冬凌草1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因克隆與表達分析

朱畇昊， 蘇秀紅， 董誠明*， 陳隨清， 邵遠洋， 張風波

( 1. 河南中醫藥大學 藥學院， 鄭州 450006; 2. 河南中醫藥大學 呼吸疾病診療與新藥研發河南省協同創新中心， 鄭州 450046 )

冬凌草1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因克隆與表達分析

朱畇昊1,2， 蘇秀紅1,2， 董誠明1,2*， 陳隨清1,2， 邵遠洋1， 張風波1

( 1. 河南中醫藥大學 藥學院， 鄭州 450006; 2. 河南中醫藥大學 呼吸疾病診療與新藥研發河南省協同創新中心， 鄭州 450046 )

1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase, DXS)是植物萜類代謝通路中2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)途徑的第一個關鍵酶，在植物萜類物質的生物合成中發揮重要的作用。為了研究該基因在冬凌草二萜類成分合成中的作用，該研究在冬凌草轉錄組測序結果的基礎上設計一對特異性引物，采用RT-PCR方法得到冬凌草IrDXS基因cDNA全長序列，并對其蛋白進行理化性質分析、信號肽預測、亞細胞定位預測、蛋白質二級結構、三級結構預測分析及跨膜域分析等生物信息學分析，同時利用實時熒光定量PCR的方法檢測IrDXS基因在冬凌草不同部位中的表達情況。結果表明：從冬凌草葉片中分離得到了一條編碼DXS的全長基因，通過生物信息學軟件分析發現，該基因編碼全長2 169 bp，編碼722個氨基酸，分子量為77.7 kD。多序列比對發現該基因編碼的蛋白和其他植物中已知的DXS蛋白序列具有較高的同源性，N端均包含了一段質體轉運肽序列，并均具有一個保守的焦磷酸硫胺素結構域和與吡啶結合相關的DRAG結構域。序列進化樹分析顯示，IrDXS基因屬于植物DXS2家族。DXS基因在冬凌草根中表達量最高、愈傷組織中最低。該研究首次獲得了IrDXS基因的全長cDNA 序列，并揭示了其在不同組織中的表達差異，為后續的深入研究IrDXS基因在冬凌草二萜類成分合成途徑中的功能奠定了基礎。

冬凌草，DXS基因， 生物信息學分析， 熒光定量PCR， 二萜

冬凌草(Isodonrubescens)，是唇形科香茶菜屬植物碎米椏，主產于河南省太行山區，其味甘苦、性微寒，具有清熱解表、消炎止痛、健胃活血及抗腫瘤等作用。冬凌草發揮抗腫瘤作用的藥效物質基礎主要是貝殼杉烯類二萜成分，迄今已分離得到190余種二萜類化合物(馮衛生等, 2008)，其中代表性成分冬凌草甲素、乙素等含量較為豐富。冬凌草甲素可明顯抑制人宮頸癌、肝癌等多種腫瘤細胞的生長(Bao et al, 2014; Li et al, 2014)。甲羥戊酸(MVA)途徑和2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)途徑共同生成植物萜類次生代謝產物的前體物質IPP和DMAPP。1-脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)作為MEP途徑的第一個酶, 也在該途徑的合成中發揮重要的調控作用，是萜類化合物合成過程的關鍵調控位點(陳建和趙德剛, 2004)。

DXS基因的表達與類胡蘿卜素、赤霉素等萜類物質合成有密切的關系，DXS基因的過量表達可促進植物體內萜類物質合成(Estevez et al, 2001)。植物DXS基因N端具有典型的質體轉運肽序列，決定了DXS定位與質體的基本性質。魚腥草(魏麟等, 2014)、陽春砂(曾春紅等, 2011)、番茄(Lois et al, 2000; Rodriguez et al, 2001)等植物中已經成功克隆了DXS基因序列，而冬凌草MEP途徑中相關基因的克隆尚未見報道。本研究首次從冬凌草葉片中克隆得到DXS基因，并對其序列進行生物信息學分析，檢測其在不同組織器官中的差異表達，為深入開展該基因的酶學特性及其在冬凌草二萜類成分生物合成中的分子機制研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

