抗生素對雞糞厭氧發酵過程影響的實驗研究

范 超，王 欣，劉 偉，高德玉，蘇小紅，秦國輝，劉旭丹，王玉鵬

(黑龍江省科學院科技孵化中心，哈爾濱 150090；黑龍江省能源環境研究院，哈爾濱 150090)

抗生素對雞糞厭氧發酵過程影響的實驗研究

范 超，王 欣，劉 偉，高德玉，蘇小紅，秦國輝，劉旭丹，王玉鵬

(黑龍江省科學院科技孵化中心，哈爾濱 150090；黑龍江省能源環境研究院，哈爾濱 150090)

采用實驗室批式厭氧發酵裝置，在新鮮雞糞中添加不同含量的抗生素后進行高溫厭氧發酵實驗，研究抗生素對雞糞厭氧發酵過程的影響。結果表明:進行單因素實驗時，低濃度抗生素的添加對發酵無明顯抑制，總產氣率變化不大；當土霉素和金霉素含量大于5mg·kg-1、阿莫西林大于10mg·kg-1，總產氣率下降。進行正交實驗研究抗生素的聯合抑制時，土霉素與金霉素對厭氧發酵的影響更為顯著，最佳的因素水平組合為土霉素含量5mg·kg-1、金霉素含量5mg·kg-1、阿莫西林含量10mg·kg-1，此時抗生素對發酵影響最低。

厭氧發酵；抗生素；顯著性

隨著規?；笄蒺B殖業的發展，畜禽糞便帶來的有機固體廢棄物和高濃度有機廢水造成了嚴重的環境污染，成為制約我國畜禽生產的重要因素之一[1-2]。畜禽糞便是一種環境污染物，同時也是一種可利用的資源，因其含有大量有機物質及N、P、K等多種營養成分，經過適當處理后不僅能減少其對環境的污染，得到的副產物還增加了其經濟價值[3]。畜禽糞便無害化處理和資源化利用的主要途徑有發酵生產有機肥及厭氧發酵制取沼氣[4]。厭氧發酵不受含水率影響，還能產生清潔能源，是一種畜禽糞便處理和利用的有效途徑。

近年來，在現代畜禽養殖場中，抗生素被廣泛用來抑制有害細菌的生長、預防和治療畜禽疾病、促進生長等[5]。但由于消化系統的問題，大部分不能被畜禽完全吸收利用，高達60%～90%的抗生素以原樣排泄或排泄之后轉化為母體，在環境中殘留[6]。抗生素不僅是一種難降解的有機物，它的存在還在一定程度上抑制了禽畜糞便的生物處理過程[7]。在畜禽養殖使用的抗生素中，四環素類占的比重較大，可達40%左右，在常見的抗生素藥物中毒性最強，并具有生物累積性。常用的四環素類抗生素有四環素、金霉素、土霉素等[8]。阿莫西林屬于β-內酰胺藥物抗生素，其殺菌機制是抑制細菌細胞壁合成[9]。這些抗生素經畜禽消化后以糞便排出，而采用含有抗生素的畜禽糞便為原料進行厭氧發酵，將關系到厭氧發酵的效率。

本實驗采用養雞場常用的土霉素、金霉素和阿莫西林，研究了這3種抗生素的不同含量對雞糞厭氧發酵過程的影響。研究結果將有助于排除抗生素對厭氧發酵處理的障礙，避免和消除抗生素在厭氧發酵中的抑制作用，保證以雞糞為原料的沼氣工程正常運行。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本實驗選用的發酵原料是新鮮雞糞便，取自哈爾濱周邊養殖場。接種物為上一次發酵后的消化液。

1.2 試驗設計

1.2.1 試驗裝置設計和藥品

實驗裝置采用1 000mL 錐形瓶作為厭氧發酵反應容器，發酵有效容積500mL，置于恒溫水浴鍋中，溫度控制在55±1℃。發酵過程中產生氣體通過導氣管進入裝有水的集氣瓶中，以排水法收集。

實驗藥品：金霉素、土霉素和阿莫西林的純度大于99%；甲醇、Na2HPO4、Na2EDTA、檸檬酸、三氯乙酸、草酸甲醇等。

1.2.2 試驗方法設計

本實驗設定發酵料液的TS為8%，發酵溫度為55℃，接種物添加量為有效容積的30%。

抗生素含量測定采用高效液相色譜法(HPLC)：選用不同濃度的標準工作液，以濃度(x)為橫坐標，以相應峰面積(y)為縱坐標做回歸分析，得到3種抗生素的標準曲線和相關系數。將待測樣品的峰面積的平均值代入標準曲線，即可得出待測樣品的含量。

