花粉介導的花青素調(diào)節(jié)基因NtAn2轉(zhuǎn)化玉米研究

郭天璐，張歡歡，杜建中，郝曜山，崔貴梅，王亦學，孫毅，

（1.山西大學生物工程學院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究中心，山西太原030031）

花粉介導的花青素調(diào)節(jié)基因NtAn2轉(zhuǎn)化玉米研究

郭天璐1，張歡歡2，杜建中2，郝曜山2，崔貴梅2，王亦學2，孫毅1，2

（1.山西大學生物工程學院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究中心，山西太原030031）

利用超聲波輔助花粉介導法將花青素基因NtAn2導入玉米自交系鄭58，并優(yōu)化超聲波輔助花粉介導基因轉(zhuǎn)化方法的遺傳轉(zhuǎn)化體系。以新鮮的鄭58玉米花粉為試驗材料，檢測其在不同濃度的蔗糖溶液中的體外萌發(fā)率；通過正交試驗設計，對超聲波處理功率、處理時間、處理次數(shù)3個因素進行優(yōu)化，以確定最優(yōu)轉(zhuǎn)化組合；對收獲的籽粒進行PCR檢測。結(jié)果表明，玉米自交系鄭58的花粉最適宜的蔗糖溶液濃度為20%；超聲波處理最佳參數(shù)為：處理功率150 W，處理時間5 s/次，處理次數(shù)6次；PCR分子檢測表明，其中有3粒含有陽性條帶，且這3粒中有2粒呈紫色，初步證實，NtAn2已被整合到玉米基因組中，并且可以被用于對轉(zhuǎn)化子的直觀篩選。研究確立了超聲波輔助花粉介導法遺傳轉(zhuǎn)化的最佳體系，為提高該植物基因轉(zhuǎn)化方法的效率奠定了基礎。

超聲波；花粉介導；轉(zhuǎn)基因；玉米

作物轉(zhuǎn)基因研究對于提高其產(chǎn)量、抗病蟲能力、抗逆性和改進品質(zhì)等方面具有重要意義。但由于該項技術在食品和環(huán)境安全方面尚存在較大爭議，因此，在更大范圍內(nèi)應用還存在一定的障礙。產(chǎn)生爭議的原因之一是，轉(zhuǎn)基因操作中常用的選擇標記基因一般為對除草劑或抗生素有抗性的基因及一些能產(chǎn)生對植物細胞有毒害作用的代謝產(chǎn)物的基因[1]。

花青素（Anthocyanin）是一類廣泛存在于植物中的天然水溶性色素，屬于黃酮酚類化合物。花青素具有多種植物生理功能，其不僅可以幫助植物授粉、傳播種子，同時也可以保護果實，幫助其抵御紫外線、強光及低溫等自然傷害[2]。花青素具有抗氧化作用，能夠抑制人體內(nèi)膽固醇沉積，預防動脈硬化，抗衰老，維持血壓穩(wěn)定，預防血管疾病，改善肝功能等。因此，近年來，花青素在醫(yī)療、食品以及安全色素等方面都成為人們研究的熱點。從轉(zhuǎn)基因植物營養(yǎng)和安全性的方面來考慮，用花青素作為標記對人和動物是有益而無害；由于其在植物中廣泛存在，它對自然環(huán)境也是安全的。

目前，轉(zhuǎn)基因方法仍然以農(nóng)桿菌介導法和基因槍法為主，但這2種方法均須經(jīng)過組織培養(yǎng)過程。農(nóng)桿菌的宿主植物大多為雙子葉植物，因此，在使用農(nóng)桿菌介導法進行基因轉(zhuǎn)化時，常常受到這種宿主特異性的限制，導致有些植物種特別是一些重要的禾本科植物和豆科植物的轉(zhuǎn)基因研究進展緩慢。而基因槍轉(zhuǎn)化法則由于一些植物種或品種的組織培養(yǎng)再生困難而具有很大的局限性。同時，由于植物組織培養(yǎng)過程中易造成體細胞變異、再生苗移栽過程中夭亡等，使本來就不高的轉(zhuǎn)化率又大打折扣。這些都極大地限制了轉(zhuǎn)基因技術的廣泛應用。因此，不需要繁雜的植物組織培養(yǎng)過程，且操作簡單、高效的轉(zhuǎn)基因方法是諸多研究者一直努力尋求的目標。

