蜻蜓鳳梨 AfERF113基因的克隆與表達特性

2017-01-04 06:35:06李志英王加賓

西北農業學報 2016年12期

雷明，李志英，王加賓,喬飛，徐立

(中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所，農業部華南作物基因資源與種質創新重點實驗室，海南儋州 571737)

雷明，李志英，王加賓,喬飛，徐立

(中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所，農業部華南作物基因資源與種質創新重點實驗室，海南儋州 571737)

觀賞鳳梨是一類重要的熱帶花卉，但有關其生長發育調控分子機理的研究相對匱乏，這在一定程度上限制了新品種的開發和利用。以熱帶觀賞花卉蜻蜓鳳梨(Aechemiafasciata)為材料，在分析蜻蜓鳳梨轉錄組數據的基礎上，結合cDNA末端快速擴增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)技術克隆了APETALA2/Ethylene Response Element Binding Protein(AP2/EREBP)家族的1個轉錄因子編碼序列，并將其命名為AfERF113。生物信息學分析表明，AfERF113cDNA全長1 093 bp，有1個864 bp的開放閱讀框(open reading frame，ORF)，編碼287個氨基酸。蛋白質理化性質分析表明，該蛋白分子質量為29.768 5 ku，理論等電點為6.06，為一類不穩定的酸性親水蛋白。亞細胞定位軟件預測表明該蛋白定位于細胞核。結構域分析表明，該蛋白有1個保守的AP2結構域，分屬ERF亞族的B-4類，與擬南芥中所有ERF蛋白的ERF113親源關系最近。實時熒光定量PCR(quantitative real time PCR，qRT-PCR)結果表明，AfERF113轉錄本在成熟株的根中表達量最高，且外源乙烯誘導后，AfERF113的表達量無論是在幼株還是在成株的各組織中均顯著上調。研究結果證實，AfERF113響應了外源乙烯調控，為進一步研究AfERF113基因的功能及通過基因工程手段調控鳳梨科植物生長發育提供了理論依據。

蜻蜓鳳梨；AP2/EREBP家族；AfERF113；乙烯；表達分析

鳳梨科(Bromeliaceae)植物原產于南美，包括58個屬3 248個種，是一類廣泛分布于熱帶亞熱帶地區形態最為多樣的種屬之一[1-2]。鳳梨科植物的一些品種如食用鳳梨(菠蘿Ananascomosus)在6 000多年前就已經被馴化[3-4]。除了菠蘿外，人工栽培的鳳梨科植物還包括一類重要的熱帶花卉，即觀賞鳳梨。觀賞鳳梨進入人們的生活不過百余年歷史，傳入中國則在20世紀90年代中期，但因其形態多樣、花期持久，市場發展突飛猛進，現已成為僅次于蘭花和紅掌的第3大熱帶花卉，效益超過了菠蘿[5]。

作為一種重要的植物激素，乙烯參與種子萌發、幼苗生長、開花誘導、果實成熟、器官衰老和病原菌響應等植物生長發育的諸多過程，是植物體應答很多生物和非生物脅迫的關鍵因子[6-7]。擬南芥中，目前已知響應乙烯信號的受體蛋白有5個，分別為ETHYLENE RESPONSE1(ETR1)、ETR2、ETHYLENE RESPONSE SENSOR1(ERS1)、ERS2和ETHYLENEINSENSITIVE4(EIN4)[8-9]。乙烯受體蛋白結合乙烯后抑制了Raf-like Ser/Thr 蛋白酶 CONSTITUTIVE TRIPLE RESPONSE1(CTR1)的磷酸化能力，使得膜蛋白ETHYLENE INSENSITIVE2(EIN2)被激活[10-11]。活化的EIN2穩定了轉錄因子EIN3在核內的表達，EIN3蛋白則通過結合到ERFs基因(如ERF1)的啟動子區，調控后者的表達，最終啟動了植物對各種信號的應答響應[12]。

