沙棘油復合蛋白多肽液抗氧化性研究

李樂，陳樹俊，康俊杰，徐曉霞，龐震鵬，劉曉娟，胡潔，石玥

（山西大學生命科學學院，山西太原030006）

沙棘油復合蛋白多肽液抗氧化性研究

李樂，陳樹俊，康俊杰，徐曉霞，龐震鵬，劉曉娟，胡潔，石玥

（山西大學生命科學學院，山西太原030006）

復合蛋白液是以核桃、燕麥、藜麥蛋白為原料，依據蛋白質互補作用的原理及必需氨基酸的參考模式，采用氨基酸比值系數的方法來評價各蛋白產品的營養價值，從而將3種蛋白液按照不同比例進行科學復配。利用堿性、中性、風味3種蛋白酶對復合蛋白液酶解后進行沙棘油脂的強化，通過測定溶液總還原能力、DPPH自由基清除能力、羥基自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力、總抗氧化能力，研究復合蛋白多肽液經沙棘油強化前后抗氧化活性的變化情況。結果表明，3種酶經最優條件酶解后，多肽質量濃度為17.43 mg/mL，復合蛋白多肽液和沙棘油復合蛋白多肽液，其還原力的半清除率分別為3.84，1.86 mg/mL，DPPH自由基的半清除率分別為94.72，74.29 μg/mL，羥基自由基的半清除率分別為1.52，1.01 mg/mL，超氧陰離子自由基的半清除率分別為2.09，1.33 mg/mL，2種多肽液的總抗氧化能力分別為26.76，65.74 U/mL。復合蛋白多肽液和沙棘油復合蛋白多肽液均具有一定的體外抗氧化活性，而且后者的抗氧化能力明顯強于前者，其總還原能力，DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基的清除率與質量濃度呈量效關系。

沙棘油；復合蛋白多肽液；抗氧化活性

沙棘油含有脂溶性成分多達數百種，目前為止已經有大量的文獻對此進行了研究[1-4]。不過確定其生物活性功效和開發利用價值的主要是人體必需脂肪酸、植物甾醇、維生素E、維生素K、類胡蘿卜素、植物磷脂等[5-6]。沙棘油[7]是一種脂肪酸甘油脂，其中含有油酸、棕櫚酸、亞麻酸、亞油酸等18種脂肪酸[8]，而且大部分都是不飽和脂肪酸，很容易被人體吸收利用；同時，其還含有錳、磷、鎂、硼、鐵、鉀、硅、鈣、銅等24種礦質元素[9]，其中，含量最多的是鋅、硒、鈣、鉀、鐵；并且還含有超氧化物歧化酶（SOD），其含量比人參還要高。機體氧化過程中會產生一種有害物質，即自由基，過量自由基會對機體產生氧化性損害，人體的許多慢性疾病和衰老主要是由于體內自由基失衡而引起的。當這種損害不能夠及時修復并且積累到一定程度時，就會導致機體缺氧、老化、動脈粥樣硬化甚至腫瘤等疾病[10]的發生。

本研究將復合蛋白多肽液與沙棘油進行最佳配比，以沙棘油復合蛋白多肽液為研究對象，測定了其在一定濃度范圍內的總還原能力、DPPH自由基清除能力、羥基自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力和總抗氧化能力，全面考察沙棘油復合蛋白多肽液的體外抗氧化活性[11-13]，并同具有顯著抗氧化效果的抗壞血酸（Vc）進行比較，旨在為大多數人群提供一種具有較高營養價值和抗氧化能力的輔助食品，也為今后的相關研究提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

