滹沱河沿岸野生大豆種子β-伴大豆球蛋白表型的多樣性

郭志芳，田懷東

（山西大學生命科學學院，山西太原030006）

滹沱河沿岸野生大豆種子β-伴大豆球蛋白表型的多樣性

郭志芳，田懷東

（山西大學生命科學學院，山西太原030006）

山西省原平市境內滹沱河沿岸分布有大量野生大豆。野生大豆種子蛋白質類型豐富，是重要的蛋白質資源。大豆種子蛋白質主要包括β-伴大豆球蛋白（7S球蛋白）和11S球蛋白，其中，β-伴大豆球蛋白主要由76 kD的α′，72 kD的α和52～54 kD的β亞基組成。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）技術，篩選400份滹沱河沿岸野生大豆種質，發掘出5種關于β-伴大豆球蛋白的系列表型：對照型、α′亞基分子量偏高型、α′亞基分子量偏低型、β亞基上位缺失型、β亞基缺失型。結果表明，滹沱河沿岸野生大豆種子β-伴大豆球蛋白性狀的多樣性，揭示出野生大豆種子β-伴大豆球蛋白具有復雜的分子構成和遺傳機制。

野生大豆；β-伴大豆球蛋白；多樣性

大豆種子是重要的蛋白質資源，其蛋白質的主要成分是β-伴大豆球蛋白（7S球蛋白）和11S球蛋白，占種子總蛋白含量的70%～80%[1]，對大豆蛋白的營養品質起著決定性作用。11S球蛋白由G1～G5亞基組成，分別由Gy1～Gy5基因所編碼。β-伴大豆球蛋白主要由76 kD的α′，72 kD的α和52～54 kD的β亞基組成，分別由聚合在大豆基因組6個位點上至少15個成員（CG-1～CG-15）的基因編碼而成。11S球蛋白在發育胚細胞的糙面內質網以約60 kD的前體多肽鏈被合成后，經過翻譯后修飾與輸送過程，在PSV中被內切為37～45 kD的酸性和18～20 kD的堿性多肽，形成11S六聚體形態。7S球蛋白前體在糙面內質網上合成后，在內質網膜腔內形成立體構造，經由高爾基體被輸送到蛋白儲藏液泡（PSV）中，進一步被加工成7S三聚體，最終都蓄積在液泡型蛋白體[2-5]。Teraishi等[6-7]研究認為，α′，α和β亞基分別由Cgyl，Cgy2與Cgy3這3個不同的基因控制，而單一顯性基因scg-1控制著它們的蓄積。蓄積的β-伴大豆球蛋白約占大豆種子蛋白含量的30%左右，其生化性狀與理化性質一定程度上決定著大豆蛋白質的營養品質[8-11]。為了全面開展大豆蛋白質營養品質的遺傳育種研究，有必要發掘多樣的大豆蛋白質遺傳資源。

我國是大豆種質資源大國，保有大量的栽培和野生大豆種質資源。這些種質資源是可供多樣球蛋白遺傳資源發掘的有用素材。其中，野生大豆種質資源在性狀多樣性、抗逆抗病性以及適應性等方面，具有栽培大豆無可比擬的優勢。野生大豆起源于我國，是國家重點保護的野生植物資源。從北緯24°左右的廣東、廣西北部地區開始到北緯52°左右的黑龍江畔均有野生大豆的分布[12]。山西省原平市滹沱河流域野生大豆原生境保護區項目于2011年由農業部正式立項[13]，成為國家級野生大豆資源保護區。該區域的野生大豆分布廣、數量多、密度大，主要分布于原平市區東北滹沱河沿岸。截至目前，對該區域野生大豆種子蛋白質的遺傳多樣性研究還未見報道。

近年來，山西大學生命科學學院實驗室啟動了對原平市滹沱河沿岸野生大豆資源狀況及其原生態環境的調查研究。本研究采用SDS-PAGE技術，評價了該區域的400份野生大豆種質資源，旨在發掘出關于β-伴大豆球蛋白的系列表型，為大豆蛋白營養品質的遺傳育種研究提供有用材料。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

在山西省原平市滹沱河沿岸采集400份野生大豆（HTWS1～HTWS400）作為供試材料（表1）。這些材料的種子呈橢圓形，籽粒較小，多為黑色，也有棕色與黃褐色（圖1）。試驗在山西大學進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 野生大豆種子全蛋白的提取參照Tian等[14]的方法提取種子全蛋白。從400份野生大豆種子中每份各取1粒洗凈、烘干，每份種子取1粒粉碎后放入離心管中并按一定比例加入適量的全蛋白提取緩沖液；在漩渦混合儀上振蕩混勻后，12℃，120～150 r/min條件下振蕩6 h；4℃，5 000 r/min條件下離心20 min后取上清液稀釋2.5倍備用。

1.2.2 野生大豆種子β-伴大豆球蛋白的提取參照Liu等[15]的方法，進行β-伴大豆球蛋白的提取。對已通過全蛋白篩選發掘出的特異性代表材料進行β-伴大豆球蛋白的提取。將種子粉碎后按一定比例加入正己烷連續脫脂2次后，在脫脂粉末中加入0.03 mol/L的Tris-HCl（pH值8.5），45℃下振蕩1 h；離心后取出上清液，沉淀在相同條件下重復提取，將2次提取的上清液混在一起；加入1 mol/L SBS至0.03 mol/L，混勻后調pH值至6.4，4℃靜置貯存過夜后離心，取離心后的上清液加入NaCl至0.25 mol/L，調pH值至5.5，室溫下振蕩0.5 h；離心后取上清液，加入等量的超純水混勻；再次離心后，取上清液調pH值至4.8，于冰浴中靜置，看到有沉淀析出后離心，去掉上清液；所得蛋白用超純水清洗后，用全蛋白提取液溶解備用。