ERFs屬于APETALA2/Ethylene Response Element Binding Protein(AP2/EREBP)家族。依據所含AP2結構域以及序列同源性的差異，AP2/EREBP家族又可以分為5個亞族：AP2亞族、干旱響應元件結合蛋白亞族(Dehydration Responsive Element Binding Protein，DREB)、乙烯響應元件結合蛋白亞族ERF、Related to ABSCISIC ACID INSENSITIVE3 (ABI3)/VIVIPAROUS1 (VP1)(RAV)亞族以及其他蛋白類[13]。其中，ERF亞族含有1個AP2結構域。根據進化樹及同源性分析結果，ERF亞族蛋白可以分為B-1到B-6共6類，這6類大部分都是轉錄激活因子，但有些含有ERF相關雙親抑制(ERF-associated amphiphilic repression ，EAR)基序的B-1類蛋白則是轉錄抑制因子[14-19]。ERFs轉錄因子主要通過結合到靶標基因啟動子區的核心AGCCGCC(GCC box)順式元件上調控靶標基因的表達，應答細菌、真菌或病毒病原體等造成的生物脅迫[20-22]，也有一些ERFs可以通過識別干旱響應元件(dehydration-responsive elements，DREs/CRT)應答非生物脅迫[23]。另外，一些ERFs轉錄因子則可以同時識別GCC box和DREs/CRT元件調控靶標基因的表達[24]。

目前，國內外有關鳳梨科植物AP2/EREBP轉錄因子的研究很少。Lei等[25]報道了蜻蜓鳳梨(Aechemiafasciata)中的1個AP2亞族的基因AfAP2-1的轉錄本表達響應了外源乙烯處理，且在擬南芥中過表達顯著延遲了開花。前期研究中，通過乙烯處理和未處理的蜻蜓鳳梨轉錄組數據比較分析發現，1個AP2家族的基因在乙烯處理24 h后的蜻蜓鳳梨成株心葉中表達量顯著上升(未發表)，基于此，通過RACE技術克隆該基因的全長，并將其命名為AfERF113。此外，利用生物信息學方法對其編碼的蛋白進行結構和功能分析，并通過轉錄水平的表達分析解析其組織表達特異性，同時發現其的確受外源乙烯處理的調控。研究為進一步解析AfERF113基因響應外源乙烯或其他脅迫因素的分子機制及通過基因工程手段調控鳳梨科植物生長發育提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

蜻蜓鳳梨取自中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所離體保存與繁育研究室大棚，環境溫度為30～32 ℃。所用材料均為移栽成活的試管苗，幼株為成活后株齡6個月植株；成株為成活后株齡11～14個月的植株。外源乙烯利處理時，取10 mL體積分數為400 μL·L-1的乙烯利灌心，分別處理1、6、24 h，以清水灌心的材料為對照。不同組織材料在處理后迅速于液氮中冷凍，之后置于-80 ℃保存，備用。

1.2 總RNA提取及cDNA第1條鏈的合成

蜻蜓鳳梨總RNA的提取采用改良的CTAB法[26]。cDNA第1條鏈的合成采用TranScript-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(Transgene)，具體過程按照試劑盒說明書進行。

1.3 5′和3′ RACE

前期轉錄組數據獲得了414 bp的基因片段。為了獲得該基因的全長，首先參照SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)的說明書合成了5′和3′ RACE模板。根據已有的414 bp的序列，分別設計了5′和3′特異引物進行后續擴增。其中，5′的外側和內側引物分別為5′ RACE GSP51和5′ RACE GSP52，3′的外側和內側引物分別為3′ RACE GSP31和3′ RACE GSP32。引物序列見表1。PCR擴增得到的特異性條帶采用OMEGA(Omega)的膠回收試劑盒進行。純化后的特異條帶分別連接到pEASY-blunt克隆載體上，測序。測序后的條帶與轉錄組序列拼接后再做進一步驗證分析。