山西大學生物工程基礎實驗室自制復合蛋白多肽液；沙棘油由山西省林業科學院提供。

1.2 試劑、儀器與設備

堿性蛋白酶，食品級，北京索萊寶科技有限公司；中性蛋白酶，食品級，北京索萊寶科技有限公司；風味蛋白酶，食品級，北京索萊寶科技有限公司；鐵氰化鉀、三氯乙酸（TCA）、無水乙醇、磷酸二氫鈉、鄰苯三酚、磷酸氫二鈉、抗壞血酸、鹽酸、三氯化鐵均為分析純；2，2-二苯代苦味酰基苯肼自由基（DPPH·），Sigma公司；抑制與產生超氧陰離子自由基（O2-）試劑盒、羥自由基試劑盒、總抗氧化能力（T-AOC）檢測試劑盒均購自南京建成生物工程有限公司。

HRHS24 Haier電熱恒溫水浴鍋，青島海爾醫用低溫科技有限公司；WFZ UV-2100型紫外可見分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司；SB4200DT超聲波，寧波新芝生物科技股份有限公司；SENCO旋轉蒸發儀，上海申生科技有限公司；TDL-5型4臺式離心機，上海安亭科學儀器廠制造；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；81-2型恒溫磁力攪拌器，上海司樂儀器廠；PHS-3C精密pH計，上海精密科學儀器有限公司；JA1003型精密電子天平，上海良平儀器儀表有限公司。其他為常規儀器。

1.3 試驗方法

山西大學生物工程基礎實驗室自制復合蛋白液是以核桃、燕麥、藜麥蛋白為原料，依據必需氨基酸參考模式、蛋白質互補作用的原理，采用氨基酸比值系數法評價各蛋白產品營養價值，將3種蛋白按照不同比例進行科學復配而成。復合蛋白的化學評分（CS）、氨基酸評分（AAS）、必需氨基酸指數（EAAI）、生物價（BV）及氨基酸比值系數分（SRCAA）分別為65.5，78.9，74.8，69.8，87.25。不論是從氨基酸模式還是生物價都說明復合蛋白具有很高的營養價值，核桃蛋白、燕麥蛋白、藜麥蛋白最佳比例為3∶3∶4。

將上述配比最佳的復合蛋白所制成的蛋白液進行酶解，最優條件：堿性蛋白酶∶中性蛋白酶為2∶1，復合酶添加量1 000 U/g，最適pH值7.5～8.0，酶解溫度60℃，酶解時間3 h，酶用量7 000 U/g。酶解完成后，將酶解液加熱到80～85℃保持5 min使酶失活，然后經2 000 r/min離心得到復合蛋白多肽液。

在上述復合蛋白多肽液中加入質量分數為2%的沙棘油，同時添加單甘脂∶蔗糖酯為1∶1的復合乳化劑0.15%，黃原膠0.05%，羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）0.05%，并進行均質乳化，得到的即為沙棘油復合蛋白多肽液。

1.3.1 復合蛋白多肽液多肽含量的測定[14]

1.3.1.1 標準曲線的制作使用三氯乙酸（TCA，5%）先后配制成0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mg/mL的Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標準溶液，分別定容于10個10 mL的容量瓶中，然后分別移取上述的標準溶液6.0 mL，與4.0 mL雙縮脲試劑混合均勻后靜置10 min，在2 000 r/min的條件下離心10 min，最后取上清液在540 nm下測定OD值（第1管作為空白對照）。將肽的質量濃度作為橫坐標X（mg/mL），OD值作為縱坐標Y，制作標準曲線。

1.3.1.2 多肽含量的測定移取2.5 mL的樣品溶液，并且向其中加入2.5 mL 10%（W/V）的三氯乙酸（TCA）水溶液，在漩渦混合儀上混合均勻并且靜置10 min后，在4 000 r/min條件下離心15 min，之后要將上清液全部轉到50 mL的容量瓶中，使用5%的TCA定容搖勻。移取上述溶液6.0 mL置于另外一個試管當中，并與4.0 mL的雙縮脲試劑（樣液∶雙縮脲試劑＝3∶2，V/V）在漩渦混合儀上混合均勻后靜置10 min，在2 000 r/min下離心10 min，最后取上清液在540 nm下測定OD值，對照所求的標準曲線，從而求得樣品溶液中的多肽質量濃度C（mg/mL），樣品中的多肽含量計算公式如下。

