頑拗性三七種子后熟過程超微結構和抗氧化酶變化

楊 凱， 李 磊， 龍光強， 孟珍貴， 李龍根， 陳軍文*

( 1. 云南農業大學 云南省優勢中藥材規范化種植工程研究中心， 昆明 650201；2. 云南農業大學 農學與生物技術學院， 昆明 650201 )

頑拗性三七種子后熟過程超微結構和抗氧化酶變化

楊 凱1,2， 李 磊1,2， 龍光強1， 孟珍貴1， 李龍根1， 陳軍文1,2*

( 1. 云南農業大學 云南省優勢中藥材規范化種植工程研究中心， 昆明 650201；2. 云南農業大學 農學與生物技術學院， 昆明 650201 )

該研究以3年生三七成熟種子為材料，通過對三七種子種胚切片觀察、抗氧化酶活性測定及相關基因表達量的變化分析，從生理、形態及轉錄組3個層面了解頑拗性三七種子的內在機理。結果表明：三七種子后熟0～40 d，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)和谷胱甘肽還原酶(GR)的活性先升高后降低，過氧化物酶(POD)的活性升高。后熟40 d時SOD、POD、CAT、APX相關差異表達基因的FPKM值分別為28、13、356、105，皆處于較高水平，此時觀察到完整的細胞結構，種胚完成形態成熟，丙二醛(MDA)含量達到了最高值，說明三七種子內部抗氧化系統抵御氧化傷害最激烈，對水分脅迫造成的氧化傷害最為敏感。伴隨后熟時間的延長，膜脂過氧化作用加劇造成細胞膜的降解，導致細胞功能喪失和畸形死亡，抗氧化系統酶活性降低不能有效抵御氧化傷害可能是導致頑拗性三七種子脫水敏感的重要原因之一。

三七， 后熟作用， 脫水敏感性， 超微結構， 抗氧化系統

三七(Panax notoginseng)為五加科(Araliaceae)人參屬多年生草本植物，是我國特有的名貴中藥材，有“南國神草”的美譽。三七主產地和地道產區為云南省文山州，種植面積和產量均占全國的比例在90%以上。三七含有多種皂苷、氨基酸、多糖和黃酮等生理活性物質(張銘，2003)，其根、莖、花均可入藥，具有散瘀止血、消腫止痛、降脂、降血糖、提高機體免疫力和抗心肌缺血等功效(付建華等，2006)。三七作為具有確切的預防、醫療和保健功能的天然藥物，在藥品、保健品、功能食品領域具有巨大的開發潛力和市場前景。

頑拗性種子是指在成熟過程中不發生脫水行為，種子在成熟脫落時仍然保持著較高的含水量(Smith&Berjak，1995)，在整個生長發育過程對脫水和低溫敏感(Pammenter&Berjak，1999)。目前國內外對種子休眠及種子脫水耐性的分子機理尚不十分明確(李曉琳等，2011)，研究表明種子超微結構及其代謝活性變化與種子在生長發育過程中脫水耐性的獲得有著密切的聯系(Farrantetal，1997)。頑拗性種子在脫水過程中，種子內部發生水介導的氧化傷害，即種子含水量處于中等水平時，其內部將會發生一種不受控制的氧化反應，可對種子造成脫水傷害(Leprinceetal，1996)。種子內部存在的抗氧化防御系統，可以對抗種子劣變過程中所產生的超氧陰離子自由基，酶促防御系統和非酶促防御系統共同構成抗氧化系統，前者包括SOD(超氧化物歧化酶)、POD(過氧化物酶)及CAT(過氧化氫酶)等(Cakmaketal，1993)。當抗氧化系統酶活性下降時，種子就會發生氧化脅迫傷害。因此，在脫水過程中酶促防御系統未能對膜脂過氧化事件進行有效的抵御也可能是頑拗性種子脫水敏感性的重要原因。三七種子在成熟采收后保持著較高的含水量，在后熟過程中伴隨著一定程度水分的喪失。

種子繁殖是三七農業生產上應用最為廣泛的繁殖方式，然而三七種子為典型的頑拗性種子，對脫水和低溫高度敏感(李磊等，2014)，種子在完成形態成熟時含水量約為67.3%，此時種胚尚未完全分化，需經過60～100d的后熟期才能開始萌發，屬生理休眠類型(安娜，2006)。由于三七種子的典型頑拗性，嚴重阻礙著三七種子的貯藏保存。本文在前人研究的基礎上，對后熟不同時期的三七種子進行種胚切片觀察、抗氧化系統酶活性及相關基因表達量的變化分析，試圖從解剖學、生理學和分子生物學層面探討三七種子脫水敏感性的原因。