花粉介導轉(zhuǎn)基因方法的提出則引起了許多研究者的關注及興趣[3]，其操作簡便、成本低、避免了組織培養(yǎng)的繁雜過程，且無基因型依賴。該方法以花粉這一天然轉(zhuǎn)化載體實現(xiàn)外源基因轉(zhuǎn)化，是我國具有自主知識產(chǎn)權的轉(zhuǎn)基因技術。目前，這一轉(zhuǎn)基因技術已在玉米、油菜、高粱、花生、野罌粟等植物上得到了成功的應用[4-8]。超聲波輔助花粉介導法的關鍵是既要兼顧花粉的活力，同時又要將外源DNA導入花粉，使其隨花粉的萌發(fā)導入植物胚囊，參與有絲分裂，最后直接得到轉(zhuǎn)基因種子[9]。因此，花粉體外萌發(fā)試驗對利用花粉作為載體介導植物的轉(zhuǎn)基因方法中各項參數(shù)的建立具有非常重要的意義。

本研究將含有花青素表達基因NtAn2的植物表達載體通過超聲波輔助花粉介導法導入玉米，在超聲波處理前后分別檢測花粉的生活力，以優(yōu)化花粉處理體系中的各項參數(shù)，從而達到對試驗條件的優(yōu)化、提高轉(zhuǎn)化效率的目的。本研究所采用的花粉介導法是一種經(jīng)濟、有效、實用的轉(zhuǎn)化方法，同時利用花青素作為直觀可視標記的特點，也可大大地提高轉(zhuǎn)基因篩選的效率。

1 材料和方法

1.1 材料

供體材料：選用玉米（Zea mays L.）自交系鄭58（5月上旬播種，盛花期始于7月中旬），在玉米散粉期收集試驗所需花粉，該自交系材料由山西省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究中心提供。

受體材料：植物表達載體為pCAMBIA2300，含有卡那霉素篩選基因和目的基因NtAn2（圖1），由美國肯塔基大學植物與土壤系袁凌教授提供。

1.2 方法

1.2.1 花粉體外萌發(fā)培養(yǎng)基制備研究使用的是已優(yōu)化的花粉粒培養(yǎng)基配方[9-10]，可以促進花粉的萌發(fā)和生長，且存活率較高，配方如下：蔗糖，50 mg/L H3BO3，300 mg/L CaCl2，200 mg/L MgCl2，100 mg/L KNO3和35 mg/L赤霉素。

1.2.2 花粉體外萌發(fā)蔗糖濃度的優(yōu)化蔗糖溶液在花粉介導轉(zhuǎn)基因方法的試驗中起著至關重要的作用，它既可維持花粉細胞的正常滲透壓，同時又可提供花粉需要的碳源。蔗糖溶液作為媒介使花粉與外源DNA充分接觸。不同的植物品種和環(huán)境條件對花粉所需蔗糖濃度存在差異。試驗設置0，10%，15%，20%，30%，40%，50%共7個蔗糖溶液梯度；取新鮮玉米花粉0.2 g放在一定濃度的蔗糖溶液中，室溫靜置2 h，顯微鏡下觀察花粉的萌發(fā)情況，隨機選取8個視野的花粉粒進行計數(shù)。

花粉萌發(fā)率＝萌發(fā)花粉粒個數(shù)/總花粉粒數(shù)×100%。

1.2.3 轉(zhuǎn)化處理花粉的超聲波參數(shù)的優(yōu)化Joersbo[11]研究表明，超聲波處理時瞬間的空化作用可使得外源DNA進入花粉，在轉(zhuǎn)化過程中，超聲波處理參數(shù)是影響花粉活力和轉(zhuǎn)化效率的關鍵。處理強度過高，會影響花粉的萌發(fā)，導致萌發(fā)率降低并直接影響結(jié)實率；處理強度過低，外源基因則不能轉(zhuǎn)化花粉，使轉(zhuǎn)化率降低。為了探討超聲處理與花粉萌發(fā)之間的相關性，采用正交設計，包括超聲波處理時間、超聲波功率、超聲波處理次數(shù)3個因素，每因素3個水平（表1），試驗采用L9（34）正交表，共有9個處理，每個處理3次重復。取新鮮花粉0.2 g懸浮于20 mL的1.2.2試驗所得最佳濃度的蔗糖溶液中，在超聲波處理后，室溫靜置2 h后對其在光學顯微鏡下觀察。