1.3.2 還原力測定對于一種物質而言，提供電子能力越強還原能力就越強，所以，物質的還原力實際上反映的也就是它的供電子能力。本試驗選擇的氧化劑是鐵氰化鉀（K3（Fe（CN）6）），用來被檢測的物質當中所具有的抗氧化成分能夠提供電子使Fe3+還原成Fe2+，從而使得反應體系中的顏色發生變化，反應后在700 mn處測定反應體系中的吸光度。如果吸光度越大，則表明樣品還原能力越強，也就是被檢測物質的抗氧化效果越好[15]。

移取2.5 mL不同多肽濃度的樣品液，并向其中加入2.5 mL磷酸鈉緩沖液（PBS 0.2 mol/L）（pH＝6.6）和1%的鐵氰化鉀溶液2.5 mL，將上述混合溶液在50℃水浴條件下反應20 min后迅速冷卻，并且立刻加入2.5 mL 10%的三氯乙酸（TCA）溶液終止反應，在3 000 r/min的離心條件下離心10 min。移取2.5 mL的上清液，加入2.5 mL蒸餾水和0.1%的三氯化鐵0.5 mL混勻后反應10 min，并測定700 nm處的吸光度。用抗壞血酸作為對照品，重復3次，吸光度值越大，表明多肽的還原能力越強。

1.3.3 DPPH自由基的清除能力測定本試驗中的DPPH·是一種在乙醇溶液中呈現深紫色，而且最大吸收波長為517 nm人工穩定的有機氮自由基。反應體系中的抗氧化物由于能與DPPH·中的電子成對，從而使波長吸收慢慢的消失，因此溶液就會逐漸褪色，并且其褪色程度和所接受的電子數呈現出一種線性關系，而且吸光度越低，表明樣品對于DPPH·的清除能力越強，所以可以用分光光度計來進行定量分析。

移取一定濃度的樣品液或抗壞血酸溶液2 mL，加入DPPH·（0.2 mmol/L，用無水乙醇配制）溶液2 mL于試管中混合均勻（以無水乙醇代替DPPH·作為樣品空白），在室溫下避光放置30 min后，在波長為517 nm處檢測吸光度值，而且每個濃度都要測定3次。

式中，Ai為2 mLDPPH·溶液與2 mL待測定樣品液混合液的吸光度；Aj為2 mL無水乙醇與2 mL待測定樣品液混合液的吸光度；Ac為2 mL DPPH·溶液與2 mL無水乙醇混合液的吸光度。

1.3.4 ·OH清除能力的測定首先要準確地將樣品液配制成一系列濃度，其次測定的具體步驟按照羥自由基測定試劑盒中的說明書進行操作。室溫下放置20 min后于550 nm波長處測定各個試管的吸光度值（以抗壞血酸作為對照，蒸餾水調零），重復3次。

抑制率＝（對照管吸光度值－測定管吸光度值）/對照管吸光度值×100%。

1.3.5 O2-·清除能力的測定首先將樣品液準確配成一系列濃度，其次測定的具體步驟按照超氧陰離子自由基試劑盒中的說明書進行操作（以抗壞血酸作為對照）。使用分光光度計測定波長為550 nm處的吸光度（蒸餾水調零），從而計算出對超氧陰離子自由基的清除能力，重復3次。

抑制率＝（對照管吸光度值－測定管吸光度值）/對照管吸光度值×100%。

1.3.6 總抗氧化能力的測定機體中含有的許多抗氧化物質能夠使Fe3+還原成Fe2+，并且Fe2+能夠同菲啉類物質形成一種穩固的絡合物，進而通過比色測定出物質抗氧化能力的高低。

首先將樣品液準確配成一系列濃度，其次具體的步驟按照總抗氧化能力檢測試劑盒中的說明書進行操作。要在漩渦混勻器上混勻后放置10 min（蒸餾水調零1 cm光徑），再在520 nm波長處測定吸光度值（OD值），重復3次取平均值。以每分鐘每毫升樣品液在37℃下使反應體系OD值每增加0.01時為一個抗氧化能力單位。

