有氧運動對NAFLD大鼠肝細胞線粒體結構功能的影響

劉倩倩，秦 智，侯改霞，習雪峰，肖國強

有氧運動對NAFLD大鼠肝細胞線粒體結構功能的影響

劉倩倩1，秦 智2，侯改霞1，習雪峰1，肖國強3

目的：觀察8周60 min/天的游泳訓練對NAFLD大鼠肝臟脂質異常蓄積、細胞線粒體結構和功能紊亂的改善作用。方法：3月齡SPF級雄性SD大鼠35只，隨機分為正常對照(C組，9只)，標準飼料喂食；高脂組(26只)，高脂飼料喂食，構建NAFLD模型：分為高脂對照組(FC組，13只)和高脂運動組(FE組，13只)。采用無負重游泳訓練，每周運動6天，休息1天，持續8周。運動結束后，測定肝指數、血脂水平、肝組織切片、電鏡觀察肝細胞線粒體結構，ORT-PCR檢測細胞因子信號轉導抑制物3(SOCS3)、固醇調節元件結合蛋白1c(SREBP1c)等mRNA水平。結果：與C組相比，FC組大鼠體質量、肝質量、肝脂數、TC、FFA、SREBP1c、SOCS3 mRNA表達均出現明顯增加(P<0.01或P<0.05)，HDL-c減少(P<0.05)；FE組與FC組相比，體質量、肝臟質量、肝指數、TC、FFA、SREBP1c、SOCS3 mRNA表達均出現顯著下降(P<0.01或P<0.05)；鏡下顯示，C組大鼠肝結構清晰,細胞內無脂肪小泡，線粒體嵴豐富齊整；FC組大鼠肝結構紊亂，核畸形，核周水腫，線粒體腫脹，嵴部分排列紊亂或消失，胞內脂滴及空泡樣變數量明顯增多；FE組大鼠肝結構改善，膜結構正常，線粒體內嵴結構較為明顯。結論：1)16周高脂飲食NAFLD大鼠肝臟出現了明顯的肝臟脂質異常蓄積，肝組織結構紊亂，肝細胞內線粒體數量減少，結構畸形。2)規律的適宜強度的有氧運動可明顯改善NAFLD大鼠中存在的脂質代謝紊亂，可能通過促進肝臟細胞內線粒體的數量、形態結構、功能趨于正常，從而減少肝臟這一非脂肪組織的脂肪蓄積，減輕肝臟脂肪變性程度，促進非酒精性脂肪肝的良性轉歸。關鍵詞：非酒精性脂肪肝；非脂肪組織；肝細胞；線粒體結構；脂肪變性；大鼠

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是脂肪在肝臟這一非脂肪組織異常蓄積并引起肝組織連續應激的過程，病譜包括非酒精性單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化和肝癌，其發病率呈增高[12，27]和低齡化趨勢[10,19],NAFLD已成為一個世界性的健康問題[14]。肝細胞線粒體功能障礙在NAFLD的發病過程中起著重要作用[7],線粒體是肝細胞最重要的產能細胞器，它在細胞能量產生過程中扮演重要角色，并整合多個信號途徑來控制細胞的生命和死亡[17]。線粒體功能障礙使肝臟對脂質異常蓄積這一有害刺激耐受性降低，繼而發生肝組織脂肪變性，肝臟脂肪變性又反作用于線粒體[13，17]，引起線粒體合成ATP的能力降低，超微結構發生改變，同時誘導肝細胞損傷信號通路作用，形成一個惡性循環。膳食結構的良性調整在預防NAFLD的發生發展中起重要作用,部分是通過維持線粒體的功能達到預防效果[9]。目前，有關于運動改善NAFLD中線粒體功能的研究較少，其具體機制尚不清楚，本研究旨在通過觀察運動對NAFLD中肝細胞線粒體的超微結構和相關基因的影響，以期為其防治提供一定的理論基礎。

1 實驗對象與方法

1.1 實驗動物與飼料

3月齡SPF級雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠35只，體質量200±22 g，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(粵)2008-0002粵監證字2008D007。常規分籠喂養，自然光照，飼養環境溫度23℃±2℃，自由飲水進食。

普通飼料：選用國家標準嚙齒類動物混合飼料，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供。高脂飼料：采購于廣東省醫學實驗動物中心。高脂飼料具體成分：5%(w/w)蔗糖，18%(w/w)豬油，15%(w/w)蛋黃粉，0.5%(w/w)膽鹽，1%(w/w)膽固醇，60.5%(w/w)基礎飼料。

