豬接觸傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清1型分離鑒定及藥敏試驗

李海利，朱文豪，張青嫻，游 一，郎利敏，張立憲，王克領

（河南省農業科學院畜牧獸醫研究所，河南 鄭州 450002）

豬接觸傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清1型分離鑒定及藥敏試驗

李海利，朱文豪，張青嫻，游 一，郎利敏，張立憲，王克領

（河南省農業科學院畜牧獸醫研究所，河南 鄭州 450002）

豬接觸傳染性胸膜肺炎（porcine contagious pleuropneumonia，PCP）是由胸膜肺炎放線桿菌（Actinoba?cillus pleuropneumoniae，APP）引起的一種急性接觸性呼吸道傳染病，以急性出血性纖維素性肺炎和慢性纖維素性壞死性胸膜肺炎為主要特征，急性者病死率高，慢性者常能耐過。為了解APP的血清型流行情況，本研究對臨床分離的APP進行了血清1型的分子鑒定及藥敏試驗。根據GenBank數據庫設計一對特異性引物，擴增血清1型莢膜多糖基因，擴增片段為1 300 bp。并對分離的APP進行了分子鑒定及耐藥性進行了研究。結果表明，所得PCR產物經過測序，與數據庫中的APP血清1型同源性高達99%；對常用抗生素的藥物敏感性試驗表明APP耐藥性較強，對多數藥物表現出多重耐藥。為本研究為APP血清1型分子鑒定及PCP診斷和防治提供了基礎。

豬接觸傳染性胸膜肺炎；放線桿菌；血清1型，藥敏試驗

豬接觸傳染性胸膜肺炎（porcine contagious pleuropneumonia，PCP）是危害養豬業的主要疾病之一，是引起以豬纖維素性變化為主要特征的呼吸道傳染病的病原，世界上許多國家發生了該病，是影響呼吸系統疾病的主要病原之一，給養豬業造成了巨大的經濟損失[1-3]。近年來，該病在我國呈多發趨勢，其血清型眾多，耐藥性增強，是該病很難根治和徹底凈化的主要根源[4]。豬場一旦有本病的發生，其呼吸道就很難根除。到目前為止，APP有兩個生物類型和15個血清型，各型之間抗原交叉保護力比較低，交叉免疫性不強[5-9]。這15個血清型中，其中的12個血清型能產生四種溶血毒素[10]。本研究對臨床分離的APP菌株進行鑒定和藥物敏感性試驗，建立了APP血清1分子鑒定方法，為APP的臨床診斷和治療提供依據。

1.1試驗材料腦心浸液瓊脂培養基（含10%犢牛血清和100 μg/mL NAD）購于北京路橋生物技術有限公司，NAD（煙酰胺嘌呤二核苷酸）購于大連寶生物工程有限公司，APPⅠ型至12型陽性血清購自中國獸藥監察所。95%乙醇、無水乙醇等試劑均為國產分析純。普通營養瓊脂、普通血清肉湯培養基、麥康凱培養基、LB瓊脂培養基、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、巧克力培養基購自北京路橋生物技術有限公司。藥敏紙片購自北京天壇生物技術有限公司。病料采集自河南省及周邊地區發病豬。DNA提取試劑和PCR試劑盒購自大連寶生物生物技術有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1 細菌分離培養 取肺臟病變組織及氣管樣本，接種于腦心浸液瓊脂（含100 μg/mL NAD和10%犢牛血清）平板上，置于體積分數為10%的CO2培養箱中培養24 h，提取單菌落進行純化培養。

1.2.2 細菌培養特性觀察 取待檢細菌純培養物進行革蘭氏染色，于顯微鏡下觀察細菌形態。

1.2.3 不同培養基生長觀察 取細菌純培養物分別接種于不同培養基平板上，觀察細菌的生長情況。同時進行CAMP試驗，觀察分離菌的溶血現象。

1.2.4 細菌生化試驗鑒定 取細菌純培養物接種于含1%的NAD的各種細菌生化培養管中，置于10%的CO2培養箱中培養24 h，觀察細菌的生化反應結果。

1.2.5 細菌血清型鑒定 將生化鑒定為陽性的APP接

1 材料與方法

種于腦心浸液（含10%犢牛血清和100 μg/mL NAD）平板上，置于體積分數為37℃培養24 h，12 000 r/ min離心10 min，沉淀用生理鹽水洗滌3次，加0.5%的福爾馬林37℃滅活48 h，然后與胸膜肺炎放線桿菌陽性血清進行平板凝集試驗，觀察凝集現象，確定分離菌的血清型。