所用材料冬凌草組培苗、愈傷組織由本實驗室繼代保存，經董誠明教授鑒定為碎米椏(Isodonrubescens)，取樣時摘取冬凌草的根、莖、葉等不同組織，用液氮速凍后凍存于-80 ℃冰箱備用。

RNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司，pMD19-T 載體、DH5α感受態購自TaKaRa公司。反轉錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自Fermentas公司。QuantiNova SYBR Green PCR Master Mix購自QIAGEN公司。

1.2 總RNA 提取與單鏈cDNA 的合成

冬凌草不同組織RNA的提取依照試劑盒說明書進行，RNA的完整性使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。cDNA第一鏈合成根據RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit說明書進行，反轉錄cDNA凍存于-20 ℃保存備用。

1.3 cDNA全長克隆

以丹參(ACQ66107)DXS基因序列作為探針，對冬凌草轉錄組數據進行本地BLAST分析，并選取相似性最高的冬凌草DXS基因。使用Primer Premier 5軟件從開放閱讀框(ORF)兩端非編碼區設計一對特異性引物，DXS-F ：5′-GCACCGAACAACTACTTC -3′； DXS-R ：5′-GTTTCAGAGGAGCATATCTTT -3′。 以冬凌草葉片的cDNA 為模板， 以DXS-F，DXS-R為引物進行PCR擴增。擴增條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸120 s，反應35個循環；循環結束后72 ℃延伸10 min。PCR產物切膠回收純化，回收產物克隆至pMD19-T載體中，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，通過菌落PCR鑒定陽性克隆并送至上海生工進行測序。

1.4 生物信息學分析

用EditSeq軟件進行序列分析與拼接，用在線ORF Finder軟件查找開放閱讀框。用DNAMAN軟件進行同源性比較分析。用ClustalW 軟件與其他植物DXS蛋白的氨基酸序列進行比較后，用MEGA 4 軟件的相鄰連接法(neighbor-joining)和泊松模型(poission model)構建系統進化樹，bootstrap檢驗的重復次數為1 000次。IrDXS蛋白理化性質分析采用ProtParam在線工具進行，利用ProtScale對IrDXS蛋白進行親疏水性分析，采用TMHMM Server. v. 2.0程序對IrDXS蛋白進行跨膜區結構預測，用SignlP 4.1 Server對IrDXS蛋白進行信號肽預測，用在線分析工具ChloroP 對IrDXS蛋白進行亞細胞定位分析，用NPSA server進行IrDXS氨基酸序列二級結構分析和預測，用SWISS-MODEL在線程序對IrDXS蛋白進行三級結構同源建模。

1.5 熒光定量 PCR表達分析

實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qPCR)用來檢測IrDXS基因在冬凌草根、莖、葉、花、愈傷等不同組織中的相對表達量。qPCR采用美國Applied Biosystems公司Step One Plus檢測系統。qPCR 檢測的反應體系如下：10 μL 2x QuantiNova SYBR Green PCR Master Mix(QIAGEN)，正反向引物各0.4 μL，cDNA 模板2 μL；加ddH2O 至20 μL，反應程序為95 ℃、3 min，95 ℃、10 s，56 ℃、20 s，72 ℃、30 s，35 個循環；上游引物qDXS-F序列為5′-GCACCGAACAACTACTTC-3′，下游引物 qDXS-R 序列為5′-GTTTCAGAGCATATCTTC-3′。qPCR反應以冬凌草GAPDH基因為內參， IrGAPDH 引物為 qGAPDH-F：5′-AAACGCCTAACTTC GCATCT-3′ 和qGAPDH -R ： 5′-CCCGACTGTCCCTGTAATCA-3′，每個反應重復3 次。擴增完成后利用PCR 儀自帶的程序進行溶解曲線測定，采用2-ΔΔCt法對IrDXS進行表達量分析。