1.2 動物分組與模型構建

適應性喂養后，隨機抽取10只大鼠，喂食普通飼料，作為正常對照組(C組);剩余30只喂食高脂高膽固醇飼料，用于制備大鼠NAFLD模型。分組后，正常對照組大鼠喂食普通飼料，高脂組大鼠喂食高脂飼料。兩組大鼠均不限制飲食和飲水。喂食8周，每周同一時間記錄大鼠體重，及時剔除體重顯著性差異的個體，保持同組別個體間體重均無顯著性差異。于造模期的第6、7、8周兩組均宰殺1只大鼠，制備肝組織切片和測生化指標，確定模型進度，直至建模成功。建模成功后，高脂模型組大鼠分為高脂對照組(FC組)和高脂運動組(FE組)。

依據中華醫學會肝臟病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組頒布的非酒精性脂肪肝病診斷標準[16]，控制本研究動物造模質量。本研究SD大鼠NAFLD模型診斷標準為：1)血清ALT基本正常；2)肝臟組織學表現符合非酒精性脂肪肝診斷標準：低倍鏡下視野內占肝細胞總數30%以上的肝細胞發生脂肪變性，但無其他明顯組織學改變。視野內30%～50%的肝細胞脂肪變者為輕度脂肪肝；50%～75%為中度脂肪肝；75%以上為重度脂肪肝。低倍鏡下視野內發生脂肪變的肝細胞占肝細胞總數的比例<30%者稱為肝細胞脂肪變性。肝組織病理學切片送兩位執業病理醫師盲法診斷。

1.3 運動方案

高脂運動組大鼠自運動周期開始分別進行為期8周的不負重游泳訓練，第1周為適應性訓練。第1天運動時間為10 min，以后每天遞增10 min，直至游泳時間增加到60 min，從第2周開始維持此運動時間至9周結束。

1.4 取材

運動周期實驗結束后，禁食12 h，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(劑量：0.35～0.40 mL/kg bw)麻醉，腹主動脈取血，靜置、處理，用于血脂指標測試。在大鼠尚存心跳時，迅速取肝，處理大小為1～2 mm3，1 min之內入2.5%～3%戊二醛，4℃保存2～4 h。取大鼠肝臟組織置于10%中性甲醛溶液固定24～48 h，用于制備肝組織病理切片；取部分肝組織，放入液氮保存、待測。

1.5 檢測指標及方法

1)整個實驗期間，每周固定時間稱量大鼠體質量；2)采用半自動生化分析儀Eppendorf ECOM-F 6124(Eppendorf Co.Germany)檢測血清中丙氨酸轉氨酶(ALT)、總膽固醇(TC)、甘油三酯 (TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)以及高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量；3)血清游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)采用比色法；4)肝指數:稱量肝重與體質量,計算肝/體比值,即為肝指數；5)通過HE染色制作肝組織病理切片，光鏡下觀察大鼠肝臟脂肪變性情況；6)肝組織電鏡切片，通過日立H-7650透射電子顯微鏡觀察線粒體結構；7)信使核糖核酸測定：實時熒光定量檢測細胞因子信號轉導抑制物3(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3)、固醇調節元件結合蛋白1c(sterol regulatory element binding protein 1c，SREBP1c)、過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator activated receptor α，PPARα)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活因子1(peroxisome proliferator activated receptor-γ coactivator-1，PGC-1 )的表達，GAPDH作為內參。

1.6 肝組織病理切片

常規石蠟切片。HE染色，光鏡下觀測肝組織學變化。將組織塊選取同一部位進行切塊并修塊、脫水、沖水透明后,浸蠟、包埋、切片、撈片、攤片,在60℃干燥箱中過夜后,進行HE染色。

1.7 RT-PCR檢測方法

取材后，立即進行RNA的制備。加入1 mL的Trizol提取總RNA。準備 1.5 mL 的 EP管，冰上操作：在 EP管中加入0.1～5 μg模板 RNA，1 μL Oligo(dT)18引物， DEPC水定容至12 μL，短暫離心；70℃水浴5 min后，冰上冷凍；短暫離心后，冰上操作：加入 4 μL 5×First-Strand Buffer，1 μL RibolockTM Ribonuclease Inhibitor，2 μL(10 mmol)dNTP mix；短暫離心，37℃水浴5 min，加入1 μL (200 U/μL)ReverAid M-MuLV反轉錄酶(總反應體積20 μL)； 42℃水浴60 min進行反轉錄；70℃水浴10 min滅活逆轉錄酶，終止反應，再冰上冷凍；立即進行qRT-PCR。 qRT-PCR反應條件為：95℃預變性2 min；95℃變性15 s,65℃退火15 s,循環40次。試劑購于威佳生物試劑公司。目的基因引物序列如表1所示。GAPDH為內參，根據公式2-△△Ct計算目的基因相對表達量。