1.4 生物信息學分析

利用NCBI網站的ORF Finder在線軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)進行開放閱讀框的預測分析；利用NCBI網站的BLAST在線軟件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行核苷酸和氨基酸的序列比對與分析；利用DNAMAN 6.0軟件進行氨基酸序列的同源性比對；利用MEGA 6.0軟件和鄰接法進行進化樹構建；利用ProtParam在線軟件(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質分子質量、等電點、疏水性及穩定性；利用TMHMM在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對蛋白質的跨膜區進行預測；利用SignalP 4.1在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對蛋白質的信號肽進行預測；利用Cell-PLoc package(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc/)、WOLF Psort(http://www.genscript.com/wolf-psort.html)和ProtComp(http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=protcomppl& group=programs&subgroup=proloc)在線軟件預測蛋白的亞細胞定位；利用Phyre2軟件(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)預測蛋白質三維結構。

1.5 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

運用Primer premier 5.0 設計用于實時熒光定量PCR的各基因特異引物。選用TransStart Tip Green qPCR SuperMix(Transgene)進行PCR反應，在Therma PikoReal 96TM熒光定量PCR儀(Thermo Fisher Scientific)上進行。反應體系(10 μL)：qRT-PCR混合反應液SuperMix 5 μL，模板1 μL，正反向引物各0.3 μL，滅菌的去離子水補齊至10 μL；反應程序：95 ℃預變性7 min，然后在95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s的條件下擴增40個循環，循環結束后65 ℃ 30 s，20 ℃停止。每個樣品2個生物學重復，3次技術重復。數據分析采用雙delta法，選取蜻蜓鳳梨的β-actin(AfACTB)為內參。通過制作標準曲線獲得目的基因和內參基因的擴增效率。所有引物序列見表1。

2 結果與分析

2.1AfERF113cDNA全長的克隆與序列分析

以蜻蜓鳳梨心葉cDNA為模板，利用RACE及PCR技術獲得1條長度為1 093 bp的AP2/EREBP家族基因的cDNA序列。分析后發現，其5′非編碼區(5′ untranscriptional region，5′-UTR)長度為114 bp，3′非編碼區(3′ untranscriptional region，3′-UTR)長度為115 bp(包括25 bp的polyA)，開放閱讀框(open reading frame，ORF)長度為864 bp，編碼287個氨基酸殘基。將其在NCBI網站上進行BLAST比對，發現其與很多植物中AP2/EREBP家族ERF亞族的ERF113或ERF113-like基因具有很高的相似性，故將其命名為AfERF113(Genbank登錄號：KX371269)。

2.2 AfERF113蛋白的同源性和進化樹分析

序列比對分析表明，AfERF113與油棕(Elaeisguineensis)的ERF113、海棗(Phoenixdactylifera)的ERF113、荷花(Nelumbonucifera)的ERF113和小果野芭蕉(Musaacuminatasubsp.malaccensis)的ERF114分別具有51.92%、48.43%、40.46%和39.57%的同源性(圖1)。結構域分析發現，AfERF113具有1個典型的AP2結構域，包含保守的YPG和RAYD元件(圖1)。此外，該保守的AP2結構域的第14位和第19位氨基酸殘基分別為丙氨酸(Ala，A)和天冬氨酸(Asp，D)(圖1)，因此，AfERF113屬于AP2/EREBP家族的ERF亞族。

為了進一步分析AfERF113在ERF亞族中的類別，將其與擬南芥(Arabidopsisthaliana)ERF亞族B1～B6類別中的部分蛋白序列進行進化樹分析，結果發現AfERF113與擬南芥的ERF112、ERF113、ERF114、ERF115等進化關系最近，同屬于B4類(圖2)。