2 結果與分析

2.1 IrDXS的cDNA 全長克隆

以冬凌草葉片反轉錄所得到的cDNA第一鏈為模板，用特異性引物 DXS-F 和 DXS-R 進行 PCR 擴增。瓊脂糖凝膠電泳檢測發現在2 400 bp左右處有一條亮帶，與目的片段大小相似(圖1)。將PCR產物克隆至pMD19-T載體后雙向測序，系列拼接后經比對發現，目的序列與轉錄組測序序列一致。經ORF Finder 預測，該序列含有一個大小為2 169 bp的完整的開放閱讀框，推測其編碼722個氨基酸，開放閱讀框位于89～2 257 bp區域，序列的1～88 bp為5′非編碼框，2 258～2 348 bp為3′非編碼框。

圖 1 IrDXS的PCR產物Fig. 1 PCR products of IrDXS

通過BLAST 程序檢索，該序列與丹參(Salviamiltiorrhiza，ACQ66107)、薄荷(Mentha×piperita，AAC335130)、金魚草(Antirrhinummajus，AAW28999)等植物DXS 蛋白序列的同源性分別為90%、90%、87%。由此確定，該序列為冬凌草DXS基因的cDNA 全長序列，將其命名為IrDXS( 注冊號KT831764)。

從GenBank中選取丹參(ACQ66107)、薄荷(AAC335130)、蓖麻(XP_002516843.1)、葡萄(XP_002277919.1)3種DXS蛋白與冬凌草IrDXS的氨基酸序列利用DNAman軟件進行多序列比對。由圖2可知，IrDXS蛋白和其他植物DXS蛋白一樣，均具有一個保守的焦磷酸硫胺素結構域，該結構以高度保守的-GDG-殘基開始，以-LNDN-殘基結束；IrDXS蛋白還具有一段保守的吡啶結合相關的DRAG結構域。不同植物中DXS蛋白的C末端序列較N末端序列保守。植物DXS蛋白N端包含了一段質體轉運肽序列，該段序列保守性較差，但仍具備質體轉運肽的一般特征，即富含羥基化的絲氨酸和蘇氨酸，缺乏天冬氨酸和谷氨酸等酸性的氨基酸。利用在線ChloroP 軟件對IrDXS蛋白的定位進行分析，結果表明IrDXS蛋白N端具有一段64個氨基酸的質體轉運肽序列。

2.2 IrDXS基因編碼蛋白質序列分析

2.2.1 IrDXS蛋白特性分析 利用ExPASy在線軟件程序的ProtParam工具對DXS蛋白基本理化性質進行分析。IrDXS基因總共編碼了722個氨基酸，理論分子量為77 691.9，等電點為6.71，原分子組成為C3433H5477N959O1032S31,總原子數為10 932，帶正電的氨基酸有73個(Arg+Lys)，帶負電的氨基酸有77個(Asp+Glu)，不穩定系數是35.87，推測其為穩定蛋白。

圖 2 DXS蛋白的多序列比對 實線部分序列表示焦磷酸硫胺素結合位點； 虛線部分表示與吡啶結合相關的DRAG結構域；箭頭標示序列為DXS蛋白轉酮酶活性的保守的谷氨酸殘基； 五星標示序列為DXS催化作用的組氨酸殘基。Fig. 2 Alignment of deduced amino acid sequences of DXS The full line marks the thiamin diphosphate-binding site and the pyridine binding DRAG domain is indicated by the dash line; the invariant Glu residue thought to be specific for transketolase activity is indicated by the arrowhead; the histidine residue for DXS catalysis is marked by a star.