1.8 肝組織透射電鏡方法

取新鮮肝組織，大小為1～2 mm3，取材的刀片要鋒利，低溫操作，通常為4℃；前固定：1 min之內入2.5%～3%戊二醛，4℃，2～4 h。0.1 mol/L PBS漂洗，10 min×2；后固定：1%鋨酸1.5～2 h,0.1 mol/L PBS 漂洗，5 min×2。脫水：50%、70%乙醇逐級脫水，每級10 min，80%、90%、100%丙酮逐級脫水，每級10 min×2。置換：100%丙酮，環氧樹脂Epon812包埋劑以1∶1混合，置換40 min。浸透：環氧樹脂Epon812包埋劑37℃浸透過夜。包埋：將組織置包埋模內Epon812包埋劑包埋，60℃聚合48 h。在解剖顯微鏡下修塊，將組織表面修平整，暴露組織并根據組織表面的形狀修成梯形、正方形或長方形。切半薄切片：在AO超薄切片機下切1 μm的半薄切片，并置水上展平。HE染色。在解剖顯微鏡下和普通顯微鏡下定位，通常定位后切面為0.09 mm3；超薄切片：在AO超薄切片機下切40～60 nm的超薄切片，用銅網撈片。電子染色：70%乙醇配制的飽和醋酸鈾染色3 min，雙蒸水漂洗，鉛染液染3 min，雙蒸水漂洗。干燥后電鏡觀察。

表 1 本研究所涉全部QRT-PCR引物序列

1.9 統計方法

2 實驗結果與分析

2.1 造模期正常對照組和高脂組大鼠體重的變化

在造模周期內，正常對照組和高脂組SD大鼠的體重均有明顯增加，從適應性喂養的300 g左右增加到造模周期結束時的580 g左右，但兩組大鼠體重增加的幅度并不一致，具體數據如表2。

表 2 造模期間大鼠體重變化

注：與正常對照組大鼠適就周比較，##表示P<0.01；與高脂組大鼠適應周比較，**表示P<0.01；與正常對照組對應周比較，§ 表示P<0.05，§§表示P<0.01。

在適應性喂養的1周內，兩組大鼠體重無明顯差異(P>0.05)，進入造模周期后，兩組大鼠體重較適應周均有明顯增長，從造模第1周就呈非常著性差異(P<0.01)，此趨勢一直持續至建模期第8周。同時，造模期第1周，高脂組大鼠體重與正常對照組相比，呈顯著性差異(P<0.05)；第2、3周，兩組大鼠體重又趨于相近，差異不具統計學意義；從第4周開始至建模第8周，高脂組大鼠體重均高于同期普通正常對照組大鼠體重，且差異具有非常顯著性(P<0.01)。

2.2 各組大鼠肝指數的改變

表3顯示，運動周期結束后，FC大鼠組與C組比較，體質量平均增加22%(P<0.01)，肝臟質量平均增加74%(P<0.01)，肝指數增加42%(P<0.01)；FE組大鼠與C組相比，體質量略有下降，但無顯著差異(P>0.05)，肝臟質量增加25%(P<0.01)，肝指數增加30%(P<0.01)；FE組大鼠與FC組相比，體質量下降26%(P<0.01)，肝臟質量下降28%(P<0.01)，肝指數下降8%(P<0.01)。

2.3 各組大鼠血清脂代謝指標的變化

實驗周期結束后，FC組大鼠血清TC明顯高于C組，差異具有非常顯著性(P<0.01)；FE組大鼠TC水平與C組相比，有所升高，差異具有顯著性(P<0.05)，但與FC組相比，有所降低，差異具有顯著性(P<0.05)；TG水平，FC組大鼠明顯高于C組和FE組，差異具有非常顯著性(P<0.01)，FE組與C組相比，略有上升，差異不具有顯著性(P>0.05)；FC組大鼠HDL-c與C組相比，有所下降(P>0.05)；FE組大鼠HDL-c與C組相比降低明顯，差異具有顯著性(P<0.05)；FC組和FE組大鼠LDL-c與C組相比，均有所上升，其中，FC組增加幅度較小(P>0.05)，FE組增高較多，差異具有顯著性(P<0.05)；FC組大鼠FFA水平與C組相比，平均增加了370%(P<0.01)，FE組大鼠與C組相比，FFA水平平均增加211%(P<0.01)，FE組大鼠與FC組相比，FFA水平平均下降43%(P<0.01，表4)。

