蠶豆根瘤菌接種效應研究

韓 梅， 張宏亮， 曹衛東

(1.青海省農林科學院 土壤肥料研究所，青海 西寧 810016；2.中國農業科學院 農業資源與農業區劃研究所，北京 100081)

蠶豆根瘤菌接種效應研究

韓 梅1， 張宏亮1， 曹衛東2

(1.青海省農林科學院 土壤肥料研究所，青海 西寧 810016；2.中國農業科學院 農業資源與農業區劃研究所，北京 100081)

為發掘和利用青海冷涼地區蠶豆優良的根瘤菌種質資源，確定根瘤菌的接種效應。將分離、純化、分子鑒定的16株蠶豆根瘤菌通過盆栽回接試驗的方法進行篩選。結果表明，篩選出6株根瘤菌，它們與青海13號蠶豆共生匹配效果較好，共生固氮能力強，促進蠶豆生長效果明顯。

蠶豆根瘤菌；接種；固氮

蠶豆是青海省重要的農作物之一，也是青海省“十大”特色支柱產業。蠶豆生產具有推動區域經濟發展、增加出口創匯和農民經濟收益以及保護農田生態環境等經濟、社會與生態三重效益。年種植面積2.67萬hm2左右，產量基本穩定在7.0～9.0萬t之間，商品率在70%以上。主產區分布在東部農業區的川水和低、中位山旱區，具有單產高、品質好、商品率高等特點[1]。但干旱半干旱區的蠶豆，由于土壤堿性重，鹽分高，土著根瘤菌的數量相對較少，結瘤能力弱。為了提高干旱半干旱區的蠶豆結瘤能力，有針對性地選擇高效、抗逆性強的菌株接種，提高固氮能力，增加產量。本研究是通過采集青海地區蠶豆根瘤菌，分離、純化、PCR鑒定得到根瘤菌純培養物，經過蠶豆盆栽回接試驗，初步篩選出能在蠶豆根部結瘤的根瘤菌菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蠶豆品種 青海13號蠶豆。

1.1.2 菌株 分離鑒定的蠶豆根瘤菌，1～16號菌株采自蠶豆。采集時間為2013年7月。

1.1.3 低氮培養液 Ca(NO3)2·4H2O 0.03 g，CaSO40.46 g，KCl 0.075 g，MgSO4·H2O 0.06 g，K2HPO40.136 g，檸檬酸鐵0.075 g，1%Na2MoO31 mL，1%H2BO31 mL，水1 000 mL[2]。

1.1.4 YMA培養基 甘露醇10 g，酵母浸膏 0.5 g，MgSO40.2 g，NaCl 0.1 g，K2HPO40.5 g，瓊脂18 g，水 1000 mL，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 根瘤菌的鑒定 采用16S rDNA全序列測定及鑒定。從分離、純化的蠶豆根瘤菌提取總DNA，通過PCR擴增、電泳技術及凝膠成像，形成指紋圖譜，并對PCR產物進行測定。

1.2.2 根瘤菌的回接 ①種子的處理：用75%乙醇浸泡種子5 min后，用無菌水清洗5～8次。將消毒后的種子播于鋪有無菌濕潤濾紙的平皿內，封好后置于25～28 ℃溫箱中保溫催芽48 h，種子催芽長為0.5～1.0 cm[3]。② 培養基質處理：將土壤與蛭石按1∶2.0的比例混合拌勻，加入低氮培養液，使蛭石飽和(蛭石和液體的比例為1∶2.5左右)，裝入菌袋中，高壓滅菌2 h。滅菌后將基質裝入花盆，基質界面以距盆口2 cm左右為宜。③菌液制備：將分離純化的16個蠶豆根瘤菌菌株分別接種于YMA培養基，28 ℃培養72 h。無菌水10 mL將根瘤菌菌體洗下并置于無菌培養皿中，菌懸液調至光密度值為OD=0.8～0.9，待用。④接種：設計16個處理，每處理挑選12粒芽長均為1 cm左右發芽一致的蠶豆種子。置于根瘤菌液中，浸泡15～30 min(以淹沒種子為宜)，用

無菌鑷子將其植入裝有無菌蛭石的花盆中，每盆種植3粒,再沿各種子根部加入該菌液2 mL；對照(CK)選12粒發芽一致的蠶豆種子用無菌水浸泡相同的時間，用無菌鑷子將其植入裝有無菌蛭石的花盆中。共17個處理，4次重復。培養溫度為(22±2) ℃，光強7 000～8 000 lx，光照時間16 h，根據花盆中失水狀況適期在托盤中補充水分。

1.2.3 調查指標與方法 ①調查指標：試驗培養30～40 d后收獲，調查其株高、根長、根瘤數量、地上部鮮重、干重等。②植株全氮量的測定：采用凱氏定氮法。

1.2.4 試驗數據分析方法 用Excel軟件進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 根瘤菌的鑒定

16S rDNA全序列測定鑒定結果表明，蠶豆根瘤菌的16個代表菌株均位于快生根瘤菌屬(Rhizobium)系統發育分支，相似性均大于98.00%，在98.76%～99.93%之間[4-6]。

2.2 回接試驗

2.2.1 蠶豆接種根瘤菌后生物學產量、結瘤情況 結果見表1。

表1 接種不同根瘤菌對蠶豆根瘤及生物量的影響Table 1 Effects of different root nodules on the root nodules and biomass of broad bean

注：同列數據后標不同字母a、b、c、d表示差異達顯著水平(P<0.05)