運用TMHMM Server. v. 2.0程序 對IrDXS 蛋白的跨膜結構域進行預測，結果表明該蛋白不存在跨膜區。利用ProtScale工具，計算IrDXS蛋白質的親疏水性，結果表明其親水性氨基酸分布多于疏水性氨基酸。結合ProtParam程序預測的總平均親水性為-0.749。因此，可推測冬凌草IrDXS蛋白是親水性蛋白。SignalP 程序預測IrDXS蛋白不具有信號肽。

2.2.2 IrDXS 蛋白二級結構、三級結構的預測 利用NPSA在線生物學工具對IrDXS蛋白進行二級結構預測。結果表明IrDXS蛋白包含38.23%的α-螺旋、18.84%的延伸鏈、11.08%的β-轉角和31.86%不規則卷曲。冬凌草IrDXS二級結構中最多的結構元件為α-螺旋，其以不規則卷曲散布于整個肽鏈中。使用SWISS-MODEL程序對IrDXS蛋白進行三級結構同源模建。在PDB蛋白質數據庫中選擇與IrDXS序列一致性最高(46.66%)的2o1s.1.A蛋白為模板進行同源模建，得到IrDXS 結構模型(圖3) 。

圖 3 IrDXS蛋白三級結構預測Fig. 3 Prediction on tertiary structure of IrDXS

圖 4 IrDXS蛋白與其他物種DXS蛋白的系統進化樹分析 節點上的數值為通過bootstrap檢驗次數的百分數。Fig. 4 Phylogenetic tree of IrDXS protein and DXS proteins from other species Bootstrap values of the nodes represent the percentage drawn from the bootstrap test. LaDXS, Lavandula angustifolia(AGQ04154)； SmDXS, Salvia miltiorrhiza(ACQ66107)； MpDXS, Mentha × piperita(AAC335130)； SiDXS, Sesamum indicum(XP_011069878)； AmDXS, Antirrhinum majus(AAW28999)； CmDXS, Cucumis melo(XP_008453643.1)； CsDXS, Cucumis sativus(XP_004146353.2)； GmDXS, Glycine max(XP_003550669.1)； OsDXS, Oryza sativa Japonica Group (NP_001059086.1)； ZmDXS, Zea mays(NP_001295426.1)； ApDXS, Andrographis paniculata(AAP14353.1)； CrDXS, Catharanthus roseus(AGL40532.1)； RcDXS, Ricinus communis(XP_002516843.1)； VvDXS, Vitis vinifera(XP_002277919.1)； SmDXS, Solanum lycopersicum(CAZ66648.1)； Lrdxs, Lycium ruthenicum(AIX87515.1)； CsDXS, Cucumis sativus (XP_004144970.1)； PxDXS, Plutella xylostella(XP_011567215.1)； BtDXS, Bos taurus(XP_001257222.4)； BtDXS, Bacillus thuringiensis(EEM94364.1)； BcDXS, Bacillus cereus Rock1-15(EEL27081.1)； BlDXS, Bacillus licheniformis(KFM90532.1)； BbDXS, Babesia bovis(AHA41836.1)； PvDXS, Plasmodium vinckei petteri(EUD71692.1).

白修飾的研究提供了參考位點。利用NetPhos 2.0 在線磷酸化位點分析工具對IrDXS蛋白進行預測，分析結果表明整個多肽鏈存在有30個氨基酸磷酸化位點(>0.5)，其中Serine(絲氨酸)19個，Threonine(蘇氨酸)6個， Tyrosine(酪氨酸)5個。在這30個磷酸化位點中，絲氨酸的磷酸位點最多。