1.2.6 PCR分子鑒定

1.2.6.1 APP基因組提取及模板制備 將APP接種于腦心浸液瓊脂平板上，置于體積分數為10%的CO2培養箱中培養24 h，挑取純培養物進行DNA的提取。DNA提取步驟按照寶生物DNA提取試劑盒進行操作。

1.2.6.2 引物設計與合成 從Genbank下載編碼莢膜多糖的堿基序列，利用Primer 5.0軟件設計合成一對引物。引物序列為：上游引物5-AATGCTCGTCTCCGAACGGG-3′；下游引物3′-TACTCAGTAGAAGTAGGTTATCG-5′。預期擴增片段為1 300 bp。引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2.6.3 PCR擴增反應 PCR反應體系25 μL：無菌超純水13 μL：Buffer（Mg2+）5.0 μL，dNTPS 4.0 μL（2.5 mmol/μL），上游引物1.0 μL（25 pmol/μL），下游引物1.0 μL（25 pmol/μL），Taq enzyme 0.5 μL（5 U/μL），模板0.5 μL。PCR擴增程序為：95℃ 預變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環，最后72℃延伸5 min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠進行檢測。

一是水資源供需矛盾突出。我國水資源總量位居世界第六，但人均水資源量僅為世界平均水平的1/4。經濟的持續高速或較高增長，人口增長及人均消費水平的持續提高，使得供需矛盾突出，給水安全帶來了日益沉重的壓力，且這種壓力在相當長時間內是不可逆轉的。

1.2.6.4 PCR產物的鑒定 PCR產物純化后送寶生物生物工程有限公司進行測序鑒定。將測序后的結果進行同源性比較。

1.2.7 細菌藥敏試驗 采用K-B藥敏紙片法進行APP分離菌株對臨床常用抗菌藥物的敏感性測定，并參考藥敏試驗抑菌環直徑判定標準（WS-T125-1999）判定藥敏試驗結果，確定待檢分離菌的藥敏特性。

2 結果與分析

2.1細菌分離結果培養皿在二氧化碳培養箱中37℃培養24 h后，在腦心浸液瓊脂平板上有可疑細菌生長，菌落邊緣整齊、圓形、光滑濕潤、透明、針尖大小的菌落（圖1：A，B）。然后菌株轉接在綿羊血平板上，可產生穩定的β溶血（圖2：A，B）。

2.2細菌培養特性觀察取待檢細菌純培養物進行革蘭氏染色，于顯微鏡下觀察細菌形態。將上述細菌進行革蘭氏染色，鏡檢。可見細菌兩極染色，菌體呈球狀、桿狀或球桿狀等多形性（圖3：A，B）。

圖1 APP腦心浸液瓊脂上的生長形態Fig.1 The growth morphology of APP on brain heart infusion agar

圖2 AA在血瓊脂平板上的生長形態Fig.2 The growth morphology of APP on brain heart infusion blood agar

圖3 細菌形態觀察Fig.3 Bacterial morphology observation

2.3不同培養基生長觀察取細菌純培養物分別接種于普通營養瓊脂、普通血清肉湯培養基，麥康凱培養基、LB瓊脂培養基、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、巧克力培養基平板上，觀察細菌的生長情況。同時進行CAMP試驗，觀察分離菌的溶血現象。

培養皿在二氧化碳培養箱中37℃培養24 h后，APP在普通營養瓊脂、普通血清肉湯培養基、麥康凱培養基、LB瓊脂培養基、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、巧克力培養基上不生長。在腦心浸液瓊脂（含10%犢牛血清和100 μg/mL NAD）平板上生長良好。分離菌與金黃色葡萄球菌一起培養（CAMP試驗）發現，靠近葡萄球菌生長線的分離菌生長態勢較好，并且在生長線周圍出現β溶血現象（圖4：A，B）。

2.4細菌生化試驗鑒定取細菌純培養物接種于含1%的NAD的各種（葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、甘露糖，乳糖、甘露醇、阿拉伯糖、七葉苷，硫化氫、靛基質，尿素酶、過氧化氫）細菌生化培養管中，置于10%的CO2培養箱中培養24 h，觀察細菌的生化反應結果。

圖4 溶血現象Fig.4 Hemolysis

表1 細菌生化鑒定結果Table1 The results of biochemical identification of isolated strains

2.5細菌血清型鑒定細菌的純培養物分別與1～12型APP標準陽性血清進行平板凝集試驗，結果發現分離到的部分菌株均與標準型陽性血清呈現明顯的凝集現象，與其他標準陽性血清和生理鹽水對照均不發生凝集反應。凝集試驗結果表明分離到的菌株為胸膜肺炎放線桿菌血清1型。