1 材料與方法

1.1 供試材料

三七(Panax notoginseng)種子采自于云南省文山州的文山市苗鄉三七實業有限公司苗鄉三七科技公司的試驗基地。試驗基地位于文山州硯山縣盤龍鄉。

1.2 實驗設計

選擇成熟、飽滿的3年生植株的種子，人工搓去果皮，用5%CuSO4浸泡消毒，將種子沖洗干凈，用濾紙吸干表面水分后與經高溫消毒后的濕沙按1∶5層積保存。自2014年11月19日，以每10d的間隔進行取樣，分別進行種子超微結構觀察及抗氧化系統酶生理指標的測定；部分種子液氮凍存，備用于轉錄組測序。

1.3 實驗方法

1.3.1 超微結構觀察 超微結構觀察實驗前期樣品處理方法參照(Wenetal，2009)的方法，并稍作修改。將處于不同后熟階段的種子去掉種皮，切去種胚生長部位1cm3左右樣品，放入含2.5 % 戊二醛的0.2mol·L-1磷酸緩沖液(pH7.2)中，4 ℃下固定24h后經2%的鋨酸固定3h，用50%、70%、80%、90%乙醇梯度脫水各15min，再用100%乙醇脫水3次，每次30min，Epon812環氧樹脂包埋。用LKB-v型超薄切片機切片，切片經醋酸鈾和檸檬酸鉛染色后，在透射電子顯微鏡下觀察拍照。選取不同后熟期最清晰的電鏡圖，使用標尺計算細胞器的大小。

1.3.3 與抗氧化系統相關差異表達基因篩選 通過IlluminaHiseqTM2500測序技術獲得三七種子4個后熟時期(0、20、40、60d)的轉錄本信息，并篩選出與抗氧化系統酶相關的基因，用FPKM(每百萬fragments中來自某一基因每千堿基長度的fragments數目)來估算不同后熟期的基因表達水平(Trapnelletal，2010)。

1.4 數據統計分析

不同后熟時期抗氧化酶活性及氧化產物含量和抗氧化酶相關基因的FPKM值使用SPSS17.0單因素方差分析和Duncan多重比較方法進行顯著性差異分析，P值≤0.05時視為差異顯著。試驗獨立重復3次(n=3)。

2 結果與分析

2.1 超微結構觀察

三七種子后熟過程中，經透射電子顯微鏡觀察后所得到的超微結構的變化情況如圖1所示。剛成熟的三七種子細胞整齊飽滿，中央大液泡發達，細胞壁內側緊密排列著大量形狀大小相對統一的橢圓形黑色脂質體，脂質體長軸的長度一般約為0.1nm(圖1：a)。層積保存20d時，細胞壁明顯增厚，厚度約為初始時期的2倍，脂質體排列間隔變大，顏色變為半透明(圖1：b)。層積保存30d時觀察到了明顯的液泡，脂質體大小不一分散在細胞內，并且首次觀察到了淀粉體，淀粉體長約2.3μm，寬約1.36μm(圖1：c)。層積保存40d，可以觀察到典型的橢圓形細胞核結構，核內有核仁直徑約0.15nm，細胞內出現了大量的液泡，脂質體顏色逐漸變深，在細胞壁內側不斷積累(圖1：d-e)。層積保存50d時，細胞核較之前變小，核仁直徑約為0.09nm，細胞內的脂質體又重新聚集在細胞壁的內側(圖1：f-g)；層積保存60d時，可觀察到細胞壁逐漸向內凹陷，細胞形狀畸形，細胞間隙變大，液泡消失，出現了大量的形狀大小規則的淀粉粒，長約0.89μm，寬約0.64μm，脂質體分散排列在細胞壁內側(圖1：h)。

2.2 抗氧化系統酶活性及氧化產物生成量測定

三七種子后熟過程中SOD、POD、CAT、APX、GR酶活性及GSH含量的變化趨勢各不相同。SOD和POD酶活性變化見圖2：a,b，SOD酶活性呈現升降交替的變化趨勢，20d時達到整個過程最大值29.8U·g-1·min-1，到40d時下降到最低值3.63U·g-1·min-1；POD酶活性在后熟期40d時達到整個后熟過程的最高值(5.40U·g-1·min-1)，顯著高于其他后熟時期(P<0.05)，隨后呈現逐漸降低的趨勢。抗氧化酶CAT、APX酶活性變化如圖2：c,d所示，CAT酶活性整體呈現出逐漸上升的變化趨勢，在后熟期60d時達到最大值(4.29U·g-1·min-1)，隨后逐漸下降。APX酶活性整體呈現出上下交替的變化趨勢，在后熟期60d時，酶活達到最小值(2.55U·g-1·min-1)，而70d時上升至最大值(4.16U·g-1·min-1)。GR酶活性和GSH含量變化見圖2：e,f，GR酶活性在后熟期初期呈現上升趨勢，30d時達到整個后熟過程最大值(0.58U·g-1·min-1)，隨后呈現逐漸緩慢下降趨勢。GSH含量在整個后熟過程呈現出升降交替的變化趨勢，其中在20d時達到最大值(1.18mmol·g-1)，隨后直線下降至40d時出現最小值(0.56mmol·g-1)。