2.3AfERF113的理化性質和空間結構

利用ProtoParam在線軟件分析AfERF113后發現，該蛋白質分子質量為29.768 5 ku，理論等電點為6.06，總平均親水性(GRAVY)為-0.460，不穩定系數為60.51，因此推測AfERF113是一類不穩定的酸性親水蛋白。利用TMHMM在線軟件對AfERF113進行分析后發現，該蛋白位于跨膜螺旋中的氨基酸殘基數為0.003 62，遠小于18；此外，N端60個氨基酸殘基中位于跨膜螺旋中的氨基酸殘基數為0.000 82，遠小于10，推測該蛋白不含跨膜區(圖3-A)，這與ProtoParam預測其為親水性蛋白的結果一致。進一步使用SignalP 4.1在線軟件對AfERF113進行了信號肽預測，結果表明該蛋白的N端70個氨基酸殘基中并不含信號肽(圖3-B)，推測該蛋白不屬于分泌蛋白。為了驗證該蛋白的亞細胞定位，分別使用Cell-PLoc package、WOLF Psort和ProtComp軟件分析對其進行分析。3個不同的軟件分析結果都預測該蛋白定位于細胞核，且ProtComp軟件預測其為轉錄因子。

表1 本研究所用的引物

AfERF113. 蜻蜓鳳梨(Aechemia fasciata) ERF113；EgERF113.油棕(Elaeis guineensis)ERF113，XP_010929690.1；NnER113.荷花(Nelumbo nucifera)ERF113，XP_010249458.1；MaERF114. 小果野芭蕉(Musa acuminata subsp.)ERF114，XP_009405112.1；PdERF113.海棗(Phoenix dactylifera)ERF113，XP_008791015.1

圖2 AfERF113的分子進化樹構建

A.AfERF113的信號肽分析 The analysis of signal peptide of AfERF113；B.AfERF113的跨膜區分析 The analysis of transmembrane region of AfERF113

為了更進一步明晰AfERF113蛋白的結構特點，利用Phyre2軟件對其進行三維建模。以擬南芥ERF1蛋白(PDB ID：1gcc.1.C)為模板，獲得AfERF113蛋白保守結構域91-152 氨基酸肽段區域的三維結構模型(圖4-A，4-B)。從該模型中可以看到， AfERF113的該保守結構域主要含有3個β折疊和1個α螺旋，其中2個β折疊由一級結構中的YPG元件構成，另一個β折疊和α螺旋主要由RAYD元件構成，這與很多ERF蛋白核心區域的構象類似，表明該模擬構象合理，空間結構穩定。

A.二級結構 The second structure；B.三維模型 The three-dimension structure

2.4 AfERF113的組織表達特性

為了研究AfERF113在蜻蜓鳳梨各組織中的表達特性，分別選取幼株、成株和抽薹39 d后成株的外葉、心葉、莖和根，提取RNA，反轉錄成cDNA，以此為模板，利用qRT-PCR技術對其進行驗證。結果顯示，AfERF113轉錄本在幼株各組織以及未開花的成熟株和抽薹39 d后的成熟株的外葉、心葉和莖中的表達量相對較低，但在未開花的成熟株和抽薹39 d后的成熟株根中表達量則顯著升高(圖5-A)。此外，AfERF113轉錄本在花器官中的表達量均很低(圖5-B)。

2.5AfERF113對外源乙烯處理的響應特性

為了驗證AfERF113對外源乙烯處理的響應情況，分別用10 mL體積分數為400 μL·L-1的乙烯利對蜻蜓鳳梨幼株和成株的整株進行灌心處理，然后于處理后的1、6、24 h分別對幼株和成株的外葉、心葉、莖和根中AfERF113轉錄本的表達情況進行檢測。結果顯示，在幼株中，乙烯處理1 h后AfERF113在各檢測組織中的表達量顯著上調(圖6-A)；在成株中，乙烯處理1 h后AfERF113在外葉和心葉中的表達量上調顯著，在莖中的表達量則隨著外源乙烯處理時間的延長穩步上升，而在根中的表達量則在乙烯處理后呈現先上升后下降的趨勢(圖6-B)。這些結果表明，在蜻蜓鳳梨的幼株和成株中，AfERF113在不同的組織中可能具有不盡相同的功能。

A. AfERF113在蜻蜓鳳梨幼株、成株和抽薹39 d后的成株各組織中的相對表達量 Relative expression of AfERF113 in variable tissues of juvenile plants, adult plants before flowering, and 39-day after flowering (DAF) adult plants；B. AfERF113在抽薹39 d后的成株營養器官和生殖器官中的相對表達量 Relative expression of AfERF113 in vegetative and reproductive organs of 39-DAF adult plants