2.2.4 IrDXS系統進化分析 從GenBank中選取薰衣草(Lavandulaangustifolia)、丹參(Salviamiltiorrhiza)、薄荷(Mentha×piperita)、胡麻(Sesamumindicum)等15種植物；蠟樣芽孢桿菌(BacilluscereusRock1-15)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)2種細菌；牛巴貝斯蟲(Babesiabovis)、瘧原蟲(Plasmodium)2種原生生物；牛(Bostaurus)、小菜蛾(Plutellaxylostella)2種動物DXS基因氨基酸序列，用ClustalW 軟件對序列進行比對后，使用MEGA 4 軟件的鄰接法(neighbor-joining)系統進化樹，bootstrap檢驗的重復次數為1 000次(圖4)。進化樹分為4個大的分枝，動物、植物、原生生物、細菌各一支。從圖4可以看出，DXS基因植物中可以分為兩個家族，其中冬凌草IrDXS屬于Class 2家族，與同科的丹參、薄荷等親緣關系較近。

2.3 IrDXS組織特異性表達分析

選取冬凌草的根、莖、葉、花和愈傷組織作為材料，利用實時熒光定量PCR分析IrDXS表達的組織特異性。圖5結果表明，IrDXS在愈傷組織中的轉錄水平最低，在莖和花中的轉錄水平較低，而在根和葉中的轉錄水平最高。

圖 5 冬凌草不同組織中IrDXS基因的相對表達量Fig. 5 Relavive expression of IrDXS in different tissues from Isodon rubescens

3 討論與結論

萜類是一類廣泛存在于植物體內的化學物質，其以異戊二烯(Isoprene)為骨架。植物萜類骨架的生物合成主要通過甲羥戊酸途徑(MVA)和2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸途徑(MEP)完成，不同的途徑均需要大量的不同功能的酶參與復雜的酶促反應。DXS是MEP途徑的第1個關鍵酶，其可將丙酮酸和3-磷酸-甘油醛縮合生成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸(Estevez et al, 2001)。Estevez et al(2000)發現，在擬南芥中過表達DXS基因，轉基因擬南芥表現出胡蘿卜素、維生素E、脫落酸和赤霉素等萜類物質含量顯著上升的趨勢。在番茄和油棕果實中，萜類物質類胡蘿卜素含量與DXS基因表達的表達量一致。(Khemvong, 2005; Rodriguez et al, 2001)。將擬南芥DXS基因在寬葉薰衣草中過量表達發現，其葉片和花中單萜及倍半萜類揮發油含量大幅提高。(Munoz et al, 2006)。上述研究表明, DXS在MEP途徑中的關鍵酶，萜類成分積累的多寡與其表達量的高低，活性的有無有著直接的關系。目前，DXS基因已在多種植物中成功克隆，而冬凌草中DXS基因的研究卻未見報道。本研究根據測序得到的冬凌草轉錄組數據庫, 成功從冬凌草葉片中克隆了一個DXS基因的全長cDNA (IrDXS)，并對其進行生物信息學分析。結果表明冬凌草IrDXS和其他同源的不同植物DXS基因序列具有較高的相似性，且均具有轉酮酶和DXP合成酶的3個保守結構域。

MEP途徑相關酶均存在于質體中，因此該途徑所包含的酶系是否具有質體的導向性是其酶活力的重要評判標準。Zhang et al利用綠色熒光蛋白(GFP)作為報道基因，將大豆GmDXS基因與GFP基因共表達，熒光顯微鏡觀察發現，GmDXS定位于葉綠體中。Krushkal et al(2003)對DXS進行亞細胞定位發現其在質體的類囊體中表達。本研究發現，冬凌草IrDXS基因N端存在一段30個氨基酸殘基的質體轉運肽序列，意味著該蛋白雖由核基因編碼但卻定位于質體。