表 3 各組大鼠體質量、肝臟質量及肝指數變化

n體質量(g)肝臟質量(g)肝指數(×10-3)C組7581．75±61．60 12．52±1．57 21．54±1．87 FC組7713．13±44．33☆☆21．87±3．17☆☆30．61±3．43☆☆FE組7562．00±48．89§§15．72±3．55☆☆§§28．02±5．78☆☆§§

注：與C組相比較，☆☆表示P<0.01；與FC組相比較，§§表示P<0.01，下同。

表 4 各組大鼠血清脂代謝各指標變化

注：與C組相比較，☆表示P<0.05，☆☆表示P<0.01；與FC組相比較，§表示P<0.05，§§表示P<0.01，。

2.4 肝組織病理學改變

通過肉眼觀察，正常對照組大鼠肝臟組織多呈暗紅色，邊緣銳利，光鏡下如圖1a所示，肝小葉結構清晰,肝條索排列整齊，肝細胞內無脂肪小泡；高脂對照組肉眼觀察肝組織體積增大，邊緣圓鈍，顏色發黃，切面有油膩感，光鏡如圖1b所示，鏡下多見肝細胞腫脹、氣球樣變,胞質內脂滴沉積，肝小葉、肝條索不清晰；高脂運動組肝組織顏色肉眼觀察接近于正常對照組，光鏡下見圖1c，肝小葉、肝條索狀結構尚清晰，少量脂肪空泡,無明顯炎性細胞浸潤。

圖 1 各組大鼠肝組織病理學變化示意圖

2.5 肝組織超微結構的改變

正常對照組大鼠肝組織電鏡顯示核大而圓，居細胞一側，核膜清晰，線粒體、內質網等細胞器密集豐富，膜結構正常，形態良好，線粒體嵴豐富齊整；內質網發達，糖原豐富，溶酶體少見(圖2)。高脂對照組大鼠電鏡下表現為核畸形，核周水腫，線粒體腫脹，嵴部分排列紊亂或消失，細胞內脂滴及空泡樣變數量明顯增多，粗面內質網上核糖體有脫落現象(圖3)。高脂運動組大鼠鏡下可見膜結構正常，胞質內線粒體及內質網較為密集，細胞內可見脂滴及空泡樣變，線粒體內嵴結構較為明顯，有膠原纖維沉積，與高脂對照組相比高脂運動組大鼠核畸形有所減輕，細胞內脂滴及空泡樣變數量較高脂組明顯減少(圖4)。

圖 2 正常對照組大鼠肝臟超微結構示意圖

圖 3 高脂對照組大鼠肝臟超微結構示意圖

圖 4 高脂運動組大鼠肝臟超微結構示意圖

2.6 各組大鼠肝臟線粒體相關基因的變化

表5結果顯示，與C組比較，FC、FE組SREBP1c、SOCS3 mRNA表達水平增加明顯，具有非常顯著性差異(P<0.05)， FE組與FC組相比，SREBP1c、SOCS3 mRNA表達水平降低明顯，差異具有非常顯著性(P<0.05)；與C組相比，FC組PPARα mRNA表達水平有所增加，但差異不具有統計學意義(P>0.05)，FE組組內個體差異較大，與C組相比，PPARα mRNA表達水平差異不明顯(P>0.05)；與C組相比，FC組和FE組PGC1α mRNA表達水平有所下降，但差異不具有統計學意義(P>0.05)。