單因素實驗：根據原料固含量加水調節至發酵料液總固體含量為 8%，發酵溫度為55±1℃，發酵周期20d，分別研究不同劑量的土霉素、金霉素和阿莫西林與產氣率之間的變化關系，加量梯度為：0、2 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg。

正交實驗：根據單因素實驗結果，選定各因素的水平，對加土霉素、金霉素、阿莫西林三因素選用L9(34)表，研究抗生素聯合作用的正交實驗，正交因素水平見表1。

表1 正交因素實驗水平表
Tab.1 Effect factors and their level on orthogonal test

水平因 素A土霉素含量mg·kg-1B土霉素含量mg·kg-1C土霉素含量mg·kg-11225255103101020

1.3 實驗指標測定

酸堿度通過pH計測得，氨氮指標采用納氏試劑分光光度法測定，具體方法參照國標法[10]。

2 結果與分析

本實驗所采用的雞糞的基本理化性質見表2。

表2 雞糞基本理化性質
Tab.2 Physical and chemical properties of chicken manure

項目TS/%VS/%TOC/%TN/%C/NS/%P(P2O5)/%NH+4-N/mg·L-1雞糞29.0219.8610.41.089.650.10.22530

添加抗生素后經HPLC測得抗生素終濃度見表3。

表3 抗生素終濃度
Tab.3 Antibiotics final concentration

土霉素含量mg·kg-1土霉素含量mg·kg-1土霉素含量mg·kg-1000222555101010202020

2.1 單因素試驗結果及分析

A．土霉素含量對總產氣量的影響結果。

圖1 土霉素含量對總產氣率的影響Fig.1 Accumulated methane production with the treatment of oxytetracycline

由上圖可知，土霉素含量在0～5mg·kg-1，總產氣量呈穩步升高趨勢，土霉素含量達到5mg·kg-1時，得到最大產氣量15.32L·kg-1。土霉素含量在5～20mg·kg-1時，總產氣量下降，pH值也明顯下降，土霉素含量達到20mg·kg-1時，pH值為6.3，這時反應器偏酸。

B.金霉素含量對總產氣量的影響結果。

圖2 金霉素含量對總產氣量的影響Fig.2 Accumulated methane production with the treatment of chlortetracycline

由圖2可知，金霉素含量在0～5mg·kg-1，總產氣量平穩微有上升，金霉素含量達到5mg·kg-1時，得到最大產氣量15.06L·kg-1。金霉素含量在5～20mg·kg-1時，總產氣量下降，pH值也明顯下降，土霉素含量達到20mg·kg-1時，pH值為6.2，反應器偏酸。

C.阿莫西林含量對總產氣量的影響結果。

圖3 阿莫西林含量對總產氣量的影響Fig.3 Accumulated methane production with the treatment of amoxicillin

由圖3可知，阿莫西林含量在0～10mg·kg-1，總產氣量平穩微有上升趨勢，阿莫西林含量達到10mg·kg-1時，得到最大產氣量15.35L·kg-1。金霉素含量在10～20mg·kg-1時，總產氣量下降，pH值也明顯下降，土霉素含量達到20mg·kg-1時，pH值為6.3，偏酸。

綜上所述，在本實驗中抗生素濃度較低時，不會對微生物的活性有抑制，甚至低劑量的抗生素會促進一些酶類的產生從而促進產氣；但是隨著抗生素濃度的增加，過量的抗生素就會抑制產甲烷菌的活性從而使產氣量下降。這和微生物自身性質、抗生素的濃度、與抗生素的接觸時間等有關。而雞糞中含有大量的碳水化合物為產酸菌提供了充足的并可以直接利用的營養，所以產酸菌大量繁殖，導致pH值偏低。

2.2 正交試驗結果及分析

表4 正交實驗方案及結果
Tab.4 The orthogonal test layout and results

實驗號A土霉素/mg·kg-1B金霉素/mg·kg-1C阿莫西林/mg·kg-1e1總產氣率/L·kg-111(2)1(2)1(5)18.62212(5)2(10)214.33313(10)3(20)312.9142(5)12313.765223115.776231213.7873(10)13212.378321314.069332114.71K135.85934.74936.45939.099K243.31144.16042.80140.479K341.13941.40041.04940.731k111.95311.58312.15313.033k214.43714.72014.26713.493k313.71313.80013.68313.577R2.4843.1372.1140.544優水平A2B2C2

由表4的極差分析可知，各因素對總產氣率影響的大小順序為B>A>C，即金霉素>土霉素>阿莫西林。最佳的因素水平組合為A2B2C3，即土霉素含量5mg·kg-1、金霉素含量5mg·kg-1、阿莫西林含量10mg·kg-1。由表5的顯著性分析可知，土霉素和金霉素對厭氧發酵的影響顯著高于阿莫西林。這3種抗生素的按比例配合使用具有協同效果，在抑制畜禽體內有害微生物生長繁殖的同時不會降低產氣量。金霉素和土霉素對細菌有著更強的作用，因此對發酵的影響也比較顯著。

