玻璃化保護液處理下高粱離體花粉的活力解析

李珍，田承華，趙寧，胡振鑫，何祥坤，張秦瑩，于美珍，張生萬，田懷東,3

（1.山西大學生命科學學院，山西太原030006；2.山西省農業科學院高粱研究所，山西晉中030600；3.山西景康農業技術推廣有限公司，山西太原030000）

玻璃化保護液處理下高粱離體花粉的活力解析

李珍1，田承華2，趙寧1，胡振鑫1，何祥坤1，張秦瑩1，于美珍1，張生萬1，田懷東1,3

（1.山西大學生命科學學院，山西太原030006；2.山西省農業科學院高粱研究所，山西晉中030600；3.山西景康農業技術推廣有限公司，山西太原030000）

為了確立可顯著提高高粱花粉體外存活的水性環境條件，設計了離體高粱花粉所處的干燥（CK）、磷酸鹽溶液（PBS）、玻璃化保護液1（PVS1）、玻璃化保護液2（PVS2）、玻璃化保護液3（PVS3）等5種環境；采用TTC法，對4種水性溶液體系中浸漬處理15 min后的高粱花粉和干花粉的存活率進行了比較分析。結果顯示，各狀態下離體高粱花粉存活率大小依次為PBS＜PVS3＜PVS2＜PVS1＜CK；與PBS中的花粉存活率相比，PVS3對花粉存活率提高不顯著，PVS1和PVS2可顯著提高花粉存活率。表明水性環境對離體花粉的活力有顯著的損傷效果；3種保護液中的甘油、乙二醇、二甲基亞砜、蔗糖等對高粱離體花粉活力有保護作用，其中，含有這4種成分的PVS1對水性環境高粱離體花粉的活力保護效果最好。研究結果有望為水性環境下高粱花粉生殖細胞基因的誘變提供技術支撐。

高粱；花粉；玻璃化保護液；離體活力

作物種質資源是人類賴以生存的基礎性生物資源，在農業、釀造、飼料、能源、食品、醫藥等多種領域中被廣泛利用[1]。作物種質資源的創新對于遏制作物品種培育與生產活動中存在的種質多樣性弱化、栽培環境惡化、營養品質單一化等不良趨勢以及滿足作物資源的多樣化社會需求具有重大的現實意義[2]。而人工誘變技術的開發與利用是作物種質創新的一種有效途徑[3-4]。

國內外采用的人工誘變法主要包括重組DNA創制法、物理誘變法與化學誘變法。其中，化學誘變技術是使用烷化劑、疊氮化鈉、堿基化合物等誘變劑處理植株的器官、組織或細胞，從而誘發遺傳物質發生變異，具有操作簡便、成本低、相對安全、染色體損傷小、基因變異率高、突變幅度大等優點[5-7]。所以，在作物育種由基因組學向蛋白組學轉向的新時代，化學誘變技術無疑是一種創制具有良好應用前景的基因誘變技術。截至目前，國內外主要使用EMS[8]，MNU[9]等化學誘變劑，用于水稻、小麥、玉米等農作物的組織器官或受精卵細胞、生殖細胞的誘變處理。其中，對作物花粉的離體誘變處理是提高作物化學誘變效率的一個主要方向。在對花粉的離體誘變處理中，誘變劑發揮效應的溶劑環境主要是有機溶劑環境：Coe[10]首先報道，液體石蠟油可用于短期保存花粉而不影響其生命力；隨后，Neuffer[11]將此發現加以延伸，把石蠟油作為化學誘變劑的載體，處理玉米花粉，獲得成功，突破了化學藥劑不能直接誘變花粉的瓶頸，該方法是當今國外誘變花粉的主要手段之一[12]。但是離體花粉的水性環境誘變處理還未見詳細報道。日本學者Satoh等[13]使用pH值4.8～5.2的MNU磷酸鹽溶液（1.0 mmol/L）、避光條件下對水稻品種（金南風/臺中65號）穗部進行了誘變處理，成功實現了對其受精卵DNA的有效誘變和突變體的開發。經過對比發現，MNU的誘變效率遠遠高于以石蠟油為溶劑載體的EMS的誘變效率[14]。因此，如何提高水性環境體系下花粉的活力，成為進一步開發高效的離體高粱花粉生殖細胞基因MNU誘變技術亟待解決的難題。