表 5 各組大鼠肝臟線粒體相關基因mRNA表達變化

3 討論與分析

3.1 高脂飲食和運動對大鼠肝臟質量和血脂代謝的影響

肝臟是人體內最大的代謝器官，在調節糖、脂代謝中起著非常重要的作用。NAFLD的發病機制至今尚不完全明確，有多種假說，其中為多數學者接受的是“多平行打擊學說”和“二次打擊學說”。Tilg等提出了“多平行打擊學說”[21]。該學說強調了一些非常不同的并行過程導致了肝臟炎癥地發生——特別是肝外組織如腸和(或)脂肪組織促進了肝臟炎癥的發生發展，且肝臟炎癥可能先于脂肪肝、肝硬化和肝癌，或者說在一定比例上先于它們發生。Day等第一次將NAFLD和胰島素抵抗(Insulin Resistance，IR)聯系在一起，提出了“二次打擊學說”[11]。其中，第1次打擊先是甘油三酯累積，脂肪變性，系統性IR的結果，第2次打擊被認為是由于甘油三酯的長期累積，導致肝臟氧化應激。這種應激會導致谷胱甘肽和氧化應激之間的不平衡，線粒體功能受損，脂肪酸β氧化功能受損。自由基和脂質過氧化產物導致肝細胞損傷，直接破壞細胞器或細胞膜，導致細胞壞死或凋亡及介導炎癥反應。在此過程中，肝臟持續不斷的慢性損傷將導致肝纖維化、肝硬化和肝癌。后續研究顯示，人體內高胰島素血癥(第1次打擊)確實先于脂肪肝地發展[20]，同時第2次打擊更為精細。除此之外，也出現了很多其他模型，如“四步”理論強調脂質釋放和由于肝靜脈阻塞進一步發展為肝硬化[26]。該模型解釋疾病形態學變化比較有效，相較于其他關于NAFLD的理論更有助于理解。

在NAFLD患者中多存在糖脂代謝紊亂，體重增加的現象，本實驗在造模期間高脂組大鼠體重與正常對照組大鼠體重均出現了持續增長的現像，但增長幅度略有不同，兩組大鼠體重在造模第1周開始出現差異，且差異具有顯著性；在第2、3周體重差異減小，不具統計學意義；第4周開始體重增長差別明顯，差異具有非常顯著性，這種狀態一直持續到造模的最后一周，第8周。通過高脂飲食構建非酒精性脂肪肝大鼠模型時，高脂組大鼠體重與正常對照組相比較會出現明顯增長，體重增長幅度大于正常對照組，提示，高脂飲食可能更易引起機體的脂肪蓄積，這與前人的研究結果一致[1，2]。

飲食誘導的肥胖在實驗動物和人群中普遍存在，肥胖和超重也是NAFLD獲得認可的致病因素。在運動實驗周期結束后，本研究FC組大鼠中TC、TG和LDL-C水平明顯上升，表明高脂飲食在短期內即造成大鼠體內脂質代謝紊亂，為SD大鼠構建非酒精性脂肪肝模型提供可能。同時，游離脂肪酸出現了非常明顯的升高，差異具有非常顯著性，提示，高脂飲食引起大鼠脂質代謝功能障礙，游離脂肪酸不能及時利用和消除，在體內異常蓄積為下一步胰島素抵抗的惡性循環及加重機體的氧化應激等提供了充分可能。本實驗中游離脂肪酸的顯著增加即與第1次打擊相符，脂質代謝障礙使外周脂肪分解速率加快并伴隨有血清游離脂肪酸的增加，不斷增加的FFA被送到肝臟，超過了肝臟正常負荷，正常的合成分解動態平衡被破壞，FFA的脂毒性作用于肝臟，使肝臟的氧化利用能力降低，脂質在肝臟堆積，進而參與脂肪肝地形成。這使得本研究的FC組大鼠肝臟質量明顯高于C組，FE組雖有一定程度的改善，但仍高于C組。同時，FFA的增多也可以作用于第2次打擊，使胰島素抵抗進一步惡化，加重肝細胞的脂肪變性，形成一個惡性循環，最終發展成為脂肪肝。