表1 超聲波處理正交試驗因素與水平

1.2.4 轉(zhuǎn)化方法將玉米自交系鄭58于2014年5月上旬播種，7月上中旬開花抽絲前將雌穗套袋隔離。在盛花期的10：00—12：00取當日散出的新鮮花粉，并將其置于20 mL的20%的蔗糖溶液中，并在一定的超聲波處理后加入質(zhì)粒DNA再進行第2輪超聲波處理；然后將處理過的花粉涂抹于之前套袋隔離的玉米雌穗花絲上，并套袋掛牌標記。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因植株DNA提取及PCR檢測用CTAB法提取玉米葉片的總DNA，用提取的DNA進行PCR擴增，以含目的基因的質(zhì)粒作為陽性對照，以非轉(zhuǎn)基因的植株葉片總DNA作為陰性對照。根據(jù)NtAn2基因序列設計特異性引物序列：上游引物為5′-ATGAATATTTGTACTAATAAG-3′；下游引物為5′-TCAACTGAGAAGTGGCATTTC-3′。PCR反應體系為20 μL。PCR擴增程序：94℃預變性10 min；94℃變性40 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃終延伸10 min。對PCR擴增產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉體外萌發(fā)蔗糖濃度的優(yōu)化

適當濃度的蔗糖溶液作為介質(zhì)既可以保證花粉的正常膨壓，又能促進其萌發(fā)。由表2可知，當蔗糖濃度＜20%時，隨著蔗糖濃度的升高，花粉體外萌發(fā)的數(shù)量增加；當蔗糖濃度達到20%時，花粉的萌發(fā)率達到了最大，平均萌發(fā)率達到76.49%；之后隨著蔗糖溶液濃度的升高，花粉萌發(fā)率呈下降趨勢。當蔗糖溶液濃度達到30%時，花粉出現(xiàn)了大量的質(zhì)壁分離，破裂較多。由此可知，當溶液濃度＞20%時對萌發(fā)起抑制作用，且各蔗糖溶液濃度對花粉萌發(fā)率的影響差異顯著（P＜0.05）。可見，蔗糖溶液濃度是影響花粉體外萌發(fā)率的重要因素。

表2 玉米花粉在不同濃度蔗糖溶液中的體外萌發(fā)

2.2 花粉體外萌發(fā)超聲波功率的優(yōu)化

超聲波處理是利用超聲波瞬間釋放的高能增加花粉通透性，使其處于感受態(tài)，以促進外源DNA進入花粉。但超聲波處理對花粉的損傷較嚴重，會影響結(jié)實率。因此，應選擇適宜的超聲波處理參數(shù)（強度、時間、次數(shù)）以兼顧花粉的活力及外源DNA的導入。從表3可以看出，超聲波各參數(shù)對花粉體外萌發(fā)率影響程度的大小順序是：超聲波次數(shù)＞超聲波功率＞超聲波時間。進一步對正交試驗結(jié)果進行方差分析，其結(jié)果與直觀分析結(jié)果一致，影響花粉體外萌發(fā)率的各因素中超聲波的次數(shù)及超聲波的功率都呈顯著差異，而超聲波的處理時間5，10，15 s之間差異不顯著（表4）。

表3 不同超聲波處理對花粉萌發(fā)率影響的直觀分析

表4 超聲波處理對花粉萌發(fā)率影響的方差分析

2.2.1 超聲波功率對花粉體外萌發(fā)的影響由表5，6可知，隨著超聲波功率的加強，花粉的體外萌發(fā)率呈下降趨勢，平均萌發(fā)率從4.78%下降到0.89%，且呈顯著相關（P＜0.05）。不同超聲波功率間多重比較（LSD）結(jié)果說明，隨著超聲波的強度加大，花粉的萌發(fā)率都會下降，超聲波功率為100 W時，花粉體外萌發(fā)率達到最佳，且與功率為150 W之間差異不顯著，但與200 W之間的差異顯著（表6）。