2.3 與抗氧化系統相關差異表達基因的篩選與分析

為明確三七種子后熟期抗氧化系統功能的分子機理，在所得的三七種子轉錄組數據庫中，篩選出后熟過程中與抗氧化系統有關酶的差異表達基因共87條，其中與SOD、POD、CAT、APX、GR和GSH合成酶相關差異表達基因分別有25、32、17、4、7、2條。SOD家族相關基因表達量呈現先降后升的趨勢(圖4：a)，后熟20 d時 FPKM值最小為19.39，隨后開始不斷升高，后熟40 d時為28.45，到后熟60 d時達到最大值為29.59。POD類基因表達量FPKM值總體呈現升高趨勢(圖4：b)，后熟0 d為最小值6.28，后熟40 d為12.96，后熟60 d時達到最大值18.55。

圖 1 三七種子后熟過程各時期的超微結構 CW. 細胞壁； L. 脂質體； V. 液泡； Am. 淀粉體；Nu. 核仁； N. 細胞核；Is. 細胞間隙。標尺a, b, d, f=0.2 nm； 標尺c, h=2 μm； 標尺e=1 μm；標尺g= 5 μm。Fig. 1 Electron micrographs of sections from the seed of Panax notoginseng during after-ripening process of embryo growth CW. Cell wall; L. Lipid; V. Vacuole; Am. Amyloplast; Nu. Nucleolus; N. Nucleus; Is. Ntercellular space. Scale bars: a, b, d, f=0.2 nm; c, h = 2 μm; e = 1 μm; g = 5 μm.

圖 2 三七種子后熟過程中超氧化物歧化酶 (SOD, a)、過氧化物酶 (POD, b)、過氧化氫酶 (CAT, c)、抗壞血酸過氧化物酶 (APX, d)和谷胱甘肽還原酶 (GR, e)活性及還原型谷胱甘肽 (GSH, f)含量的變化 數據是平均值 ± 標準誤(n=3)。下同。Fig. 2 Changes in activities of SOD (a), POD (b), CAT (c),APX (d), GR(e) in the process of embryo growth after-ripening of Panax notoginseng seed and content of GSH(f) Values for each point were (n=3). The same below.

圖 3 三七種子后熟過程中脂質過氧化物丙二醛(MDA, a)、超氧陰離子·, b)含量的變化Fig. 3 Changes in content of MDA (a) and ·(b) in the process of embryo growth after-ripening of Panax notoginseng seed

圖 4 三七種子后熟過程中超氧化物歧化酶(SOD, a)和過氧化物酶(POD, b)過氧化氫酶(CAT, c)、抗壞血酸過氧化物酶(APX, d)和谷胱甘肽還原酶(GR, e)及還原型谷胱甘肽(GSH, f)相關基因的FPKM值Fig. 4 FRKM related to SOD (a), POD (b), CAT (c), APX (d), GR (e) and GSH (f) of Panax notoginseng seed at different after-ripening stages

CAT類是所有抗氧化系統相關酶基因中差異表達量最高的，FPKM值的變化規律為先升后降(圖4：c)，后熟0 d的FPKM值最低為189.54，后熟20 d達到最大值335.16，隨后出現緩慢下降趨勢，后熟40 d時為356.44。APX類基因表達量在整個后熟過程中持續升高(圖4：d)，后熟0 d FPKM值為61.32，后熟20 d和40 d增幅較平緩，40 d時為104.77，到后熟60 d升至最大值120.66。GR類基因表達量表現出先降后升(圖4：e)，FPKM值在后熟0 d為最大值(23.87)，隨后出現緩慢下降趨勢，在后熟40 d出現最低值(19.81)。GSH相關基因表達量FPKM值在整個后熟過程中表現為升降交替變化(圖4：f)，于20 d達到最大值(12.83)，隨后開始下降至后熟40 d為最低值(7.61)。

