銅綠假單胞菌耐藥機制研究現狀

摘要：銅綠假單胞菌為條件致病菌，是目前院內感染重要病原菌之一，且由于自身結構及抗菌藥物誘導等作用，該菌極易發生耐藥，成為臨床上常見耐藥菌之一。銅綠假單胞菌的耐藥機制目前主要歸結于以下六種：①細菌產生抗生素水解酶或鈍化酶，如β-內酰胺酶、氨基糖苷鈍化酶等，使抗菌藥物失活。②細菌改變抗菌藥物作用的靶位。③外膜通透性降低，使藥物不易進入菌體，故對多種不同結構的抗菌藥物高度耐藥。④生物膜形成，營養限制、滲透障礙和免疫逃逸三種學說解釋了生物膜導致耐藥的原因。⑤主動泵出系統，使藥物直接泵出到菌體外。⑥耐藥基因的存在。本文將就以上幾種耐藥機制進行綜述。

關鍵詞：銅綠假單胞菌；感染；耐藥；機制；基因

Abstract：As opportunistic pathogen， Pseudomonas aeruginosa has become a major pathogen for nosocomial infection. Because of its structure and the role of antimicrobial agents， the bacteria can easily become resistant and become one of the most common drug resistant strains in clinic. It’s mechanism of drug resistance is as follows：①bacteria produce antibacterial activity. ②Change the target of antibiotics. ③the permeability of the membrane is reduced.④Biofilm formation.⑤Active pumping system.6. the existence of drug resistance gene. we will review the mechanism of drug resistance below.

Key words：Pseudomonas aeruginosa；Infection；Drug resistance；Mechanism；Gene

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）原稱綠膿桿菌，在自然界分布廣泛，對人類而言，屬于條件致病菌，長期應用激素、因使用免疫抑制劑或進行腫瘤放化療導致免疫功能低下，某些有創操作 （如氣管切開），留置體內導管（如導尿管、深靜脈置管等）或手術后的病人易感染本菌，故該菌是醫院內感染的重要病原菌之一。自身結構的改變及抗菌藥物誘導等原因使其極易產生耐藥，從而成為臨床上主要的耐藥菌之一，且其耐藥率呈上升趨勢，給臨床治療造成極大困難。本文將就PA耐藥機制作一綜述。

1 銅綠假單胞菌細菌學特點

銅綠假單胞菌是土壤中最常見的細菌之一，主要生存在潮濕環境中，屬于非發酵革蘭氏陰性桿菌。菌體細長，形態呈球桿狀或線狀，成對或短鏈狀排列。菌體一端有單鞭毛，無芽胞，在暗視野顯微鏡或相差顯微鏡下觀察可看見細菌運動活躍。該菌含有O抗原（菌體抗原）以及H抗原（鞭毛抗原）。O抗原包含兩種成分：①是外膜蛋白，為保護性抗原；②是脂多糖，具有特異性。

2 銅綠假單胞菌感染現狀

我國臨床分離的PA對常用抗菌藥物的耐藥性處于比較高的水平，這在2010年CHINET銅綠假單胞菌耐藥性監測中已明確提示，且多藥耐藥的PA逐年升高，給臨床治療帶來了極大的困難。我國美羅培南監測研究（Chinese Meropenem Surveillance Study，CMSS）結果顯示在2003年、2004年、2006年及2008年間分離出的銅綠假單胞菌MDR株約占該菌檢出總株數的比例分別為11.3%、14.9%、13.3%及17.1%[1]。ICU是我們重點監控的科室，這是由于ICU患者基礎疾病多而重，常需應用廣譜抗菌素甚至聯合用藥，并且體內置管及機械通氣的應用，使感染耐藥菌的機會大大增加[2]，2010年度衛生部對ICU來源細菌耐藥性監測結果顯示PA對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別達到了40.4%和34.9%[3]，耐藥現狀令人堪憂。