總抗氧化能力＝（（測定管OD值－對照管OD值）×反應液用量（mL）×樣品測試前稀釋倍數）/（0.01×30×取樣量（mL））。

1.3.7 半清除率的測定半清除率（IC50）也就是半數有效濃度，是指清除率為50%時所需要的抗氧化劑濃度，濃度越低，說明抑制能力越強。通過比較不同濃度抗氧化劑作用的IC50值，做出清除率制作曲線，從而求出IC50值。

2 結果與分析

2.1 復合蛋白多肽液多肽含量分析

2.1.1 多肽標準曲線以吸光度值為縱坐標，以多肽質量濃度為橫坐標，制作多肽含量標準曲線如圖1所示。

2.1.2 復合蛋白多肽液多肽含量分析用三氯乙酸法測得復合蛋白多肽液的多肽質量濃度為17.43 mg/mL。

2.2 還原力分析[16－17]

一種物質的供電子能力或還原能力可以反映其潛在的抗氧化性能。抗氧化劑通過自身將電子提供給自由基而自身獲得一個質子，從而使自由基變為穩定的分子，一般情況下，還原力越強，抗氧化性也就越強。故而可以通過測定物質的還原力來反映抗氧化活性的大小。樣品中的還原性物質可將Fe3+還原成Fe2+，供電子數越多，還原出的Fe2+越多，從而形成普魯士藍化合物，反應體系的溶液顏色由黃色變成藍色，在700 nm處有特征吸收峰，故通過測定吸光度的變化可知還原力的大小。700 nm處吸光度值越大，還原力越強、抗氧化活性越高[17]（圖2）。

從圖2可以看出，在一定的范圍內，吸光度隨著濃度的增加而增大，還原能力逐漸增強。從線性回歸分析（表1）中IC50可看出，沙棘油復合蛋白多肽液的還原能力明顯強于復合蛋白多肽液。還原力強弱順序依次是：Vc（IC50＝33.93 μg/mL）＞沙棘油復合蛋白多肽液（IC50＝1.86 mg/mL）＞復合蛋白多肽液（IC50＝3.84 mg/mL）。

表1 樣品還原力分析

2.3 DPPH自由基的清除能力分析[18－19]

DPPH·能夠接受電子或質子，其乙醇溶液呈紫色，在517 nm處有特征吸收峰，DPPH法就是通過體系中樣品對于DPPH·清除率的強弱來評價待測物質體外的抗氧化能力，具有簡單、快速、靈敏等優點而被廣泛應用。因其呈色反應的量效關系穩定，在反應體系中，DPPH·可被自由基清除劑將溶液的顏色由深紫色變為黃色。褪色程度越大，自由基清除能力越強（圖3）。

由圖3可知，隨著復合蛋白多肽液多肽濃度的升高，清除效果增大。復合蛋白多肽液和沙棘油復合蛋白多肽液對DPPH自由基均有較高的清除率。從線性回歸分析中IC50值可看出，沙棘油復合蛋白多肽液的清除能力明顯強于復合蛋白多肽液，但略低于抗壞血酸的清除能力。清除能力強弱順序依次是抗壞血酸（IC50＝8.65 μg/mL）＞沙棘油復合蛋白多肽液（IC50＝74.29 μg/mL）＞復合蛋白多肽液（IC50＝94.72 μg/mL）（表2）。

表2 DPPH自由基的清除活性分析

2.4 ·OH清除能力分析

羥基自由基具有極強的得電子能力，它是生命代謝活動過程中所產生的毒性最大、進攻性最強的分子，可導致多糖裂解、機體組織脂質過氧化以及蛋白質聚合、解聚，核酸斷裂等過程，還能夠迅速引發各類疾病的發生和機體衰老的加速[20]，引發組織細胞損傷病變等等。Fenton反應是一種最常見產生羥基自由基的化學反應，其產生的·OH量和H2O2量成正比，當給予電子受體后用griess試劑顯色就會形成紅色物質，并且在550 nm處有最大吸收峰，呈色與·OH的多少成正比。當體系中存在抗氧化物質時，有色物質得以清除。吸光度變化越大，清除活性越高。