表5 超聲波功率對花粉體外萌發(fā)率影響的方差分析

表6 超聲波功率對花粉體外萌發(fā)率影響的多重比較（LSD）

2.2.2 超聲波時間對花粉體外萌發(fā)的影響從圖2可以看出，當超聲波的處理時間從每次5 s增加到15 s時，花粉的體外萌發(fā)率呈下降趨勢；當超聲波處理時間為5 s/次時，花粉體外萌發(fā)率均值最高，為4.44%。超聲波處理時間對花粉體外萌發(fā)率影響方差分析表明，不同的超聲波處理時間對花粉體外萌發(fā)率存在一定的差異，但未達到顯著水平（P＞0.05）（表7）。

表7 超聲波處理時間對花粉體外萌發(fā)率影響的方差分析

2.2.3 超聲波處理次數(shù)對花粉體外萌發(fā)的影響

由表8，9可知，不同的超聲波處理次數(shù)對花粉的體外萌發(fā)率影響差異顯著（P＜0.05），當超聲波的處理次數(shù)為6次時，花粉的平均體外萌發(fā)率最高，為5%；隨著超聲波次數(shù)的增加，花粉的體外萌發(fā)率呈下降趨勢。且超聲波次數(shù)為6次與18次間差異顯著（P＜0.05），方差分析及多重比較結(jié)果顯示，超聲波的處理次數(shù)以6次為宜。

表8 超聲波處理次數(shù)對花粉體外萌發(fā)率影響的方差分析

表9 超聲波處理次數(shù)對花粉體外萌發(fā)率影響的多重比較（LSD）

2.3 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測

從收獲的269個籽粒的后代植株中隨機選擇100個單株，提取葉片DNA進行PCR檢測，并設有陽性對照（質(zhì)粒DNA）和陰性對照（未轉(zhuǎn)化株）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有3個單株呈陽性，其中包括2粒呈紫色的籽粒后代。PCR擴增結(jié)果（圖3）表明，轉(zhuǎn)化植株1，7，17可以擴增出特異性條帶，盡管泳道1的擴增條帶不明顯，但可以看出，其與陽性質(zhì)粒條帶大小一致；而非轉(zhuǎn)化陰性對照未擴增出相應條帶。初步證明，外源基因已被整合到玉米的基因組中。且這3株的超聲波處理參數(shù)為：超聲波處理功率150 W，處理時間5 s/次，處理次數(shù)6次。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，最優(yōu)花粉處理體系為：20%的蔗糖溶液，超聲波功率150 W，超聲時間5 s/次，超聲次數(shù)6次。雖然在花粉體外萌發(fā)試驗中超聲波功率為100 W時花粉活力最優(yōu)，但方差分析和多重比較結(jié)果表明，功率100，150 W時對花粉活力的影響差異不顯著，因此，兼顧超聲波對轉(zhuǎn)化效率的作用最終選擇花粉處理為功率150 W。

玉米是我國重要的糧食、飼料和生物能源作物，其花粉量大且較容易獲得，非常適用于花粉介導法。將花粉作為接受外源基因的載體時，花粉細胞很容易在溶液中吸脹破裂而失去活性；在高濃度溶液中因反滲作用會產(chǎn)生嚴重的質(zhì)壁分離現(xiàn)象，同樣會影響花粉的萌發(fā)。因此，花粉介導轉(zhuǎn)化的關鍵是要保證花粉的活力，使其保持一定的離體萌發(fā)率[12]。蔗糖溶液既可以產(chǎn)生一定滲透壓、保持花粉正常的膨壓，又能促進其萌發(fā)[13]。本試驗通過不同濃度的蔗糖溶液對比試驗，確定當蔗糖溶液濃度達到20%時花粉的體外萌發(fā)率最高。

