國標法和紙片法做食品中菌落總數(shù)的對比

仝偉建，祖新，段鵬，楊曉楠，李羽翡

（甘肅省食品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730030）

國標法和紙片法做食品中菌落總數(shù)的對比

仝偉建，祖新，段鵬，楊曉楠，李羽翡

（甘肅省食品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730030）

目的：利用紙片法和國標法同時測試食品中菌落總數(shù)，根據(jù)試驗結果來測試紙片法（非標法）在檢測食品微生物菌落總數(shù)檢驗中的準確性。方法：用紙片法和國標法（GB 4789.2-2010）在同一人員、相同的試驗條件下進行實驗，對所得的結果進行對比分析，測試紙片法在菌落總數(shù)檢驗中的準確性。結果：紙片法所得的結果和國標法結果對比顯示，對于污染嚴重的樣品，兩種方法具有顯著性的差異；對于相對潔凈的樣品，兩種方法的結果不具有顯著性差異。同時，紙片法所需的時間短，能有效地監(jiān)控食品被微生物污染的嚴重程度，但是在精確度上和國標法還是有一定的差距。

國標法和紙片法；食品微生物；檢驗方法對比

隨著人們對食品安全性的重視，應用到食品微生物的檢測手段也越來越多，諸多新型的微生物檢測技術如雨后春筍般涌出,給微生物檢測工作帶來了飛躍式的發(fā)展,使得食品衛(wèi)生檢驗工作得到了良好的改善。如ATP生物發(fā)光技術[1]和全自動微生物檢測法；在培養(yǎng)基中加入14C標記的碳水化合物或鹽類的底物，測量細菌代謝后產(chǎn)生是否產(chǎn)生14CO2的放射測量法；以DNA作為細菌的遺傳分子，在微生物檢測方面有著獨特的優(yōu)勢，目前應用較多的有聚合酶鏈式反應（PCR）[2]和具有多樣化、自動化、微型化等特點的基因芯片技術[3]；利用微生物可以使電惰性底物（如碳水化合物、類脂、蛋白質(zhì)等）代謝成電活性產(chǎn)物（如乳酸鹽、醋酸鹽、氨等）的電阻抗檢測法[4]；以氣相色譜法、mini-VIDAS法以及Vietk-AMS法為主的儀器分析檢測的方法[5]；流式細胞術等。這些技術對檢驗人員的素質(zhì)、檢驗儀器、設備等要求較高，有些方法用在微生物檢驗中還不太成熟[6]，目前最常用的還是形態(tài)學和生理生化的方法，但是這些方法操作繁瑣、所需時間長、準備工作和后期廢棄物處理工作繁重，且需大量的專業(yè)技術人員。而紙片法由于使用方便、操作簡單，又能有效縮短檢驗周期而被廣泛地應用于監(jiān)控食品被微生物污染的程度。但是紙片法所得的結果究竟準不準確？它和國標法所得的結果的差距又是多少？下面我們就來研究一下紙片法在食品菌落總數(shù)檢驗中的準確性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑及儀器

平板計數(shù)瓊脂（北京陸橋，批號：150504）,菌落總數(shù)測試片（國產(chǎn)某廠家），恒溫恒濕培養(yǎng)箱，超凈工作臺。

1.1.2 樣品

為確保試驗結果的覆蓋性和準確性，我們抽取容易受污染的食品（豆腐、肉）和相對較潔凈的食品（純凈水）各51個樣本。

1.2 方法

1.2.1 國標法

按照國標“菌落總數(shù)的測定”規(guī)定的方法進行試驗[7]。

（1）肉、豆腐樣品處理方法：稱取25 g樣品放入盛有225mL稀釋液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1～2min，制成1∶10的樣品勻液。

（2）純凈水樣品處理方法：瓶口用酒精棉球消毒后，以無菌吸管吸取25 mL樣品置盛有225 m L磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預置適當數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1∶10的樣品勻液。

（3）用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1∶10樣品勻液1 m L，沿管壁緩慢注于盛有9 m L稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支無菌吸管反復吹打使其混合均勻，制成1∶100的樣品勻液。

（4）按以上操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1mL無菌吸管或加樣槍槍頭。

（5）根據(jù)對樣品污染狀況的估計，選擇2～3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進行10倍遞增稀釋時，吸取1 mL樣品勻液于無菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿。同時，分別吸取1 m L空白稀釋液加入兩個無菌平皿內(nèi)作空白對照。

