木霉可濕性粉劑對玉米小斑病的生物防治作用

孔德穎

(上海農林職業技術學院，上海市 201609)

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木霉可濕性粉劑對玉米小斑病的生物防治作用

孔德穎

(上海農林職業技術學院，上海市 201609)

玉米小斑病是我國南方玉米產區主要葉部病害之一，為探索防治玉米小斑病的生物農藥，采用實驗室培養皿理想試驗與玉米苗盆栽試驗，觀察木霉菌可濕性粉劑對病原菌菌絲生長、玉米葉片變化及玉米防御反應相關酶活的測定。實驗室結果表明，木霉菌可濕性粉劑強烈抑制玉米小斑病菌菌絲生長；盆栽結果表明，噴灑木霉可濕性粉劑抑制了小斑病菌對玉米葉片的侵染。同時噴施12h、24小時后木霉菌可濕性粉劑誘導玉米防御相關的POD和PAL酶活升高。

木霉菌；可濕性粉劑；玉米小斑病；生物防治

玉米是僅次于小麥和水稻的世界第三大糧食作物,自2012年起成為我國第一大糧食作物[1]。由玉蜀黍平臍蠕孢(Cochliobolus heterostrophus)引起的玉米小斑病是我國南方玉米產區主要葉部病害之一，目前針對玉米葉部病害的防治手段主要是抗病品系培育和化學農藥防治[2]。 抗病品系存在育種周期長，抗性易丟失的問題。葉部病害病為害主要在玉米的灌漿至乳熟期，進而影響產量，噴灑化學農藥存在藥劑難以噴灑均勻和藥殘等問題，另外由于種植戶和消費者的的環保、生態意識逐漸增強，對各種病蟲害的生物防治手段越來越受到青睞[3]。木霉菌是一類廣泛存在于自然界的真菌，木霉屬下多個種已經被應用于農業生防領域，如哈茨木霉、棘孢木霉、深綠木霉等[4]。木霉菌的生防機制包括分泌抗生物質、競爭、重寄生和系統誘導抗性[5,6]。之前的報道表明木霉菌對鐮刀菌和立枯絲核菌引起的土傳病害具有良好的防效，其使用的劑型都為顆粒劑，新型木霉可濕性粉劑的商品化和推廣為防治作物葉部病害提供了新的可能性。以商品化的木霉菌可濕性粉劑為候選生防制劑，從平板對峙實驗擴大到盆栽實驗，逐步驗證了木霉可濕性粉劑的生防效果，并從誘導玉米抗性的角度解釋了其生防機理。

1 材料與方法

1.1 生防制劑與病原菌株

玉米小斑病菌從上海農林職業技術學院五厙農場玉米田發病葉片上分離，并經過單孢純化，保存于-20℃的18%甘油中。菌株平板擴繁和產孢采用PDA培養基，成分為：200g馬鈴薯煎汁20min的過濾液，葡萄糖20g，瓊脂粉17g，蒸餾水定容至1L，121℃滅菌15min，菌株培養溫度為28℃。木霉菌可濕性粉劑系上海大井生工程有限公司產品。玉米品種為蘇玉10號。

1.2 平板對峙實驗

玉米小斑病菌在PDA培養基上培養10d 后，用直徑5mm打孔器打取菌餅放置于新的PDA平板一端，用直徑為5mm的無菌濾紙蘸取木霉菌可濕性粉劑，放置于PDA平板的另一端， 在28℃，光照黑暗交替各12h的條件下培養，以只在一端放置小斑菌餅的PDA平板作為對照，待對照病原菌生長至滿板時，用游標卡尺測量抑菌帶的寬度，抑菌率的計算公式如下：

抑菌率=(對照組病原菌直徑-處理組病原菌直徑)/對照組病原菌直徑x 100%

同時，在接種至PDA平板的 0, 24, 48, 72, 96, 120h 用十字交叉法測量玉米小斑病菌在木霉抑制和空白對照情況下的平均直徑并以此繪制生長曲線。

1.3 盆栽生防實驗

玉米種子用無菌水沖洗表面包衣3次后在30℃下無菌培養皿中保濕催芽3d，挑選健壯的發芽種子栽培于直徑15cm的花盆中，栽培土壤來自玉米大田并事先180℃干熱滅菌3h，溫室光照條件為白天光照14h、溫度30℃，夜間黑暗10h、溫度28℃，待幼苗生長至5葉期后用于實驗。木霉菌可濕性粉劑用無菌水稀釋至活菌數2X106個/ML的工作濃度，均勻噴灑至葉片表面，可濕性粉劑處理3d后接種濃度為1X104個/ML的玉米小斑病菌孢子懸浮液，夜間保濕12h，2d后調查發病情況并拍照。以無菌水處理后再接種玉米小斑病菌作為對照組。病情指數和相對防效的計算公式如下：

病情指數=∑(各級發病株數×相應發病等級)/ (總調查株數×9)×100%

相對防效=(對照病情指數-處理病情指數)/對照病情指數×100% 。

1.4 蛋白定量

參考按 Bradford[7]方法，以牛血清蛋白為標準蛋白質。按表1分別加入牛血清蛋白溶液和RO水，使各管體積為0.1 mL，混勻后加入5 mL考馬斯亮藍G-250 溶液，室溫靜置2 min，用分光光度計在595 nm 處檢測吸光度。以測得的吸收值為縱坐標，表中各管蛋白濃度為橫坐標，做標準曲線。