3.2 高脂飲食和運動對肝細胞線粒體形態結構的影響

游離脂肪酸FFA不僅是細胞代謝的能源物質，并且在機體調節糖脂代謝和IR中是一種重要的介質，起著非常重要的作用。當體內FFA含量增多，超出生理負荷時，就會有大量的FFA從脂肪細胞中溢出，進而引起脂毒性作用。其具體表現為大量的FFA涌入肝臟和肌肉組織，以甘油三酯的形態在肝細胞內異常蓄積。此外，FFA在抑制外周葡萄糖利用的同時刺激肝臟的糖異生，使血漿FFA增多。肝臟脂肪變性會引起脂質過氧化，誘發產生大量的促氧化物的同時伴隨抗氧化物的大量減少，從而促使肝細胞自由基增多，形成一系列的自由基及其代謝產物，如MDA、GSH-PX，4-羥基壬烯酸等，導致肝細胞內蛋白發生交聯，形成Mallory小體等[5,29]。肝細胞是體內代謝比較旺盛的器官之一，線粒體含量極豐富，且線粒體又是脂肪酸氧化利用的主要細胞器。FFA的異常增多可以引起線粒體的活性氧自由基ROS即內源性自由基增加，啟動不飽和脂肪酸氧化，經過一系列的反應形成脂質過氧化物LPO，LPO負反饋于線粒體并改變其DNA從而抑制電子呼吸鏈的傳遞，如此反復，最終導致肝臟脂質過氧化，使肝細胞內的細胞器出現數量減少或結構異常的現象。如肝細胞線粒體數量減少，出現腫脹和通透性增加等結構變化，甚至引起內質網應激進而出現肝細胞脂性凋亡。

本實驗顯示，C組大鼠肝細胞內細胞器含量豐富、核大、居中央，清晰可見大量的內質網且內質網附著核糖體、線粒體，線粒體排列密集，嵴結構清晰。高脂對照組大鼠出現了典型的單個肝細胞內脂肪小泡密集出現，細胞器3 000倍視野下幾乎不可見，高倍鏡下內質網大量減少，同時伴隨核糖體減少或消失，線粒體數量減少，出現結構腫脹，胞內隨處可見增多的溶酶體和脂肪小泡，部分線粒體嵴突大量消失或不見。高脂運動組大鼠線粒體數量和結構有所恢復，內質網、核糖體等結構較高脂對照組也有明顯的改善，溶酶體和脂肪小泡可見。脂肪變化可以引起體內器官產生一些相適應的形態學變化，脂肪在肝臟累積形成脂肪肝、脂肪蓄積引起胰腺形態學變化可以更好的標記胰脂毒性。有研究表明胰腺的脂肪變性通過內鏡超聲可見。有趣的是，引起“脂肪胰腺”的危險因素與脂肪肝的危險因素互相重疊[6，8]，提示存在共同的脂毒性作用、脂質異位沉積、組織中額外脂肪蓄積最終導致組織結構破壞和器官功能障礙。

3.3 高脂飲食和運動對肝臟線粒體相關基因表達的影響

有研究[1]發現，NAFLD與血清瘦素水平關系密切，是脂肪肝發生的獨立危險因素。這與其他學者如Tobe等[22]的發現相同，多元回歸顯示，Leptin是脂肪肝的獨立危險因素。而SOCS3的高表達是瘦素抵抗的標志[4,25]，上調的SOCS3引起肝臟成脂基因SREBP1c的高表達(圖5)，引起脂質在肝臟這一非脂肪組織異常蓄積，進而引起肝細胞、線粒體結構和功能的異常。

圖 5 非酒精性脂肪肝大鼠肝組織脂肪變性的可能機制示意圖

SREBPs是一類位于內質網上的膜連接蛋白，SREBP1c是參與脂肪合成基因的主要調節因子，對正常非脂肪組織脂肪含量的穩定起著至關重要的作用，此過程受Leptin的抑制[3]，SREBP1c主要與脂肪酸代謝和糖代謝有關。若出現瘦素抵抗等瘦素作用缺乏的情況，而胰島素含量增多或作用增加，SREBP1c將會出現過表達，脂肪合成相關的酶水平或活性增加，TG含量增多，造成脂肪在非脂肪組織(如肝臟)的異常蓄積，形成脂肪肝。在肝臟、脂肪組織中SREBP1c/ SREBP1a的比值是9.3，可見，SREBP1c是肝組織固醇調節元件結合蛋白的主要亞型[3]。SREBP1c是肝臟脂質代謝的關鍵調控因子，參與幾乎所有的肝臟TG和脂肪酸合成基因的轉錄。有研究表明[16]，在發生NAFLD時，SREBP1c表達增強，幾乎是對照組的5倍，而SREBP1c轉基因鼠則可自然發生NAFLD。Kakuma等[15]實驗證明，fa/fa肥胖大鼠肝臟、胰腺的SREBP1c表達增加，而用基因沉默技術造成瘦素抵抗的同種大鼠肝臟SREBP1c基因表達顯著降低。在本實驗中，高脂對照組大鼠與正常對照組相比，SREBP1c基因表達量增加8.68倍，與本研究結果類似的研究有Tobe等[23]對IRS2-/-的IR小鼠研究，發現肝臟SREBP1c基因轉錄明顯增加。這一情況在實驗初期血糖水平正常的病程早期也不例外，表明，SREBP1c基因表達增加既不是由高血糖引起，也不是由高胰島素引起。Tobe等[23]的研究中用高瘦素處理小鼠后，小鼠出現了攝食減少和體重減輕，同時SREBP1c基因的過度表達也得到了較好的控制，這一實驗結果與本研究相似。在本實驗的NAFLD大鼠模型中存在一定程度的瘦素抵抗，且由于瘦素抵抗抑制了SREBP1c在肝臟的正常脂質代謝功能，進一步引起肝臟這一非脂肪組織脂肪累積，形成一個惡性循環。FE組大鼠的SREBP1c基因表達出現了明顯的降低，提示可能是通過運動刺激使得大鼠恢復對瘦素的敏感性，進而恢復瘦素對SREBP1c的負調控。