Sanford等[14]、Booy等[15]都曾試圖以花粉作為載體進行轉(zhuǎn)化，但未獲得成功。主要原因可能有2個：一是花粉的外壁比較堅硬，外源DNA很難進入花粉；二是由于外源DNA易被核酸酶降解。Joersbo等[16-17]、Xu等[18]研究結(jié)果表明，超聲波可以促使外源DNA的轉(zhuǎn)移。超聲波處理是利用超聲波高能和空化作用，使花粉處于感受態(tài)，進而使外源DNA更容易進入花粉粒中，之后再隨著花粉管的生長進入到植物雌配子體胚囊中，參與合子形成，從而實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。在使用超聲波花粉介導轉(zhuǎn)基因方法時，超聲波處理參數(shù)（功率、時間、次數(shù)）對提高外源基因的轉(zhuǎn)化效率、并降低花粉破碎率至關重要。綜合考慮這3個因素，本研究利用3因素3水平正交設計篩選出玉米花粉最佳超聲波處理參數(shù)為：超聲波處理功率150 W、處理時間5 s/次、處理次數(shù)6次。

本研究建立的玉米超聲波花粉介導轉(zhuǎn)化體系，對于提高玉米花粉介導植物基因轉(zhuǎn)化效率研究提供了參考。

在轉(zhuǎn)基因的過程中，得到轉(zhuǎn)基因植株的數(shù)量取決于外源基因整合到目標基因的能力及轉(zhuǎn)基因檢測的效率[19]。因此，越來越多的科研工作者開始關注花青素基因，將其作為一種可視的選擇基因，既無害健康又可以提高篩選轉(zhuǎn)基因植物的效率。Doshi等[20-21]研究發(fā)現(xiàn)，小麥中的B-Peru和C1在組織特異的啟動子驅(qū)動下，可在多種組織中順式表達花青素，并將B-Peru和C1基因作為小麥和黑麥的標記基因。Shelagh等[22]將牽牛花中的CHI作為番茄和煙草的標記基因。

本試驗成功地將外源花青素表達基因NtAn2通過超聲波輔助花粉介導法導入玉米植株中，并獲得紫色籽粒；并對其進行PCR檢測，初步驗證了外源花青素基因已被整合到植物基因組中，這種直觀可視的標記基因可以大大提高轉(zhuǎn)基因檢測的效率，實現(xiàn)當代篩選，從而避免種植大量轉(zhuǎn)化處理當代和后代的種子以及利用抗性篩選標記進行初篩的繁瑣步驟。

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Study on Maize Plant Transformation with Anthocyanin Gene NtAn2by Pollen-mediated Transformation Method

GUOTian-lu1，ZHANGHuan-huan2，DUJian-zhong2，HAOYao-shan2，CUI Gui-mei2，WANGYi-xue2，SUNYi1，2
（1.College ofBio-engineering，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Research Center ofBiotechnology，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China）

In this study,maize inbred Zheng 58 was transformed by the ultrasonication-assisted pollen-mediated transformation method with gene NtAn2 and the study was to optimize pollen-mediated genetic transformation system in maize using ultrasoncation treatment.To test the in vitro germination rate of fresh maize pollen in different concentrations of sucrose solution,three factors of ultrasonic treatment,treatment power,treatment duration and treatment times were optimized through an orthogonal design experiment. Then PCR detection was employed in the harvested seeds.The result showed that the optimum concentration of sucrose solution was 20%.The optimal parameters of the ultrasonication treatment of pollen were determined as follows:ultrasonic treatment power 150 W, processing duration 5 s,and 6 times.Two of the transgenic plants were confirmed by both color selection and PCR detection in the randomly-selected 100 kernels.It was verified that the anthocyanin gene NtAn2 was integrated into maize genome and could be used for visual selection of transformants.The optimized genetic transformation system of maize by pollen mediated-method assisted with ultrasonication treatment was established,which laid a foundation for improvingthe efficiencyofthe method.

ultrasoncation;pollen-mediated;transgene;maize

S513

A

1002-2481（2016）04-0427-06

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.04.01

2016-02-24

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項（2014ZX08003001-002-003）

郭天璐（1991-），女，黑龍江齊齊哈爾人，在讀碩士，研究方向：植物轉(zhuǎn)基因技術。孫毅為通信作者。