2.6擴增產物的檢測及鑒定PCR產物經1%的凝膠電泳，然后在凝膠成像儀中觀察。擴增產物在1 300 bp處可見特異性DNA擴增條帶（圖5），與預期大小相符。

圖5 PCR擴增結果Fig.5 Amplification results on PCR

2.7藥敏特性采用藥敏紙片瓊脂擴散法對分離株菌進行藥物敏感性試驗，結果見表2。

從表2可以看出，分離菌對頭孢吡肟、頭孢曲松、頭孢唑肟、頭孢美唑、頭孢克羅、頭孢他美、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢地嗪、頭孢呋辛鈉、頭孢西丁敏感；對鏈霉素、大觀霉素、新霉素、利福平、妥布霉素、美洛培南、桿菌肽、多粘菌素、替考拉寧、新生霉素、磷霉素、氯霉素、阿洛西林、四環素、萘啶酸、紅霉素、卡那霉素、慶大霉素、阿米卡星、青霉素、哌拉西林、阿莫西林、頭孢唑林、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢匹胺、頭孢哌酮、頭孢羥氨芐、頭孢丙烯、氨芐西林、羧芐西林、苯唑西林、美洛西林、奈替米星耐藥；對頭孢噻吩、環丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、頭孢克肟中等敏感。

3 討論

豬傳染性胸膜肺炎在世界各國流行，給養豬業造成嚴重的經濟損失。胸膜肺炎放線桿菌血清型較多，不同國家和地區流行的血清型不同[11-15]。在墨西哥，1a、3,5a、5b和7血清型，許多歐洲國家主要是2、9血清型，北美主要是1、5血清型，加拿大和美國主要是1、5、7血清型，德國主要是2、7、9血清型，英國主要是3和8血清型，澳洲主要為1、7、12血清型，日本主要為2、5血清型，韓國主要為2、4、5、7血清型，我國主要是1、2、3、4、5、7、8、9、10血清型[16-19]。本研究從臨床病例中分離胸膜肺炎放線桿菌，并以標準陽性血清，采用平板凝集試驗對分離菌株進行了血清型鑒定，并采用PCR方法對血清型1型進行了分子為APP的預防控制和免疫防控提供了重要的依據。

表2 藥敏試驗結果Table2 The results of antimicrobial susceptibility

PCP是規模化豬場中主要的呼吸系統疾病之一。同時，引起豬群發生呼吸道癥狀的疫病還有豬支原體肺炎、豬傳染性萎縮性鼻炎、副豬嗜血桿菌病等[20-22]。目前，抗生素是治療細菌性疾病的關鍵，由于臨床用藥的不規范及濫用藥物導致細菌耐藥性增加，以及導致疾病對動物機體的損傷無法用藥物來恢復等，導致抗生素在治療細菌性疾病上沒有明顯效果[23]。臨床分離出大量多重耐藥菌株，抗生素的應用已經很難達到控制本病的發生。因此開展血清型鑒定、細菌耐藥性、流行病學和疫苗的研究具有重大意義。

APP血清型比較復雜，具有地方特異性，同時各血清型之間也很難產生較強的交叉保護作用[24-25]。感染本病后往往容易出現繼發感染，增加了防控的難度；另外，感染過本病且耐過的豬成為潛在的傳染源。因此，及時、準確地分離鑒定APP，研制新型獸藥制劑及新型疫苗，對防控本病具有重要的指導意義。

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Isolation and Identification and Medicine Sensitivity test of Serotype 1 of Porcine Contagious Pleuropneumonia Actinobacillus pleuropneumoniae

Li Haili,Zhu Wenhao,Zhang Qingxian,You Yi, Lang Limin,Zhang Lixian,Wang Keling
(Animal Husbandry and Veterinary Research Institute,Henan Academy of Agricultural Sciences,Henan Zhengzhou 450002)

Porcine contagious pleuropneumonia(PCP)is a highly contagious respiratory infectious diseases,which caused by Actinobacillus pleuropneumonia(APP)with an acute hemorrhagic fibrinous pneumonia and chronic cellulose necrotic pleural pneumonia.In order to understand the prevalence of APP,this study carried out the molecular identification and medicine sensitivity test of serum type 1 in the clinical isolates of APP.According to GenBank database design,a pair of specific primers was amplification of serum type 1 capsular polysaccharide gene,the amplified fragment was 1 300 bps.The molecular identification and medicine resistance of the isolated APP were studied.The results showed that the homology was 99%with serotype 1 in the data base.The antibiotics susceptibility test showed that the majority of drugs showed multiple resistance.This study provides the molecular identification of the APP serotype 1 and the prevention and treatment of PCP.

Porcine contagious pleuropneumonia;Actinobacillus pleuropneumoniae;Serotype 1; Drug sensitivity

S852.619 < class="emphasis_bold"> 文獻標識碼：B

B

1672-9692(2016)06-0007-07

2016-05-03

李海利（1982-），男，助理研究員，主要從事動物傳染病臨床診斷及防控研究工作。

河南省農業科學院優秀青年科技基金（2013YQ22）。