3 銅綠假單胞菌耐藥機制

感染銅綠假單胞菌患者治療效果不理想的重要原因就是銅綠假單胞菌產生耐藥性，其耐藥機制異常復雜，總括之，主要與以下因素有關。

3.1細菌可以產生抗生素水解酶或鈍化酶使之失活，如β-內酰胺酶、氨基糖苷鈍化酶等。PA產生的β-內酰胺酶主要包括頭孢菌素酶（AmpC）、超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）及金屬酶（MBL）。β-內酰胺酶通過水解β-內酰胺環，使抗菌藥物失活。β-內酰胺酶的產生可以是染色體依賴的，也可以是質粒介導的，即獲得性耐藥。獲得性耐藥作為耐藥菌流行的主要方式，應該引起人們足夠的重視。氨基糖苷類藥物通過不可逆結合到細菌30S核糖體亞單位抑制細菌蛋白質的合成，產生殺菌作用，而細菌可通過質粒編碼氨基糖苷類修飾酶，作用于特定的氨基或羥基，減少了氨基糖苷類抗菌藥物與核糖體的結合，使氨基糖苷類藥物發生鈍化獲得耐藥[4-5]。金屬酶是一種鈍化酶，也是由細菌產生的，對幾乎所有的β-內酰胺類抗生素均具有水解活性，是目前所知最強的β-內酰胺酶，但部分研究認為產金屬酶并不是廣泛耐藥銅綠假單胞菌（ extensively drug resistant Pseudomonas aeruginosa，XDRPA）耐藥的主要機制[6-7]。

3.2細菌可以改變抗菌藥物作用的靶位而使其失去作用位點：抗生素作用靶位在微生物生長與存活中起重要作用。很多抗生素就是通過作用于這些作用靶位干擾細菌的生長來發揮抗菌活性的。青霉素結合蛋白（PBP）位于細菌內膜，是β-內酰胺類抗菌藥物的作用靶位。喹諾酮類抗菌藥物的作用靶位是細菌DNA拓撲異構酶Ⅱ和拓撲異構酶Ⅳ。氨基糖苷類抗菌藥物的作用靶位是16s核糖體RNA（16srRNA）。而青霉素結合蛋白、DNA拓撲異構酶等結構發生改變，即作用靶位改變，就可使細菌逃避抗菌藥物的抗菌作用，從而產生耐藥性[8-9]。

3.3細胞膜的通透性降低使抗生素無法進入細胞以致不能到達作用靶位發揮作用：抗菌藥物要進入細胞內就必須穿過細菌的細胞外膜，到達作用靶位才能發揮其抗菌作用。PA的外膜由微孔蛋白孔道組成，只有小分子量糖類可以通過這些微孔蛋白擴散，LPS分子通過特定脂肪酸鏈相互鉸鏈，可以使得膜流動性和通透性降低，從而阻礙了脂溶性藥物通過細菌外膜[10]，另外膜通透性由于脂多糖結構改變或外膜蛋白編碼基因發生突變而降低或消失，藥物不易進入菌體，產生高度耐藥。

3.4生物膜形成 菌體和自身分泌的胞外基質組成了我們所說的生物被膜（BF），其中，藻酸鹽是PA生物被膜中胞外基質的主要成分。生物被膜的形成可加速細菌耐藥性的傳播，增加了臨床診療難度，嚴重威脅人類健康。其耐藥機制目前尚不十分清楚，營養限制、免疫逃逸和滲透障礙是人們比較認可的三種學說。營養限制學說主要是指生物膜內菌體細胞由于缺乏氧及營養物質導致代謝率下降，而處于這種饑餓狀態的細菌對抗生素是不敏感的；免疫逃逸學說則認為機體對細菌的免疫力受生物被膜存在所阻礙，機體免疫力減弱，抗菌的協同殺菌作用下降[10]，同時，藻酸鹽可以直接抑制中性粒細胞、巨噬細胞趨化、吞噬作用，從而引起免疫逃逸；滲透障礙學說認為BF中細菌密度高，菌株之間空間狹小，且被大量的胞外基質所填充，組成一道屏障阻礙抗生素穿透生物被膜，這樣抗菌藥物就難以對包裹在菌膜內的細菌發揮作用。

3.5通過主動外排機制將進入胞內的藥物泵至胞外 PA的主動外排系統是開口于外膜的復合體，主要由外膜通道蛋白、內膜蛋白及連接蛋白或輔助蛋白3部分組成，其可主動將藥物直接泵出到菌體外[11]。根據PA全基因組序列分析，推測該菌至少有12種主動外排系統，至今已經通過基因檢測發現了7種[12]。外排泵MexAB-OprM的高表達在PA對碳青霉烯類耐藥中可能起到重要作用[13-14]。