高粱是我國重要的旱地農作物之一，開展對其花粉的誘變處理技術，對高粱種質資源創新與優異品種培育具有重要的意義。本研究對預先設計的4種水性環境下離體高粱花粉的存活率進行比較分析，以探索出一種可顯著提高其活力的適宜保護液配方，將為高粱的遺傳育種提供數據及技術支撐。

1 材料和方法

1.1 供試材料

選取高粱m02-16作為供試材料，在山西省農業科學院高粱研究所試驗基地種植，采集盛花期花粉用于試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 用于離體高粱花粉處理的水性環境設計高粱花粉離體處于水性環境時，極易吸水脹破，活力降低。Gayle等[15]報道，甘油（Glycerol）、乙二醇（EG）、二甲基亞砜（DMSO）、蔗糖（Suc）4種成分對身體細胞具有保護作用。馮慧云等[16]報道，Glycerol與水分子具有較好的親和性，并且能在組織細胞外壁形成一層保護膜，有利于減少水分子的侵入和外界的機械損傷，Sommerfeld等[17]報道，EG容易滲透進入細胞，降低胞內鹽溶質濃度，置換部分自由水，發生水合作用。方志聰等[18]報道，DMSO能夠減輕羥基自由基對細胞的破壞，改變生物膜對電解質等的通透性，弱化水分子進入細胞，從而起到保護作用。蔗糖分子量較大，不能滲入細胞內，對于維持細胞內外正常滲透壓、防止細胞過度膨脹具有重要意義[15-18]。根據這些報道，本研究設計磷酸鹽（PBS）與3種保護液（PVS）構建4種水性環境（表1）。

表1 4種水性環境主要配方及組成成分%

1.2.2 各狀態下離體高粱花粉的活力測定采用TTC法測定花粉活力，原理如圖1所示。參考崔桂梅等[19]報道的方法，配制含有0.1 mol/L磷酸鹽的2%TTC溶液（pH值7.2）進行染色，顯微鏡下檢測離體高粱花粉的脹破率和存活率。

花粉脹破率＝破裂的花粉粒數/總的花粉粒數×100%；花粉存活率＝顯紅色的花粉粒數/總的花粉粒數×100%。

1.3 數據分析

采用SPSS 19.0數據軟件對各狀態下離體高粱花粉活力的顯著性進行分析；采用Duccan檢驗法進行P＜0.05水平上的顯著性分析。數據采用平均值±標準差（Mean±SEM）表示。

2 結果與分析

2.1 各狀態下離體高粱花粉活力分析

由表2，3可知，剛收集到的干花粉活力很高，經過PBS處理后，花粉脹破率高達62.33%，存活率急劇降低，僅為33.53%；經3種配方PVS處理后，脹破率均有所下降但存活率有所上升（具體大小表現為CK＞PVS1＞PVS2＞PVS3＞PBS）。其中，研究發現，相應組的脹破率與存活率之和并非為100%，原因是因為數據統計過程中會存在偶然誤差：小于100%是由于有些花粉粒并未著色但是沒有破裂，大于100%是由于有些已著色的花粉粒觀察過程中隨時間推移消耗花粉粒出現破裂。總之，TTC檢測結果說明保護液處理后有助于提高離體高粱花粉存活率。

表2 不同處理下花粉脹破率比較%

表3 不同處理下花粉存活率比較%

2.2 各狀態下離體高粱花粉活力的顯著性分析

使用SPSS 19.0數據分析軟件，對表2，3進行Duncan顯著性分析得出，干花粉和4種水性環境下離體高粱花粉脹破率和存活率的變化特征，如圖2，3所示。

由圖2，3可知，與CK相比，經過PBS處理后離體高粱花粉活力顯著降低，存活率與脹破率呈負相關；經過保護劑處理后，三者活力與PBS相比均有所上升，其中，PVS1，PVS2與PBS相比，對離體高粱花粉存活率的影響均顯著，且PVS1＞PVS2；PVS3與PBS相比，對離體高粱花粉存活率的影響不顯著。說明PVS1配方保護液能夠顯著提高水性環境離體高粱花粉的存活率。