（6）及時將15～20 mL冷卻至46℃的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（可放置于46℃±1℃恒溫水浴箱中保溫）傾注平皿，并轉動平皿使其混合均勻。

（7）待瓊脂凝固后，將平板翻轉，36℃±1℃培養(yǎng)48 h±2 h。

（8）如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長的菌落時，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約4 mL），凝固后翻轉平板，按（7）條件進行培養(yǎng)。

（9）按照GB 4789.2-2010中6.3要求的方法對平板進行計數(shù)。

（10）按照GB 4789.2-2010中7要求的方法進行結果計算。

1.2.2 紙片法

液體各取1m l，分別加入到2個測試片中；固體取25 g加入到225m l的0.85%的生理鹽水中，均質(zhì)2min（下一步驟同液體樣品）。36℃培養(yǎng)18～24 h。計數(shù)和結果計算均按照說明書的要求進行。

2 結果

三種樣品不同檢驗方法結果見表1。

表1 三種樣品不同檢驗方法結果

3 分析與討論

對于污染嚴重的樣品，結果通過統(tǒng)計學計算得出兩種方法具有顯著性差異，國標法的結果要明顯高于紙片法；對相對潔凈的樣品，紙片法和國標法的結果有非常好的相關性，兩者之間無顯著性差異；紙片法培養(yǎng)時間對結果有明顯影響。培養(yǎng)時間過長,紙片容易干，細菌較多的樣品菌落可能重疊在一起，對結果分析的準確性有很大影響，個人認為14 h～16 h是比較理想的培養(yǎng)時間。

GB 4789.2-2008中有紙片法測菌落總數(shù)的方法，但是到2010年標準更新了以后08版的菌落總數(shù)的測定方法就被取消了，然而GB 4789.2-2003的標準仍然沒有作廢，這也從另外一個角度說明了紙片法具有一定的局限性。

紙片法和傳統(tǒng)的國標法比較，省略了試驗前期的準備工作和后期的廢棄物處理工作，大大節(jié)約了工作時間和勞動強度，并且在檢驗流程、培養(yǎng)時間等環(huán)節(jié)都更為簡便、快速[8]，用于測試相對潔凈的食品被細菌污染的程度還是值得使用的[9]。由于紙片檢測法，操作簡便，耗時較短，對于檢測潔凈度較高的食品無顯著差異，所以對于一些企業(yè)，在保證正常國標法進行出廠檢驗的同時，可以將紙片法作為一種監(jiān)測手段。不僅可以對最終產(chǎn)品（成品）進行檢測，也可對生產(chǎn)過程中各個階段的半成品進行監(jiān)測，通過產(chǎn)品的出廠檢驗與紙片法對生產(chǎn)產(chǎn)品的過程檢測相結合，對于保證生產(chǎn)各階段的質(zhì)量控制，提高最終產(chǎn)品的質(zhì)量，是大有裨益的。

［1］ 孫鳳霞.探析食品微生物檢驗技術的研究進展［J］.中國醫(yī)藥指南,2014，12（23）：69-70.

［2］ 路則寶，白現(xiàn)廣.分子生物學技術中微生物檢驗中的應用研究進展［J］.紅河學院學報，2013，11（2）：61-63.

［3］ 熊強，史純珍，劉釗.食品微生物快速檢測技術的研究進展［J］.食品與機械，2009，17（5）：788-789.

［4］ 劉濱思.微生物檢驗技術的研究進展［J］.食品科學，2013，01（09）：38.

［5］ 王雪麗，蔡麗萍.微生物檢驗技術研究的進展［J］.化工管理，2015（13）：177.

［6］ 林蕾，張煒.食品微生物檢驗技術的研究進展［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學，2008，15（10）：97-99.

［7］ GB 4789.2-2010.食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定［S］.北京：中國標準出版社，2010.

［8］ 李桂賢，張曉威，金晶.紙片法與平板傾注法檢測菌落總數(shù)試驗報告［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，1991，1（2）：123.2.

［9］ 李洪，龔濤，達永淑，等.紙片探討影響大腸菌群快速紙片法的因素［J］.職業(yè)衛(wèi)生與病傷，2002，17（3）：198-199.

TS207

：A

DOI 10.3969/j.issn.1672-6375.2016.12.010

2016-9-21

仝偉建（1983-），男，漢族，山東金鄉(xiāng)人，研究生，中級獸醫(yī)師，主要從事食品微生物檢驗工作。