接種根瘤菌處理除菌株6-4-2-1、菌株6-1-4-1外，接種其余菌株的蠶豆株高、根長、單株根瘤數、單株瘤重、地上部鮮重、地上部干重均高于CK(不接種根瘤)，其中菌株3-10-1-1、3S-1-②、2-2-2-1、5-1-2-1、2-1-4-1、6-6-4-1單株根瘤數、單株瘤重增加較多，單株根瘤數比CK分別增加95.64%、97.36%、94.65%、94.58%、93.79%、93.86%；菌株3-10-1-1、3S-1-②、2-2-2-1、5-1-2-1、2-1-4-1、5-5-4-2、6-6-4-1單株地上部鮮重比CK分別增加39.22%、29.00%、30.65%、27.17%、22.32%、42.40%、43.17%；地上部干重比CK分別增加41.85%、19.55%、32.49%、33.33%、26.96%、30.97%、43.98%。

2.2.2 蠶豆接種效應各因素間的相關性研究 結果見表2。

表2 接種效應各因素間的相關性分析Table 2 Correlation analysis of the factors of vaccination effect

表2結果表明，根瘤數量與根瘤重、地上部鮮重與地上部干重之間具有顯著正相關，相關系數分別為0.852、0.792，說明這幾個指標對蠶豆接種效應的影響更為明顯；地上部鮮重、地上部干重在本研究中與根瘤數、根瘤重之間的相關性沒有達到顯著水平。

2.2.3 初篩結瘤能力強的蠶豆根瘤菌菌株 回接試驗結果見表1，初步篩選出促生能力好、結瘤能力強的6株蠶豆根瘤菌株，初篩出菌株的名稱及來源見表3。根據盆栽試驗結果可知，除CK(不接種根瘤菌)、菌株6-4-2-1、菌株6-1-4-1結瘤少外，分離純化的14株蠶豆根瘤菌純培養物回接結瘤率為87.5%，由此說明，回接試驗為判定是否根瘤菌的主要依據。

2.2.4 接種根瘤菌對蠶豆固氮的影響 對盆栽試驗蠶豆地上部分植株全氮含量進行測定[7](見表4)，計算地上部分氮攜出，結果顯示，蠶豆接種根瘤菌，蠶豆地上部分氮攜出量與CK相比均顯著增加，增幅為14.97%～55.33%，其中菌株3-10-1-1、2-2-2-1氮攜出量最多，分別為50.01%、47.82%[8-9]。

表3 初篩出蠶豆根瘤菌株的名稱及來源Table 3 The name and source of the initial screening of the strain of the bean root nodules

表4 不同根瘤菌株對蠶豆植株中氮攜出量的影響Table 4 Effect of different root nodules on the nitrogen content of the broad bean plant

3 討 論

經分離、純化、生物鑒定得到的16株菌株，除CK(不接種根瘤菌)、菌株6-4-2-1、菌株6-1-4-1結瘤少外，分離純化的14個蠶豆根瘤菌純培養物，回接結瘤率為87.5%。根瘤數量做為考察接種效應的一個重要指標。接種根瘤菌處理除菌株6-4-2-1、菌株6-1-4-1處理外，其余菌株蠶豆單株根瘤數、單株瘤重均高于CK(不接種根瘤菌)，其中菌株3-10-1-1、3S-1-②、2-2-2-1、5-1-2-1、2-1-4-1、6-6-4-1單株根瘤數、單株瘤重增加較多。蠶豆接種根瘤菌后地上部分氮攜出量也顯著增加。

根瘤菌-蠶豆共生體系能否高效地固氮除與雙方的基因有關外,還與土壤、環境條件等密切相關[10-11]，根瘤菌的有效性還要受到土壤生態環境、宿主植物和土著根瘤菌等環境因子的影響[12-13]。在人工控制條件下，溫度、濕度以及光照都可以控制，蠶豆接種后，地上部鮮重、干重、根瘤數、氮攜出量等差異較為明顯。與蛭石相比，土壤條件要復雜得多。因此，在蛭石初篩的基礎上，應進一步在土壤中做驗證試驗，篩選的根瘤菌才能充分發揮其高效共生固氮作用[14]。

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Rhizobium Inoculation Effect on Broad Bean (Viciafaba)

HAN Mei1, ZHANG Hong-liang1, CAO Wei-dong2

(1.Inst.ofSoil&Fertil.,QinghaiAcad.ofAgric. &Forest.Scis.,Xining810016;2.KeyLab.ofPlantNutrit'n&Fertil.,Minist.ofAgric.,Beijing100081)

In order to explore and exploit broad bean (Viciafaba)Rhizobiumexcellent germ plasm in the cold area of Qinghai, and to determine theRhizobiuminoculation effects, 16 isolated, purified, and molecularly characterized broad bean rhizobia strains were screened by pot-back test method in this study. The results showed that six rhizobia strains were screened out, they match well symbiotically with Qinghai No 13 broad bean, and had strong symbiotic nitrogen fixation capacity, and had obvious promotion of growth effects of the broad bean.

broad beanRhizobium; inoculation; nitrogen fixation

青海大學中青年基金項目(2013-QNY-2)；國家農作物種質資源平臺運行服務項目(2012)；作物種質資源保護和利用項

韓梅 女，副研究員。主要從事耕作與綠肥等方面的研究與推廣工作。E-mail：hanmei20061234@sina.com

2015-08-07；

2015-11-03

Q939.96;S144.3

A

1005-7021(2016)03-0039-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.03.007

目(NB2013-2130135)；公益性行業(農業)科研專項(201103005)