3 討論

在組織中，當編碼酶促抗氧化劑的基因增量表達時，由氧化事件引起的細胞毒素產物的清除對于提高脫水脅迫耐性具有重要意義(Ingram & Bartels，1996)。三七種子后熟過程中，SOD相關基因在種子種胚形態生長期少量表達，說明此時種子內部受到的氧化脅迫較小，而在種子后熟40 d時表達量明顯增加，這也驗證了此時種子內部所受氧化傷害程度嚴重的結果。POD相關基因在后熟期差異表達總體上呈現持續升高，說明在整個后熟過程中POD起到了抵御氧化傷害的作用。CAT相關基因差異表達量最高，可見該基因對三七種子所受氧化傷害較為敏感。APX相關基因表達量在整個后熟期持續升高，而酶活性在后熟40 d和60 d時較低，推測后熟60 d時種子內所受到由H2O2引起的氧化傷害程度最為嚴重。GSH受谷胱甘肽合成酶基因調控，其差異表達量在各時期相對較小，后熟期20 d時表達量最高，推測種子在后熟20 d時GR和GSH發揮著重要的ROS清除功能。可見，三七種子后熟過程中每種抗氧化酶基因的表達模式都是獨特而又復雜的。

總的來看，三七種子后熟過程中，SOD、POD、CAT、APX相關差異表達基因的FPKM值總體呈現升高趨勢。后熟前20 d，SOD、APX、GR活性升高，對氧化傷害起到抵御作用；后熟40 d時，細胞代謝活性最強，種胚完成形態成熟，SOD、POD、CAT、GR活性下降，MDA大量積累，此時種子對氧化傷害最為敏感；后熟60 d時膜脂過氧化加劇，抗氧化系統酶活性降低，導致細胞功能的喪失和畸形死亡。由此可見，抗氧化酶系統不能有效抵御氧化傷害可能是導致三七種子脫水敏感性的重要原因之一。

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鄉村地區有別于城市，資金來源有限，主要是靠公共財政支出。但鄉村的公共財政支出有限，所以需要“花小錢辦大事”，提高資金使用效率，平衡進度、成本、質量，需要抓住機會建設出實打實的效果，快速地出效果并不意味著急于求成，這樣可以充分提高各參建單位以及當地民眾的積極性。EPC建造模式合同清晰明確，有效避免責權不清，可以充分發揮總承包商的管理能力，全面協調各方面，確保項目的質量和進度，有效實現預期目標。

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Changes of antioxidant enzyme and ultrastructure in recalcitrant seeds ofPanaxnotoginsengduring after-ripening process

YANG Kai1,2, LI Lei1,2, LONG Guang-Qiang1, MENG Zhen-Gui1,LI Long-Gen1, CHEN Jun-Wen1,2*

( 1. Yunnan Provincial Research Center on Good Agricultural Practice for Dominant Chinese Medicinal Materials, Yunnan Agricultural University,Kunming 650201, China; 2.CollegeofAgronomyandBiotechnology,YunnanAgriculturalUniversity, Kunming 650201, China )

The changes in ultrastructure, activity of antioxidant enzyme and expression of antioxidant enzyme were examined in 3-year-oldPanaxnotoginsengseeds during the after-ripening process. The objective of the present study was to analyze the desiccation sensitivity in recalcitrant seeds ofP.notoginsengat the physiological, ultrastructural and transcriptomic levels. The results showed that during after-ripening process of 40 d, the activity of SOD, CAT, APX and GR in seeds increased at first and then reduced, and POD activity gradually increased. At the end of after-ripening period of 40 d, FPKM values of gene related to antioxidant enzymes (SOD, POD, CAT and APX) were 28, 13, 356 and 105, respectively, and all at a high. At the same time, intact cell structure was observed, and mature embryo was morphologically completed. However, the amount of MDA reached a peak value. Summarily, the peroxidations of membrane lipid caused cell membrane degradation and led to cell function loss and even cell death; meanwhile, antioxidant enzymes could not effectively resist the oxidative injury with the prolonged time of after-ripening, which may be the vital reasons for desiccation sensitivity in recalcitrant seeds ofP.notoginseng.

Panax notoginseng,after-ripening,desiccationsensitivity,ultrastructure,antioxidantsystem

10.11931/guihaia.gxzw201510018

2015-10-15

2016-01-18

國家自然科學基金(81360609)；云南省中青年學術技術帶頭人后備人才培養項目(2014HB011) [Supported by the National Natural Science Foundation of China (81360609); the Project of Young and Middle-aged Talent of Yunnan Province (2014HB011)]。

楊凱(1993-)，女(彝族)，云南普洱人，碩士研究生，主要研究方向為種子生理學，(E-mail)flove102@163.com。

*通訊作者： 陳軍文，博士，教授，主要研究方向為藥用植物生理生態，(E-mail) cjw31412@163.com。

Q946

A

1000-3142(2016)12-1519-07

楊凱，李磊，龍光強，等. 頑拗性三七種子后熟過程超微結構和抗氧化酶變化 [J]. 廣西植物， 2016， 36(12):1519-1525

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