表1 蛋白定量標準曲線試劑配比表Table 1 The standard curve of protein concentration

1.5 防御相關酶活測定

溫室5葉期玉米經過木霉可濕性粉劑處理后，按0, 12, 24, 36,48,60, 72h 時間點采集整株葉片。POD 酶活測定參照楊家書等[8]方法，將葉片去除主脈剪碎放入研缽中，液氮研磨，加入2.5 mL 50 mmol/L 的磷酸緩沖液(pH5.29)，冰浴下研磨成勻漿，4℃ 12,000 g 離心20 min，上清液即為粗酶液。依次加入10 μL 酶樣，90 μL 磷酸緩沖液，2.8 mL 18mmol/L 愈創木酚的磷酸緩沖液于比色杯中，放入檢測槽，再加入100 μL 0.1%(V/V)H2O2起始反應，以不加酶液的緩沖液體系作為對照，記錄OD470 在1 min 內的變化，以每mg 蛋白在OD470 每分鐘內變化表示活性，POD 酶比活增減以下列公式表示[9]：

比活力增減=(接種葉片比活力-對照葉片比活力)/對照葉片比活力×100

PAL酶活測定：參照王敬文等[10]的方法，將葉片去除葉脈，液氮研磨，加入2.5 mL 硼酸緩沖液(50 mM，pH8.8，含5 mM巰基乙醇)，冰浴下研磨成勻漿，12,000 g 離心20 min，上清液即為粗酶液。依次在試管中加入1.25 mLL-苯丙氨酸(0.02 mol/L，0.2 mol/L pH8.8 硼酸緩沖液溶解)，3.65 mL 0.2 mol/L 硼酸緩沖液(pH8.8)和0.1 mL 酶液，40℃水浴1 h，后測定在290 nm 處的OD 值，以不含酶液的混合液作對照。PAL 活性單位定義為每小時A290 nm 增加到0.001 所需的酶量，酶的比活性用U/mg Pro 表示。

2 結果與分析

2.1 平板上木霉菌可濕性粉劑的抑菌效果

平板對峙結果顯示木霉菌可濕性粉劑具有較好的抑菌活性(圖1)，經計算抑菌率達到72.2%。

圖1 木霉可濕性粉劑對玉米小斑病菌的平板抑制效果Fig.1 The confrontation between TWP and C.heterostrophus on plate

生長速率測定結果表明，未經可濕性粉劑處理的對照組生長曲線明顯高于木霉可濕性粉劑處理組，當對照組病原菌生長至滿板9cm時，被抑制的病原菌最終直徑只有2.5cm(圖2)。在平板上，木霉菌對病原菌的抑制作用主要通過競爭、分泌抗性相關物質和重寄生作用3條途徑。

圖2 木霉菌可濕性粉劑處理對病原菌生長速率的影響Fig.2 The growth curve of C.heterostrophus treated by TWP

2.2 木霉可濕性粉劑對溫室玉米苗的抗病作用

如圖3所示，木霉可濕性粉劑處理顯示了良好的誘導抗病效果，不噴施可濕性粉劑的對照組在第5d和第8d的發病程度明顯高于處理組，在發病程度最嚴重的第8d，木霉可濕性粉劑的相對防效達到57.2%。由于木霉不能侵染玉米，所以在寄主玉米葉片上，木霉可濕性粉劑無法通過競爭和分泌抗性相關物質實現對病原菌的抗性，此時，木霉可濕性粉劑對病原菌的拮抗作用可能主要通過誘導寄主抗病性和重寄生作用實現。

2.3 木霉可濕性粉劑對玉米防御反應相關酶活的誘導作用

由圖4可知，POD最高酶活性出現在12h，12h后POD酶活仍然比空白對照高，在72h內均具有誘導活性；對PAL誘導活性最高出現于24h，72h內也維持了高水平的誘導活性。POD和PAL都是玉米抗性相關的關鍵酶，對這兩個酶活的誘導活性時間變化規律證實了木霉菌可濕性粉劑對玉米具有誘導抗性。

圖3 木霉可濕性粉劑對玉米的誘導抗病性Fig.3 The TWP induced resistance of corn seedings to C.heterostrophus

圖4 木霉菌可濕性粉劑誘導POD和PAL酶活的變化Fig.4 The POD and PAL activity of corn elicited by TWP

3 小結

通過木霉可濕性粉劑對玉米小斑病的影響研究，證實了

木霉作為優異的生防菌株，不論在寄主作物還是離開寄主都可以通過競爭或誘導抗性等多種途徑完成對病原真菌的拮抗作用，并揭示了以木霉可濕性粉劑為代表的生防菌劑在防治作物葉部病害上的廣闊的應用前景。

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The Biocontrol Activity of Trichoderma Wettable Powder on Southern Corn Leaf Blight

KONG De-ying

(ShanghaiVocationalCollegeofAgricultureandForestry,Shanghai,201609China)

Southern corn leaf blight(SCLB) which caused by Cochliobolus heterostrophus is a major foliage disease in corn planting areas of south China, in order to explore biological pesticide on SCLB, culture dishes in laboratory and corn cultivation in pot was tested, to investigated C.heterostrophus growth, leaf changes and determinated enzyme of corn under application of trichoderma wettable powder(TWP). The results showed that TWP was able to induce defensive responses in corn leaves against C.heterostrophus in laboratory test. Which can defend the infect of C.heterostrophus under pot culture, while, the activities of POD and PAL in corn leaves was induced and peaked at 12h, 24h respectively.

trichoderma; wettable powder; southern corn leaf blight; biological control

2016-07-28

孔德穎(1985-)，女，助教，研究方向為木霉的生防作用。