2.3 PBS與PVS1處理離體高粱花粉的形態學分析

PBS與PVS1保護液處理后離體高粱花粉TTC染色結果分別如圖4所示。經PBS浸漬處理后，離體高粱花粉明顯出現大量脹破現象，且花粉內容物外流（如箭頭所示），花粉顆粒呈現黑色或近透明色，說明該條件下高粱花粉存活率極低（圖4-A）。

經PVS1保護液處理后，高粱花粉雖仍有內容物外流現象，但脹破情況出現明顯改觀，花粉顆粒大部分呈現出洋紅色，形態保持相對完整（如箭頭所示），存活率提高（圖4-B）。從形態上分析表明，PVS1保護液處理能夠顯著提高水性環境下離體高粱花粉的存活率。

3 結論與討論

據報道，Glycerol，EG，DMSO，Suc等4種物質對細胞具有保護作用[15-18]。本研究結果表明，含有Glycerol，EG，DMSO或Suc成分的PVS溶液可不同程度保護離體花粉活力；其中，混合使用4種成分的PVS1保護液可顯著降低水分對離體高粱花粉的損傷，對花粉活力的保護效果最好。期望在此配方的基礎上，能進一步對化學誘變處理環境進行全面分析、設計與實施。截至目前，作物組織細胞的化學誘變處理環境主要有有機溶劑環境與水性環境。EMS-石蠟油是當今國內外主要使用的有機誘變環境；而Satoh等[20]的水稻受精卵基因的MNU誘變研究表明，MNU是一種水性環境下對細胞基因的高效誘變劑。本研究結果有望為水性溶液環境下的高粱生殖細胞基因的誘變提供借鑒，對于高粱的種質創新與優異品種培育具有重要的意義。

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Analysis on Sorghum Pollens Viabilityin vitroTreated in Protective Solution of Vitrification

LI Zhen1，TIANCheng-hua2，ZHAONing1，HUZhen-xin1，HE Xiang-kun1，ZHANGQin-ying1，YUMei-zhen1，ZHANGSheng-wan1，TIANHuai-dong1，3
（1.College ofLife Sciences，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Institute ofSorghum，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Jinzhong030600，China；3.Shanxi JingKangAgricultural TechnologyPromotion Co.，Ltd.，Taiyuan 030000，China）

To establish the suitable aqueous environmental conditions for significantly improving the viability ofsorghum pollens in vitro,five kinds of in vitro systems were designed which were dry（CK）,phosphate buffer solution（PBS）,protective vitrified solution 1（PVS1）,protective vitrified solution 2（PVS2）,protective vitrified solution 3（PVS3）.The pollens viability of sorghum in four aqueous environmental systems,soaked 15 minutes,were compared with CKpollen byusingTTCmethod.The results showed that the sort order of pollen viabilitywas as follows:PBS＜PVS3＜PVS2＜PVS1＜CK.In comparison with the pollen viabilityin PBS,PVS3 had noobviously effect,but PVS2 and PVS1 significantly improved the pollen viability in vitro.These results indicated that the viability of the pollens in vitro were significantly decreased in the aqueous environment systems and the three kinds of PVS,containing glycerol,ethylene glycol, DMSO,sucrose,had obvious protective effects on the pollen viability in vitro of sorghum.Therefore,the PVS1,containing these four components,had more significantly effects for raising the pollen viability in aqueous environment systems.The results could provide technical support for the mutagenesis ofgenes ofsorghumpollen germcells in aqueous system.

sorghum;pollen;vitrification protection solution;viability in vitro

S514

A

1002-2481（2016）04-0463-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.04.10

2016-01-27

山西省科技創新計劃項目（2014101025）

李珍（1989-），女，山西臨汾人，在讀碩士，研究方向：作物遺傳資源。田懷東為通信作者。