微摩爾數（1 000/180=5.56）；N為樣品稀釋倍數；T為反應時間。

木聚糖酶活力測定參考文獻[11]。木聚糖酶活公式：

X為木聚糖酶（U/mL）；W為木糖生成量（mg）；V為反應液中酶液加入量；5.56為1 mg的木聚糖的微摩爾數（1 000/150=6.67）；N為樣品稀釋倍數；T為反應時間。

采用Van Soest法測定纖維素、半纖維素與木質素含量，按照文獻[12]方法，并略加改動：即①用18%H2SO4代替37%濃鹽酸配制地衣酚試劑；②用3%SDS代替Van Soest方法配制的中性洗滌劑。

1.6 還原糖含量的測定

在試管中加入1 mL上清液（可適當稀釋），3.0 mL DNS試劑，將待測樣品放入沸水浴中反應5 min，用水定容至25 mL，空白管以1 mL水代替1 mL酶液，然后以空白管較零，在540 nm下測定吸光度，根據葡萄糖標準曲線求出還原糖的含量[13]。

1.7 紅外掃描樣品

定時取出發酵液5 400 r/min離心10 min，所獲得的殘渣在50 ℃下烘干至恒重，然后取約4 mg殘渣于研缽中，并加少量的KBr，研磨充分，進行壓片[14]。

1.8 數據分析

采用SPSS10.0軟件進行數據處理，每處理3次重復。

2 結果與分析

2.1 降解小麥秸稈菌株的篩選

從采集的小麥秸稈樣本中篩選出具有一定秸稈降解能力的菌株29株，經搖瓶培養測定對比各菌株降解纖維素、半纖維素及木質素的能力，最終確定菌株ZH-19降解秸稈能力最高，對小麥秸稈中的纖維素和半纖維素降解率分別達到87.91%±5.24%和66.54%±7.56%。

2.2 菌株ZH-19的鑒定

如圖1所示，菌株ZH-19的菌落在PDA培養基上培養7 d，直徑約50 mm，中間有臍狀突起而其他部分平坦；質地絨狀；分生孢子大量產生；菌落中心呈灰綠色，菌落反面為黃褐色。

以菌株ZH-19基因組DNA為模板，采用通用引物ITS1和ITS4擴增整個ITS序列，PCR產物經純化后插入pGEM-T載體中，對擴增產物進行測序。將序列提交到Genebank數據庫，數據庫登記號為DQ532125。將其ITS基因序列在Genebank數據庫進行同源性比對，與其相似性較高序列的系統發育樹如圖2所示，從相似性分析和系統進化樹可以看出，Penicillium thiersii NRRL 28147與菌株ZH-19的ITS序列的相似性達100%，表明二者親緣性最近。因此，綜合形態鑒定和分子鑒定，將菌株ZH-19命名為Penicillium thiersii ZH-19。

2.3 P. thiersii ZH-19降解小麥秸稈

2.3.1 纖維素酶、半纖維素酶和還原糖的變化 從圖3可知，從發酵開始到第4.5天，小麥秸稈還原糖濃度逐漸下降，到第4.5天降到最小值，為165.33 μg/mL，之后還原糖濃度先上升后下降，直到第9天后趨于平穩，還原糖濃度不再變化。1.5 d之前菌體密度較低，對培養基原有還原糖消耗較低，且種子培養基內帶有部分纖維素酶和木聚糖酶，將秸桿分解為還原糖。隨著培養過程的發展，菌體生長加快，消耗糖較大，因此還原糖濃度逐漸下降至最低；從第4.5天開始，由于菌體消耗的糖和產生的還原糖維持平衡，還原糖的濃度保持不變。

0～7.5 d培養期間，P. thiersii ZH-19菌株所產生的纖維素酶和木聚糖酶活性總體上均處于上升階段。其中，纖維素酶活性在培養第6天時達到最大，為145.54 U/mL；而木聚糖酶在第7.5天時達到最大，為93.54 U/mL，之后二者活性均呈逐漸降低的趨勢。結果表明，在前6 d培養過程中，P. thiersii ZH-19菌株處于有利于菌體生長、酶表達和分泌的有利條件，第7.5天后，由于營養物質的消耗、pH變化等因素影響，導致菌體生長以及酶活保持能力均有一定程度的下降。

2.3.2 纖維素和半纖維素含量的變化 由圖4可知，小麥秸桿中纖維素含量明顯高于半纖維素含量。隨著發酵天數的增加，纖維素和半纖維素含量呈降低的趨勢；第7.5天，二者含量下降至6.57%±0.53%、1.72%±0.72%。之后，纖維素和半纖維素的含量變化不明顯。從圖4中也可看出，纖維素含量下降的速率要明顯快于半纖維素，由此可推測P. thiersii ZH-19菌株優先降解纖維素。這也與其產纖維素酶和半纖維素酶活變化情況一致。

2.3.3 P. thiersii ZH-19降解小麥秸稈后樣品的FT-IR分析 圖5為第0、6、10.5天P. thiersii ZH-19菌株降解小麥秸稈的FT-IR圖譜。由圖5可知，隨著發酵天數的增加，3 328 cm-1左右，2 358 cm-1左右、1 432～1 593 cm-1、1 318 cm-1和989～1 112 cm-1的相對峰值增強以及譜峰向低波數方向移動，表明小麥秸桿中碳水化合物（纖維素和半纖維素）在逐步分解，大分子的長鏈烴切斷成小分子的短鏈烴，木質纖維素中的環狀結構逐漸被裂解成為鏈狀化合物，從而使羥基、亞甲基基團及羧基數量不斷增加，再次證實了P. thiersii可降解秸桿中纖維素和半纖維素。

3 小結

從自然環境中篩選出1株可同時分泌纖維素酶和木聚糖酶的菌株，通過形態學分析和ITS保守區進行測序，該菌株被鑒定為Penicillium thiersii ZH-19，其序列在GenBank上登記號為DQ235784。通過酶活測定、秸稈中纖維素和半纖維素含量測定以及FT-IR分析發現，篩選的P. thiersii ZH-19在降解小麥秸稈過程中，纖維素優先被降解，同時，該降解過程可能由纖維素酶、半纖維素酶協同作用下實現對木質纖維素的最大降解。今后將進一步優化培養條件和培養基組分，提高酶活性，克隆相關的功能基因，深入研究其酶學性質，為開發新型纖維素酶和木聚糖酶制劑奠定基礎。

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