由圖4可知，復合蛋白多肽液和沙棘油復合蛋白多肽液對·OH均表現出一定的清除效果，且清除率隨著復合蛋白多肽液多肽質量濃度的增加而逐漸升高。從表3可以看出，沙棘油復合蛋白多肽液的清除能力明顯強于復合蛋白多肽液。對·OH清除能力強弱順序依次是抗壞血酸（IC50＝387.6 μg/mL）＞沙棘油復合蛋白多肽液（IC50＝1.01 mg/mL）＞復合蛋白多肽液（IC50＝1.52 mg/mL），其中，沙棘油復合蛋白多肽液的IC50約為抗壞血酸的2.6倍，說明沙棘油復合蛋白多肽液對羥基自由基的清除能力比較接近抗壞血酸。

表3 清除羥基自由基的活性分析

超氧陰離子自由基是通過模擬機體中黃嘌呤與黃嘌呤氧化酶反應系統而產生的，在加入griess顯色劑和電子傳遞物質后使得反應體系呈紫紅色，可以通過分光光度計測定其吸光度，用抗壞血酸作標準可以計算出樣品對于超氧陰離子自由基的影響能力。超氧陰離子自由基是O2的還原形式，是由O2分子獲得一個電子后產生的，不僅本身具有很大的毒性，而且可通過一系列反應產生其他自由基，對機體造成更大的破壞[22]。

由圖5可知，在試驗濃度范圍內，沙棘油復合蛋白多肽液和復合蛋白多肽液對超氧陰離子的清除作用有著明顯的量效關系，并且隨著復合蛋白多肽液多肽質量濃度的增大而增強。從線性回歸分析中IC50可看出，對超氧陰離子清除能力強弱順序依次是抗壞血酸（IC50＝65.3 μg/mL）＞沙棘油復合蛋白多肽液（IC50＝1.33 mg/mL）＞復合蛋白多肽液（IC50＝2.09 mg/mL）（表4）。沙棘油復合蛋白多肽液的清除能力明顯強于復合蛋白多肽液。

表4 清除超氧陰離子自由基的活性分析

2.6 總抗氧化能力的測定

吸光度值變化越大，總抗氧化能力就越強。沙棘油復合蛋白多肽液、復合蛋白多肽液和抗壞血酸的質量濃度均為4 mg/mL（圖6）。

從圖6可以看出，相同質量濃度的3種溶液總抗氧化能力各不相同，并且它們的強弱順序依次為：抗壞血酸（89.54 U/mL）＞沙棘油復合蛋白多肽液（65.74 U/mL）＞復合蛋白多肽液（26.76 U/mL）。沙棘油復合蛋白多肽液和抗壞血酸的總抗氧化能力明顯高于復合蛋白多肽液。

3 結論

本研究結果表明，復合蛋白多肽液的還原能力、DPPH自由基清除能力、羥基自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力和總抗氧化能力隨著多肽質量濃度的增加而逐漸增大。其中，沙棘油強化前后復合蛋白多肽液抗氧化能力有顯著的差別，這是由于沙棘油中本身就含有天然抗氧化成分[5-6]，如維生素E、β-胡蘿卜素、δ-羥色胺及黃酮類等許多生物活性物質，對抗氧化結果起到了協同增效的作用[23]。