3.6耐藥基因 PA耐藥基因的水平傳播日趨嚴重，在PA的耐藥菌中，整合子常攜帶一個或多個耐藥基因，細菌可通過攜帶耐藥基因的整合子獲得外源性耐藥基因從而造成菌間傳播。整合子的概念是1989 年Stokes 和Hall 提出的[15]，整合子常位于質粒、轉座子上，可捕獲和整合細菌耐藥基因。整合子可以隨質粒、轉座子在細菌種內和種間廣泛傳播，在細菌多重耐藥機制中起重要作用[16-17]。有研究證實銅綠假單胞菌中有 I 類整合子的分布，I 類整合子陽性菌株及轉移接合子較陰性菌株更易產生耐藥[18]。陳華彬等人用PCR法檢測了49種PA相關耐藥基因及外膜通道蛋白oprD2基因，并作了R型聚類分析，最后得出結論，49株多藥耐藥PA對頭孢菌素耐藥主要與A類（有PER、TEM、SHV、CTX-M-13型等基因）和D類（有OXA-10、OXA-14、OXA-17、OXA-2、OXA-23、OXA-51等基因）β-內酰胺酶基因有關[19]。外膜蛋白基因的缺失或表達下調則是PA對碳青霉烯類耐藥的主要機制之一，研究顯示PA外膜蛋白缺失率達到38.89%-97%[7，20-23]。汪宏良等研究證明PA氨基糖苷類抗菌藥物耐藥主要與16S rRNA 甲基化酶編碼基因rmtB 及5 種氨基糖苷類修飾基因有關， 并發現了兩種銅綠假單胞菌16S rRNA 甲基化酶編碼基因rmtB 新亞型[24]。氨基糖苷類抗生素（AmAn） 修飾酶基因有aac（3′）-Ⅱ、aac （6′） -Ⅰb、aac （6′）-Ⅱ、ant （2′′）-Ⅰ、ant （3′′） -Ⅰ、aac（3′）-Ⅰ、aph（3′）-VIa及aph（3′）-IIb等。Aghazadeh 等報道aph（3′）-VIa （90.6%） 及aph（3′）-IIb （61.8%）的檢出率較高[25]，國內有研究發現多重耐藥PA氨基糖苷類修飾酶基因以aac（6′）-II檢出率最高[26]，而烏洪芳等從糖尿病足中分離出的PA對氨基糖苷類抗生素的耐藥基因檢出率最高的為ant（3′′）-I（65.85%）[27]。明德松等對PA喹諾酮類藥物的耐藥機制進行了Meta分析，認為我國PA耐喹諾酮類藥物的機制是以gyrA基因突變為主的[28]。

PA 有其天然的耐藥性， 但臨床上導致其耐藥的重要因素是抗生素的不合理應用，抗菌藥物的分級管理有待進一步加強，而動態監測臨床分離的PA耐藥性，依據藥敏結果合理規范選用抗菌藥物，可以有效延緩和控制細菌耐藥的發生并防止耐藥菌株的播散。而破解PA的耐藥機制、充分發揮抗生素的抗菌活性將是我們更高一步的奮斗目標。

參考文獻：

[1]Wang H， Chen M， Ni Y， et al. Antimicrobial resistance among clinical isolates from the Chinese Meropenem Surveillance Study （CMSS）， 2003–2008[J]. Int J Antimicrob Agents， 2010， 35（3）： 227-234.

[2]陳越，孫景勇，倪語星，等.2012年中國CHINET銅綠假單胞菌耐藥性監測[J].中國感染與化療雜志，2015，15（3）：199-203.

[3]張麗，楊文航，肖盟，等.2010年度衛生部全國細菌耐藥監測網報告：ICU來源細菌耐藥性監測[J]. 中華醫院感染學雜志， 2012， 22（1）：34-38

[4]Morata L，Clbos-Trigueros N，Martinez JA，et al.Influence of multidrug resistance and appropriate empirical therapy on the 30-day mortality rate of Pseudomonas aeruginosa bacteremia[J].Antimicrob Agents Chemother，2012，56（9）：4833-4837.

[5]Drusano GL，Bonomo RA，Bahniuk N，et al.Resistance emergence mechanism and mechanism of resistance suppression by tobramycinfor cefepime for Pseudomonas aeruginosa[J].Antimicrob Agents Chemother，2012，56（1）：231-242.

[6]楊菁菁，艾效曼，胡云建，等.泛耐藥銅綠假單胞菌對β-內酰胺類抗生素的耐藥機制研究[J].中國感染與化療雜志，2013，13（1）：14-18.

[7]楊芳，李艷華，劉文恩，等.廣泛耐藥銅綠假單胞菌耐藥基因和oprD2基因檢測及同源性分析[J].臨床檢驗雜志，2015，33（6）：464-468. doi： 10.13602 /j.cnki.jcls.2015.06.20.