A. AfERF113在乙烯處理后幼株各組織中的相對表達量 Relative expression of AfERF113 transcripts in variable tissues of juvenile plants treated with ethylene；B. AfERF113在乙烯處理后成株各組織中的相對表達量 Relative expression of AfERF113 transcripts in variable tissues of adult plants treated with ethylene

3 討論

自從AP2轉錄因子和ERFBP轉錄因子分別首次于1994年和1995年從擬南芥和煙草中被分離鑒定出以來[20, 27]，現已發現AP2/EREBP轉錄因子廣泛存在于植物、原生生物、藍藻和真菌中[28-29]。本研究首次從重要的熱帶花卉蜻蜓鳳梨中克隆到AP2/EREBP轉錄因子ERF亞族的一個基因，根據BLAST同源比對結果，將其命名為AfERF113。

AfERF113具有一個非常典型的AP2結構域，該結構域在一級結構上含有2個特別保守的氨基酸序列(圖1-A, 1-B)。其中，YPG元件在二級結構上可以形成2個β折疊，RAYD元件可以形成1個β折疊和1個α螺旋(圖4)。在模擬的三級結構上， AfERF113的AP2結構域與擬南芥的ERF1(PDB ID：1gcc.1.C)非常相似(圖4)。已知這3個反向平行的β折疊在幫助AP2結構域識別各種順式作用元件中可能起重要作用[30]，而兩親性的α螺旋則參與了DNA或其他轉錄因子之間的相互作用[31]。此外， AfERF113的AP2結構域中第14位和第19位分別是保守的丙氨酸(Ala，A)和天冬氨酸(Asp，D)，區別于大部分DREB家族的纈氨酸(Val14，V14)和谷氨酸(Glu19，E19)[13]。 AfERF113在蛋白結構上的保守性暗示其在功能上也可能具有一些保守性。

3.1 AfERF113的轉錄本具有組織表達特異性

基因表達模式的分析是進一步研究生物學功能的基礎[32]。研究結果顯示，ERF113同源基因在不同物種中的組織特異性表達既有共性，又有差別。擬南芥的ERF113(RAP2.6L)在成熟干燥的種子、花(尤其是雄蕊)、子葉下胚軸、成熟的根以及發育中的木質部均高表達[33-34]；楊樹(Populus)的一個RAP2.6L同源基因則在雌雄花、木質部和根中有強表達[35]；黑胡桃(JuglansnigraL.)的一個RAP2.6L同源基因JnRAP2-like則在雌花中表達量最高，而在根中其次，在雄花中則檢測不到其表達[36]。本研究結果顯示，在蜻蜓鳳梨幼株的外葉、心葉、莖和根中，AfERF113的表達量均較低(圖5-A)。但是隨著植株年齡的增長，AfERF113在成株根中的表達量顯著上升，為幼株根中表達量的126倍(圖5-B)，這暗示AfERF113可能調控蜻蜓鳳梨根的生長發育。另外，AfERF113在蜻蜓鳳梨花器官中的表達量均維持在相對較低的水平，與擬南芥、楊樹和黑胡桃的RAP2.6L同源基因的表達模式不盡相同，說明蜻蜓鳳梨中的AfERF113可能進化出新的功能。