沙棘油復合蛋白多肽液的還原能力明顯強于復合蛋白多肽液，但卻低于抗壞血酸的還原能力。羥基自由基清除能力強弱順序依次是抗壞血酸（IC50＝8.65μg/mL）＞沙棘油復合蛋白多肽液（IC50＝74.29μg/mL）＞復合蛋白多肽液（IC50＝94.72μg/mL），沙棘油復合蛋白多肽液清除能力明顯強于復合蛋白多肽液，但略低于抗壞血酸的清除能力。·OH清除能力強弱順序依次是抗壞血酸（IC50＝387.6 μg/mL）＞沙棘油復合蛋白多肽液（IC50＝1.01 mg/mL）＞復合蛋白多肽液（IC50＝1.52 mg/mL），其中，沙棘油復合蛋白多肽液的IC50約為抗壞血酸IC50的2.6倍，說明沙棘油復合蛋白多肽液對羥基自由基的清除能力接近抗壞血酸。

O2-·清除能力從強到弱的順序依次是抗壞血酸（IC50＝65.3μg/mL）＞沙棘油復合蛋白多肽液（IC50＝1.33mg/mL）＞復合蛋白多肽液（IC50＝2.09 mg/mL），沙棘油復合蛋白多肽液的清除能力明顯強于復合蛋白多肽液。相同質量濃度的3種溶液總抗氧化能力各不相同，并且總抗氧化能力的強弱順序依次為抗壞血酸（89.54 U/mL）＞沙棘油復合蛋白多肽液（65.74 U/mL）＞復合蛋白多肽液（26.76 U/mL），沙棘油復合蛋白多肽液和抗壞血酸的總抗氧化能力明顯高于復合蛋白多肽液。

試驗證明，復合蛋白多肽液本身具有一定的抗氧化性，通過沙棘油強化制得的沙棘油復合蛋白多肽液抗氧化性得到了顯著提升，具有較高的抗氧化活性。

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Study on Antioxidant Activity of Compound Protein Polypeptide Solution Intensified of Sea Buckthorn Oil

LI Le，CHENShu-jun，KANGJun-jie，XUXiao-xia，PANGZhen-peng，LIUXiao-juan，HUJie，SHI Yue
（College ofLife Sciences，Shanxi University,Taiyuan 030006，China）

Compound protein solution was made of walnut,oats,quinoa protein as raw material,evaluated the nutritional value of protein products through the ratio coefficient of amino acid in accordance with the principle of complementary protein and the reference model ofessential amino acids,the three kinds of proteins were mixed in different proportion of scientific compound.Used the 3 kinds of protease including alkaline,neutral and flavor hydrolysis,and then intensified by sea buckthorn oil,study the change of the antioxidant activity of the compound protein polypeptide solution intensified by sea buckthorn oil before and after,through measured the total reducing power,DPPH radical scavenging activity,hydroxyl radical scavenging activity,superoxide anion radical scavenging activity,the total antioxidant activity.The results showed that 3 kinds of enzyme with the optimal conditions of enzymolysis said that the polypeptide concentration was 17.43 mg/mL,the halfa clearance rate ofthe reducing power ofthe compound protein polypeptide solution and the sea buckthorn oil compound protein polypeptide solution were 3.84,1.86 mg/mL,the half a clearance rate of the DPPH radical were 94.72, 74.29μg/mL,the half a clearance rate of the hydroxyl radical were 1.52,1.01 mg/mL,the half a clearance rate of the superoxide anion radical were 2.09,1.33 mg/mL,the total antioxidant activityoftwokinds ofpolypeptide solution were 26.76,65.74 U/mL.The antioxidant activityofthe sea buckthorn oil compound protein polypeptide solution was better than that ofthe compound protein polypeptide solution, and both ofthem had antioxidant activity in vitro,the total reducing power,the scavenging activity ofthe DPPH radical,hydroxyl radical, superoxide anion radical had a dose effect relationship with the concentration.

sea buckthorn oil;compound protein polypeptide solution;antioxidant activity

TS225.1

A

1002-2481（2016）04-0474-07

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.04.13

2015-12-23

李樂（1992-），女，山西長治人，在讀碩士，研究方向：食品新工藝與食品安全。陳樹俊為通信作者。