表5 正交實驗顯著性分析
Tab.5 Significance analysis of orthogonal test

因素偏差平方哈自由度F比F臨界值顯著性土霉素9.788219.04319.000*金霉素15.599230.34819.000*阿莫西林7.147213.90519.000誤差0.512

3 結論

本實驗選取了兩類抗生素，即四環素類的土霉素和金霉素及β-內酰胺藥物阿莫西林，通過HPLC測定這兩類抗生素的不同濃度，通過單因素實驗確定了正交試驗的合理范圍，進行以四環素類抗生素含量為2 mg·kg-1、5 mg·kg-1、10mg·kg-1，阿莫西林含量為5 mg·kg-1、10 mg·kg-1、20mg·kg-1的正交實驗，確定了在抗生素存在下厭氧發酵的最優因素水平為土霉素、金霉素含量分別為5mg·kg-1和阿莫西林含量為10mg·kg-1，這種組合不會對發酵產氣產生抑制。

綜上所述，研究抗生素對厭氧發酵的影響對進一步提高我國的畜禽糞便綜合處理效率，實現沼氣工程的工業化生產，必將帶來明顯的環境效益、經濟效益和社會效益，以期能為以畜禽糞便作為發酵原料的大型沼氣工程提供一定的基礎參考數據和經驗。

[1] 陳超，阮志勇，吳進，等.規?；託夤こ陶右壕C合處理與利用的研究進展[J].中國沼氣，2013，31(1)：25-28，43.

[2] 徐秀銀.規?；B豬場沼液的利用現狀與對策[J].江蘇農業學，2010，(06)：521-522.

[3] 陶秀萍，董紅敏，尚斌. 新鮮豬沼液和牛沼液對農作物病原真菌抑制作用的比較研究[J].農業環境科學學報，2011，(07)：1443-1449.

[4] 杜麗芳，王艷，廖新俤，等.不同碳氮比和接種量對蛋雞糞厭氧發酵氨氮抑制效應的影響[J].中國家禽，2014，12(36)：28-33.

[5] 金明均，申春玉.畜禽養殖中抗生素使用的現狀及建議[J].養殖技術顧問，2014，(10)：268.

[6] 楊曉洪，王娜，葉波平.畜禽養殖中的抗生素殘留以及耐藥菌和抗性基因研究進展[J].藥物生物技術，2014，(06)：583-588.

[7] 盧成洪，牛冬杰，付鐘，等.抗生素桿菌肽鋅對雞糞厭氧水解酸化的影響[J].環境污染與防治，2012，34(5)：79-82.

[8] 張發旺，雞蛋中土霉素/四環素/金霉素殘留的HPLC檢測方法的研究[D].鄭州：河南農業大學，2008.

[9] 蘇亮，何義剛，謝光武.獸用β-內酰胺類抗生素耐藥性分析[J].中國獸醫醫藥雜志，2011，30(2)：75-77.

[10] 國家環境保護總局.水和廢水監測分析方法[M].北京：中國環境科學社，2002.

Study on the impact of the antibiotics on fowl manure anaerobic fermentation

FAN Chao, WANG Xin, LIU Wei, GAO De-yu, SU Xiao-hong, QIN Guo-hui, LIU Xu-dan, WANG Yu-peng

(Science and Technology Incubation Center, Heilongjiang Academy of Sciences, Harbin 150090, China;Heilongjiang Energy and Environment Research Institute, Harbin 150090, China)

Anaerobic fermentation device is used for high-temperature anaerobic fermentation experiments under different type of antibiotics with fresh fowl manure, and the impact of the antibiotics on anaerobic fermentation to produce biogas is studied in this paper. The results showed that the addition of low concentration of antibiotic has no obvious inhibition on fermentation and the total air rate changes little under the single factor experiments; when the content of oxytetracycline and chlorotetracycline for more than 5mg·kg-1, at the same time, the content of amoxicillin for 10mg·kg-1, the total air rate decrease. Batch tests based on orthogonal test were adopted. Oxytetracycline, chlorotetracycline, amoxicillin which were the mostly common antibiotocs used in the treatment of chicken disease were chosen in the experiment. The results showed that the menthane production rate was affected mostly by the combination of 5mg·kg-1of oxytetracycline, 5mg·kg-1of chlorotetracycline 10mg·kg-1of amoxicillin.

Anaerobic fermentation; Antibiotics; Significance

2016-10-08

范超(1990-)，女，碩士，研究實習員。

S216.4；X713

A

1674-8646(2016)22-0001-04