SOCS3升高是瘦素抵抗的標志[4]，Lagathu等[18]研究發現，增多的FFA可通過使SOCS3高表達加重IR。Ueki等[24]在實驗中發現，SOCS3參與NAFLD的發生，不僅是由于SOCS3作用于胰島素信號通路，從而導致脂質代謝紊亂，SOCS3還可上調SREBP1c的表達，使肝臟這一非脂肪組織的脂肪蓄積異常。在本實驗(圖5)和此前的研究中發現[1]，瘦素抵抗可能是NAFLD獨立的發病危險因素，這一點在實驗中依然存在，SOCS3的高表達標志著瘦素抵抗的存在，FC組SOCS3 mRNA基因的表達是C組的6倍多，FC組存在明顯的瘦素水平升高。這說明，NAFLD進程中存在的高瘦素水平，且SOCS3水平的增加也從另一面證實了其中存在的瘦素抵抗。SOCS3的高表達可以使STAT下調，同時STAT是抑制SREBP1c啟動活性的分子，SOCS3水平的升高促使SREBP1c mRNA表達量增加，從而啟動一系列脂肪酶的活性，從而使脂肪酸合成增多。而FE組大鼠通過運動刺激明顯減輕了瘦素抵抗現象，使得肝臟超微結構中線粒體的數量和功能有了較明顯地恢復。

過氧化物酶體增殖劑激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs)屬于核受體家族中配體激活的轉錄因子，有3種亞型，與脂質代謝、葡萄糖代謝、脂蛋白代謝、細胞增殖等關系密切。PPARα主要在肝臟中表達，參與調節脂肪酸氧化的幾種關鍵酶的表達，通過誘導線粒體和過氧化物酶體氧化水平及相關基因表達來刺激脂肪代謝，保護肝臟，避免肝細胞脂肪變性。PGC1α屬于轉錄輔助活化因子家族，也是脂肪細胞分化的重要調節因子，PGC1α在肝臟中的主要作用是促進肝糖異生、調節肝細胞脂肪代謝。PPARα與PGC1α的共同作用是PGC1α調節肝細胞脂肪酸氧化的重要途徑。在饑餓、寒冷或禁食狀態下，PGC1α能激活肝臟脂肪酸氧化中PPARα目標基因的表達，PGC1α基因沉默小鼠肝臟脂肪酸氧化率降低，引起肝細胞脂肪變性，PGC1α-/-小鼠參與氧化的PPARα基因沒有下調，而肝細胞線粒體功能下降。這提示，可能是由于線粒體功能下調而引起PGC1α-/-小鼠出現脂肪酸氧化率降低。PGC1α可與SREBP競爭HNF4α結合位點，干擾PGC1α的募集，從而抑制糖異生[28]。PGC1α是PPAR的輔助激活因子，協同PPARα作用于肝臟的脂質代謝、與脂質運動功能相關蛋白的調節，在生理狀態下保護肝臟，防止肝細胞出現脂肪變性。本實驗顯示，FC組大鼠均出現了PPARα mRNA基因表達的上升，可能是由于肝臟中肝細胞的脂肪變性引起了PPARα mRNA基因表達的升高，以求肝臟能夠盡可能的將多余的脂肪酸氧化利用，同時伴隨出現了PGC1α mRNA基因表達水平的下調。由前面的肝臟超微結構觀察可得出肝細胞脂肪變性，引起了肝細胞內線粒體功能障礙，線粒體數目和活性均受到影響，進而引起PGC1αmRNA基因表達的下調。由于PGC1α mRNA基因表達的下調在一定程度上也影響了PPARα的表達，引起肝細胞脂肪酸氧化障礙，加重NAFLD中存在的肝細胞脂肪變性。而運動在很大程度上使PGC1α得以恢復，PGC1α協同PPARα作用于肝臟，促進肝糖異生、肝細胞脂肪代謝，使肝細胞線粒體的形態、結構和功能趨于正常。