不同物種中DXS蛋白被數目不同的基因所編碼，大多生物體內存在2個或2個以上DXS基因家族成員(Krushkal et al, 2003)。在植物中，共有兩類 DXS 家族成員，分別編碼 2 種不同類型的 DXS蛋白，可能在萜類物質的生物合成中發揮不同功能(程波等, 2015)。本研究選擇冬凌草IrDXS氨基酸序列及其他在GenBank中已登錄的全長DXS蛋白氨基酸序列進行系統進化分析，結果表明植物DXS基因能很好地和來自細菌、動物、原生生物的DXS基因區別開來，而植物DXS基因分為兩支，IrDXS屬于植物Class 2家族，且與來源于同科植物丹參等的DXS基因親緣關系較近。DXS基因的表達具有組織器官特異性，且不同家族DXS基因表達趨勢也有不同。屬于植物Class 1家族的擬南芥DXS1(CLA1)在葉片等光合組織和根等非光合組織中均廣泛表達, 尤其在幼苗和芽等幼嫩組織中的表達較強。大豆GmDXS1在葉片、莖、種子等組織表達量較高，而在根中則不表達。通過對屬于植物Class 2家族的IrDXS進行組織特異性表達分析發現，其表達模式與不同家族的DXS基因有一定差異，IrDXS在冬凌草根和葉中表達量較高，而莖、花和愈傷組織中表達量較低，推測可能與冬凌草中萜類成分的分布有關。

本研究克隆所得IrDXS可能只是冬凌草DXS基因家族中的一個成員，而冬凌草中是否存在植物class 1家族的DXS基因，不同家族的DXS基因在冬凌草萜類代謝中所起到的作用還有待進一步的研究。

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Cloning and expression analysis of 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase gene inIsodonrubescens

ZHU Yun-Hao1,2， SU Xiu-Hong1,2， DONG Cheng-Ming1,2*， CHEN Sui-Qing1,2，SHAO Yuan-Yang1， ZHANG Feng-Bo1

( 1. School of Pharmacy, Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China; 2. Collaborative InnovationCenterforRespiratoryDiseaseDiagnosisandTreatment&ChineseMedicineDevelopmentofHenanProvince,HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine, Zhengzhou 450046, China )

1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase (DXS) catalyses the first committed step of the 2C-methyl-D-erythritol-4-phosphate (MEP) pathway, and its expression level affects the contents of terpenoid. This study was aimed to clone the 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase(DXS)gene fromIsodonrubescensand analyze the bioinformatics and expression of the gene．The primers were designed according to the transcript sequence ofIrDXSfromI.rubescenstranscriptome database. The physical and chemical characteristics, signal peptide, subcellular localization, secondary structure ofIrDXSprotein were analyzed and predicted by the tools of bioinformatics. In this work, a DXS cDNA (IrDXS, KT831764) was isolated fromI.rubescens. The full-length cDNA of IrDXS encoded 722 amino acid residues with a predicted molecular mass of 77.7 KD. Sequence alignment showed thatIrDXShad high homology to known DXS proteins from other plant species and contained the conserved N-terminal plastid transit peptide, the N-terminal thiamine binding domain and pyridine binding DRAG domain. Phylogenetic analysis indicated thatIrDXSbelonged to the plant DXS2 cluster. Quantitative real-time PCR analysis showed that the expression ofIrDXSwas tissue-specific, and accumulation of transcripts was greater in roots and leaves. This study provides valuable information for future experiments on the molecular mechanisms underlying the isoprenoid biosynthesis inI.rubescens.

Isodonrubescens， 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase， bioinformatic analysis， qPCR， diterpene

10.11931/guihaia.gxzw201511015

2015-11-10

2016-03-23

國家自然科學基金(81173486)；河南中醫學院創新人才項目(2011XCXRC02)；河南省高等學校青年骨干教師計劃項目(2011GGJS-089) [Supported by the National Natural Science Foundation of China (81173486); Foundation for University Key Teachers in Henan Province(2011GGJS-089); Innovative Talents of Henan University of Traditional Chinese Medicine (2011XCXRC02)]。

朱畇昊(1986-)，男，河南鄭州人，博士，講師， 從事藥用植物分子生物學研究，(E-mail)guxinhan123@163.com。

*通訊作者： 董誠明，教授，從事藥用植物規范化種植研究，(E-mail)dcm371@sohu.corn。

Q943.2

A

1000-3142(2016)12-1476-07

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