1.2.3 SDS-PAGE分析參照文獻[12]的方法，用32%丙烯酰胺、0.8%甲叉雙丙烯酰胺制備凝膠，將上述提取好的全蛋白液適量加樣、電泳。用50%甲醇、10%冰乙酸、0.1%R-250的溶液進行凝膠染色，用25%甲醇、10%冰乙酸的溶液脫色，電泳結束后進行凝膠成像和圖像分析。

2 結果與分析

2.1 基于種子全蛋白SDS-PAGE的原平市滹沱河沿岸野生大豆種質的篩選

通過對400份野生大豆種子全蛋白進行篩選，電泳結果如圖2所示。選取野生大豆種子β-伴大豆球蛋白主要亞基對應條帶無缺失且染色程度相對均勻的種質HTWS-176等作為對照，并發掘出具有5種β-伴大豆球蛋白多樣性表型的系列種質資源:對照型、α′亞基分子量偏低型、α′亞基分子量偏高型、β亞基上位缺失型、β亞基缺失型。

從表2可以看出，大部分為對照型種質，發生頻度最大，為96.25%；HTWS-386的α′亞基分子量偏低，HTWS-395的α′亞基分子量偏高，發生頻度最小，均為0.25%；HTWS-8，HTWS-86，HTWS-79，HTWS-163，HTWS-164的β亞基缺失，發生頻度為1.25%；HTWS-42，HTWS-65，HTWS-70，HTWS-96，HTWS-198，HTWS-241，HTWS-367，HTWS-368的β亞基上位缺失型，發生頻度為2%。供試材料中特異亞基多態性種質發生的頻度較小，為了避免我國大豆蛋白質資源多樣性的消失，有必要在分子水平上對大豆種質種子蛋白質性狀進行更加全面的發掘。

表2 滹沱河沿岸野生大豆種質β-伴大豆球蛋白的多樣表型

2.2 代表性野生大豆種質種子β-伴大豆球蛋白性狀的表征

為了證實這些多樣帶型源于β-伴大豆球蛋白表征的多樣性，提取相關代表性種質的種子β-伴大豆球蛋白進行表型分析，獲得了具有與β-伴大豆球蛋白分子量對應的5種蛋白質帶型的多樣種質（圖3）。結果表明，野生大豆種質種子β-伴大豆球蛋白在亞基組成上具有的多樣性與全蛋白顯示的多樣性一致。進一步使用凝膠成像系統及圖像分析軟件對β-伴大豆球蛋白進行表征，發現對照種質中α′亞基分子量為76 kD，而HTWS-395的α′亞基分子量為77.4 kD，HTWS-386的α′亞基分子量為75.2 kD。對照種質中β亞基相對含量為27%，而HTWS-8的β亞基相對含量為0，HTWS-42的β亞基相對含量12.5%。這些結果可以得出，HTWS-395具有α′亞基分子量偏高、HTWS-386具有α′亞基分子量偏低，HTWS-8具有β亞基缺失，HTWS-42具有β亞基上位缺失的突變性狀。

3 討論與結論

從大豆種質資源中發掘具有不同球蛋白性狀的種質是大豆蛋白質遺傳資源開發的有效途徑。郭順堂等[16]研究發現了β亞基缺失的大豆品種。Hajika等[17]報道了β-伴大豆球蛋白中α′，α和β亞基全部缺失的大豆種質。Takahashi等[18-19]發現了α′和α亞基缺失的種質，還發現了α亞基和β亞基的表達量減少的種質材料。本研究從400份滹沱河沿岸原生態野生大豆種質資源中發掘出5種大豆球蛋白表型，分別為：對照型、α′亞基分子量偏低型、α′亞基分子量偏高型、β亞基上位缺失型、β亞基缺失型。這些表型的變化可能起因于調控β-伴大豆球蛋白合成或蓄積的基因突變。表明大豆球蛋白具有復雜的分子構成及遺傳機制，指出原平市滹沱河沿岸野生大豆種子球蛋白性狀的遺傳多樣性。本研究結果有望為闡明調控β-伴大豆球蛋白性狀表達的遺傳機制及大豆蛋白營養品質的遺傳育種研究提供借鑒。

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Diversity of Phenotypes of β-conglycinin in Seeds of the Wild Soybeans along the Hutuo River

GUOZhi-fang，TIANHuai-dong
（College ofLife Sciences，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

The wild soybeans along the Hutuo River located in Yuanping city of Shanxi province are important protein resources. The main components ofsoybean seed proteins include β-conglycinin（7S globulin）and 11S globulin.β-conglycinin mainly consists of α′subunit of76 kD,α subunit of72 kD and β subunit of52-54 kD.In this study,5 types phenotypes of β-conglycinin,the control type of β-conglycinin,high molecular weight of α′subunit,low molecular weight of α′subunit,upper lacked type of β subunit and lacked type of β subunit,are sought performing SDS-PAGE technique,by analysising 400 wild soybeans germplasms along Hutuo River.The results indicate that the diversityphenotypes ofβ-conglycinin in seeds ofwild soybeans alongthe HutuoRiver and reveale the complexity for molecular-composition and genetic-mechanismofβ-conglycinin in seeds ofwild soybeans.

wild soybean;β-conglycinin;diversity

S565.1

A

1002-2481（2016）04-0452-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.04.07

2016-01-29

山西省科技攻關項目（20130311006-3）

郭志芳（1990-），女，山西朔州人，在讀碩士，研究方向：植物種質創新。田懷東為通信作者。