3.2AfERF113轉錄本的表達響應了外源乙烯處理

植物生長發育同時受外源環境信號和內源信號的調控，其中，重要的內源信號則包括植物激素，比如乙烯[37]。乙烯進化為植物激素已有4.5億年的歷史[38]。乙烯調控了種子發育、幼苗生長、葉子和花瓣的脫落、果實成熟、器官衰老和病蟲害響應等多種植物生長發育的過程[7]。研究發現，很多物種的ERF113及其同源基因響應了乙烯處理。擬南芥RAP2.6L轉錄本在乙烯處理6～24 h逐漸上升，過表達RAP2.6L的擬南芥植株提高了對乙烯處理的抗性[39]。柑橘(Citrus)的一個RAP2.6L同源基因在乙烯調控的葉片衰老中上調[40]。黑胡桃的JnRAP2.6-like在擬南芥中過表達后參與了木質部等組織中乙烯和茉莉酸協同調控路徑[36]。本研究發現，外源乙烯利處理1 h后，蜻蜓鳳梨幼株各組織中AfERF113的轉錄本的表達量均顯著上升(圖6-A)；成株中，外葉、心葉和莖中AfERF113的轉錄本達到最大表達量所用的時間分別為1、6、24 h，而在根中的表達量則在處理24 h后下調了(圖6-B)。AfERF113在幼株和成株各組織中受外源乙烯處理誘導表達的差異性表明：首先，蜻蜓鳳梨的株齡影響了乙烯對AfERF113的調控；其次，組織特異性造成AfERF113的轉錄本表達量受乙烯誘導后達到最大值時出現了時間差。已知ERF家族中擬南芥的ERF1在轉錄水平上直接受乙烯信號路徑的EIN3調控[12]，因此，通過克隆AfERF113的基因組和啟動子序列，找到并驗證是否存在乙烯響應元件，同時通過體內外方法尋找不同組織中與AfERF113DNA或蛋白發生相互作用的因子，有望為更好地解析AfERF113在不同株齡及不同組織中對乙烯誘導響應差異的機制。

已知擬南芥的RAP2.6L參與了從根外植體再生出芽的調控[41]、病害防疫[42]及髓細胞分化和器官再生[43]。未來通過轉基因結合高低溫脅迫、鹽脅迫及其他激素脅迫處理的方法進一步探究AfERF113基因在蜻蜓鳳梨生長發育調控中的基本功能，無疑可以為通過基因工程手段調控蜻蜓鳳梨乃至鳳梨科植物生長發育提供理論依據。

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(責任編輯：潘學燕 Responsible editor:PAN Xueyan)

Cloning and Expression Analysis ofAfERF113inAechemiafasciata

LEI Ming，LI Zhiying，WANG Jiabin, QIAO Fei and XU Li

(Ministry of Agriculture Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China, Institute of Tropical Crop Genetic Resources, Chinese Academy of Tropical

Agricultural Sciences, Danzhou Hainan 571737, China)

Cultivated bromeliads are important tropical ornamental flowering plants. However, it is little known about its molecular mechanism of growth and development regulation, and which in turn becomes a bottleneck for breeding and exploiting of new varieties. With the ornamental bromeliadsAechemiafasciataas material, based on its transcriptome data, a member of APETALA2/Ethylene Response Element Binding Protein (AP2/EREBP) was isolated by using rapid amplification of cDNA ends (RACE) technology and was named asAfERF113. The length ofAfERF113cDNA was 1 093 bp, with an 864 bp open reading frame (ORF), which encodes a 287-amino acids deduced protein. The protein is acidic hydrophilic and with 29.768 5 ku molecular mass, 6.06 theoretical pI. It is a putative nuclear-localized protein with a conserved AP2 domain. Phylogenetic analysis indicated the domain belong to B-4 group of ERF subfamily and the protein is most close in genetic relationship withArabidopsisERF113. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) results showed that the accumulation ofAfERF113transcripts was highest in roots of adult plants compared with other tested tissues of juvenile. Whereas, after treatment with exogenous ethylene for 1 h, the expression level ofAfERF113transcripts showed significant increase in all tested tissues either of juvenile or adult plants, indicating its rapid response to ethylene. These results provided a theoretical basis of further research ofAfERF113features and manipulating the growth and development of bromeliads using genetic approach in the near future.

Aechemiafasciata; AP2/EREBP family;AfERF113; Ethylene; Expression analysis

LEI Ming, male, Ph.D,assistant professor. Research area: the flowering molecular mechanism of bromeliads.E-mail:leiming_catas@126.com

XU Li, male,research fellow,doctoral supervisor.Research area:the molecular mechanism of the growth and development of bromeliads and bananas.E-mail:xllzy@263.net