4 結論

1.16周高脂飲食NAFLD大鼠肝臟出現了明顯的肝臟脂質異常蓄積，肝組織結構紊亂，肝細胞內線粒體數量減少、結構畸形。

2.規律的、強度適宜的有氧運動可明顯改善NAFLD大鼠中存在的脂質代謝紊亂，可能通過促進肝臟細胞內線粒體的數量、形態結構、功能趨于正常，從而減少肝臟這一非脂肪組織的脂肪蓄積，減輕肝臟脂肪變性程度，促進非酒精性脂肪肝的良性轉歸。

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Impact of Aerobic Exercise on the Function and Mitochondrial Structure of Liver Cell in NAFLD Rats

LIU Qian-qian1,QIN Zhi2,HOU Gai-xia1,XI Xue-feng1,XIAO Guo-qiang3

Objective:To observe the effects of eight weeks of swim-training on the abnormal accumulation of liver lipid,disorders of function and mitochondrial structure in NAFLD rats.Methods:Dividing 35 rats (3 month old) SPF male SD rats into normal control group (C group,9 rats,fed with standard diet) and high fat diet group (26 rats at random,fed with high fat diet to build the NAFLD model).Dividing the high fat diet group into high fat control group (FC,13 rats) and high fat exercise-training group (FE,13 rats) at random.The exercise training groups had an 8 weeks swimming training (6 days in one week).After the training,measuring liver index and serum lipid levels,using microscope to measure liver steatosis,observing the structure and number changes of liver cell mitochondria by electron microscope.Detecting the mRNA levels of SOCS3,SREBP1c,PPARα,PGC-1α by ORT-PCR.Results:Compared with the C group,body weight,liver weight,liver fat,TC,FFA,SREBP1c,the expressions of SOCS3 mRNA in FC group significantly increased (P<0.01 orP<0.05),HDL-c reduced (P<0.05);compared with the FC group,body weight,liver weight,liver index,TC,FFA,SREBP1c,and the expressions of SOCS3 mRNA in FE group significantly decreased (P<0.01 orP<0.05).The microscopic structure showed that in C group,hepatic lobular had clear structure,the hepatic cord arranged orderly,the liver cells had no fat vacuoles,mitochondrial cristae was rich and well-organized;in FC group,hepatic lobule structure disappeared,with nucleus abnormal,perinuclear edema,and mitochondria swelling,cristae was disappear or arranged chaos,the number of intracellular lipid droplets and changed vacuolar significantly increased;in FE group,hepatic lobular and hepatic cord had clear structure,membrane structure was normal,mitochondria and endoplasmic reticulum were relatively dense,intracellular lipid droplets and vacuolar degeneration appeared,mitochondrial cristae structure was relatively obvious.Conclusion:1) after 16 weeks’ high fat diet,the NAFLD rats’ liver had obviously abnormal accumulation of liver lipid,with disorder of liver structure,the number of mitochondria in liver cells decreased,with mitochondria’s structural abnormalities;2) Regular and appropriate intensity aerobic exercise can significantly improve lipid metabolic disorder in NAFLD rats,which probably promoting mitochondria number,morphology,structure and function of liver cell to be normal,then reducing fat accumulation in the liver,relieving liver fatty degeneration,and promoting the benign outcome of non alcoholic fatty liver.Key words：NAFLD;fat-freemass;livercell;mitochondrialstructure;adiposedegeneration;rat

1002-9826(2016)05-0075-08

10.16470/j.csst.201605011

2015-04-28；

2016-07-05

河南省教育廳人文社會科學研究項目(2016-QN-178)。

劉倩倩(1986-)，女，山東聊城人，講師，博士，主要研究方向為慢性病的運動防治、運動負荷的生物學適應， E-mail：wwwstrom@sina.com。

1.河南大學 體育學院，河南 開封 475001；2.武漢體育學院，湖北 武漢 430079；3.華南師范大學，廣東 廣州 510006 1.Henan University,Kaifeng 475001,China.2.Wuhan Sports University,Wuhan 430079,China.3.South China Normal University,Guangzhou 510006,China.

G804.2

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