[8]Legaree BA， Daniels K， Weadge JT， et al.Function of penicillin-binding protein in viability and morphology of Pseudomonas aeruginosa[J].J Antimicrob Chemother，2007，59（3）：411-424.

[9]Honore N， Marchal G， Cole ST. Novel mutation in 16S rRNA associated with streptomycin dependence in Mycobacterium tubercu losis[J].Antimicrob Agents Chemother，1995，39（3）：769-770.

[10]Nikaido H.Prevention of drug access to bacterial targets：permeability barriers and active efflux[J].Science，1994，264（5157）：382-388.

[11]Costerton JW，Stewart PS.Battling bioflims[J].Sci Am，2001，285（1）：74-81.

[12]Li Y，Mima T，Komori Y，et al.A new member of the tripartite multidrug efflux pumps，MexVW-OprM，in Pserdomonas aeruginosa[J].J Antimicrob Chemother，2003，52（4）：572-575.

[13]魏光，葉英，鄭美娟，等.碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌外排泵MexAB-OprM的研究[J].中國感染與化療雜志，2015，15（3）：193-198.

[14]Wang Y， Venter H， Ma S. Efflux Pump Inhibitors： A Novel Approach to Combat Efflux-Mediated Drug Resistance in Bacteria[J]. Curr Drug Targets，2015，16（999）.

[15]Stokes HW， Hall RM. A novel family of potentially mobile DNA elements encoding site-specific gene-integration functions： integrons [J]. Mol Microbiol，1989，3（12）：1669-1683.

[16]Bennett PM.Plasmid encoded antibiotic resistance： acquisition and transfer of antibiotic resistance genes in bacteria[J].Br J Pharmacol，2008，153（ Suppl 1 ）： S347-357.

[17]Khosravi Y，Tay ST，Vadivelu J.Analysis of integrons and associated gene cassettes of metallo-β-lactamase-positive Pseudomonas aeruginosa in Malaysia[J].J Med Microbiol，2011，60（Pt 7）：988-994.

[18]王玉巧，張躍斌，劉輝，等.I類整合子與銅綠假單胞菌耐藥的相關性研究[J].寧夏醫學雜志，2012，34（5）：403-405.

[19]陳華彬，王東國，王紅戟，等.多藥耐藥銅綠假單胞菌耐藥基因的研究[J].中華醫院感染學雜志，2013，23（3）：488-491.

[20]Vatcheva-Dobrevska R，Mulet X，Ivanov I，et al. Molecular epidemiology and multidrug resistance mechanisms of Pseudomonas aeruginosa isolates from Bulgarian hospitals[J].Microb Drug Resist，2013，19（5）：355-361.doi： 10.1089/mdr.2013.0004.

[21]Llanes C，Pourcel C，Richardot C，et al.Diversity of beta-lactam resistance mechanisms in cystic fibrosis isolates of Pseudomonas aeruginosa： a French multicentre study[J].J Antimicrob Chemother，2013，68（8）： 1763-1771.

[22]董國偉，郭潔.耐亞胺培南銅綠假單胞菌耐藥特征及其耐藥機制的初步研究[J].中國感染控制雜志，2014，13（7）：385-388. doi：10.3969/j.issn.1671-9638.2014.07.001.

[23]Shen J， Pan Y， Fang Y. Role of the Outer Membrane Protein OprD2 in Carbapenem-Resistance Mechanisms of Pseudomonas aeruginosa[J]. PLoS One，2015，10（10）： e0139995 .

[24]汪宏良，鄒義春，柯俊，等.多藥耐藥銅綠假單胞菌16S rRNA甲基化酶、氨基糖苷類修飾酶基因研究[J].中華醫院感染學雜志，2008，18（11）：1505-1508.

[25]Aghazadeh M， Rezaee MA， Nahaei MR， et al. Dissemination of ami？noglycoside-modifying enzymes and 16S rRNA methylases among Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa isolates[J].Microb Drug Resist， 2013， 19（4）： 282-288.

[26]秦淑國.多重耐藥銅綠假單胞菌耐藥基因檢測及耐藥特性分析[J].中國衛生檢驗雜志，2015，25（13）：2240-2246.

[27]烏洪芳，孫茜，李玉珠，等.糖尿病足分離的銅綠假單胞菌對氨基糖苷類抗生素耐藥基因探討[J].天津醫藥，2015，43（7）：768-772.

[28]明德松，鄧勇.國內銅綠假單胞菌對喹諾酮類藥物耐藥機制的Meta分析[J].中國循證醫學雜志，2013，13（10）：1215-1218.

編輯/翟辰萬