氟中毒對小鼠精子ATP的影響

李素娟，張雯，張孝清，孫子龍

（1.山西農業大學動物科技學院，山西太谷030801；2.山西農業大學食品科學與工程學院，山西太谷030801；3.朔州職業技術學院生物工程系，山西朔州036002）

氟中毒對小鼠精子ATP的影響

李素娟1，張雯2，張孝清3，孫子龍1

（1.山西農業大學動物科技學院，山西太谷030801；2.山西農業大學食品科學與工程學院，山西太谷030801；3.朔州職業技術學院生物工程系，山西朔州036002）

為探討氟化鈉對雄性小鼠精子ATP的影響，將24只雄性小鼠隨機分為對照組（供給蒸餾水）、低氟組（供給含25 mg/L NaF的蒸餾水）、中氟組（供給含50 mg/L NaF的蒸餾水）、高氟組（供給含100 mg/L NaF的蒸餾水），180 d后檢測小鼠精子在有氧呼吸與無氧酵解中產生的ATP含量。結果表明，氟化鈉能夠降低小鼠不同呼吸模型下精子ATP含量。氟化鈉能夠降低小鼠精子ATP含量，主要是通過改變有氧呼吸產生ATP的能力發揮作用。

氟中毒；精子；ATP

氟可以突破血睪屏障和血-附睪屏障，可以破壞其結構，使代謝功能等受到損傷，導致生精功能和精子生存的內環境發生改變[1]，進而對睪丸的生精細胞、支持細胞及精子產生毒副作用[2]。研究表明，機體攝入過量氟可導致睪丸生精功能降低，使精液質量下降，不育率升高[3]。

本試驗通過建立線粒體有氧呼吸與無氧酵解模型檢測小鼠精子在不同呼吸途徑中所產生的ATP含量，從而為進一步闡明氟的生殖毒性奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

24只昆明小鼠，雄性，8周齡（體質量為20～ 25 g），購自山西醫科大學實驗動物中心。

1.2 主要試劑

氟化鈉（NaF，AR，天津市化學試劑三廠）；GENMED精子細胞BWW培養液（上海杰美基因醫藥科技有限公司）；CCCP（碳酰氰基-對-氯苯腙，美國SIGMA公司）；丙酮酸鈉（美國AMRECSO）；D-無水葡萄糖（美國AMRESCO）；ATP檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所）。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗設計小鼠適應性飼養7 d后，隨機分成4組，每組6只，分籠飼養，分為對照組、低氟組、中氟組、高氟組。對照組飲用蒸餾水，低、中、高氟組分別供給含25，50，100 mg/LNaF的蒸餾水。飼養環境干凈整潔，小鼠自由飲水、采食。

1.3.2 小鼠骨骼中氟含量的測定飼養180 d，各組小鼠斷頸處死，摘取小鼠股骨，在鼓風干燥箱中105℃烘烤4 h，烘烤結束后，將其放在通風櫥內的電爐上灼燒至無煙，稍冷移入灰化爐中在560℃下灰化3～4 h，用離子濃度測量儀檢測骨灰中氟的濃度。

1.3.3 小鼠精子的采集及前處理180 d后，無菌剖腹小鼠，立即切取小鼠附睪尾與輸精管（盡量剔除其表面脂肪及網膜），放入盛有1 mLPBS和50 μL BWW（37℃預熱）的小平皿中，用眼科剪將其剪碎，用1 mL注射器將懸浮液輕輕吹打5次，使精子充分游離出來，靜置2 min，并將其吸入1.5 mL EP管中，備用。

1.3.4 小鼠精子呼吸模型的建立取部分采集好的精子，加入2 μL（5 mmol/L）丙酮酸鈉溶液建立線粒體有氧呼吸模型，并將其轉移至一個新的EP管中，待測ATP含量；同時，取部分精子，加入葡萄糖（5 mmol/L）和CCCP（1 μmol/L）各2 μL建立無氧酵解模型，待測相應呼吸模型下ATP含量[4-5]。

1.3.5 小鼠精子在不同呼吸模型下ATP含量的測定取1.3.4已建立呼吸模型的精子100 μL，嚴格按照ATP檢測試劑盒的說明書操作，利用全波長多功能酶標儀（Thermo公司）檢測ATP含量。

1.4 統計方法

試驗結果采用GraphPad Prism 5統計軟件的one-wayanalysis ofvariance（ANOVA）方法進行Dunnett檢驗，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 小鼠骨骼中氟的含量分析

從圖1可以看出，與對照組相比，染氟組隨著氟化鈉濃度的增加，骨氟的含量逐漸升高，且與對照組相比，低、中、高氟組骨氟含量差異達極顯著。

2.2 氟對小鼠精子ATP含量的影響

2.2.1 小鼠精子總ATP含量小鼠精子在正常呼吸作用下，ATP總含量如圖2所示。由圖2可知，隨著NaF濃度的增加，小鼠精子總ATP含量呈下降趨勢，且低氟時總ATP含量顯著下降，中、高氟組呈極顯著下降。

2.2.2 有氧呼吸模型下小鼠精子ATP含量在氟化鈉的作用下，小鼠精子有氧呼吸模型下ATP的含量如圖3所示。由圖3可知，與對照組相比，隨著NaF濃度的增加，小鼠精子ATP的含量總體呈下降趨勢，低、中氟組ATP含量顯著下降，高氟組呈極顯著下降。

2.2.3 無氧酵解模型下小鼠精子ATP含量在氟化鈉的作用下，小鼠精子無氧酵解ATP含量如圖4所示。由圖4可知，與對照組相比，隨著NaF濃度的增加，小鼠精子ATP的含量總體呈下降趨勢，但僅高氟組顯著下降，低、中氟組無顯著變化。

3 討論

氟中毒的主要臨床癥狀表現為氟斑牙和氟骨癥[6-7]。氟化物的親骨性很強，機體吸收的氟大部分都蓄積到骨骼中。骨氟含量是反映體內氟蓄積狀況的最好指標。本試驗選用小鼠股骨作為試驗對象，利用離子濃度測量儀檢測小鼠骨骼中氟的含量，結果表明，隨著飲水中氟濃度的升高，小鼠股骨中氟的含量呈極顯著升高。

氟化物可直接損害精子，使完整的精子溢出鉀離子，抑制Na+/K+泵，干擾精子線粒體膜電位[8]，使精子電解質失衡，進而損害精子的形態和功能[9]。Chinoy等[10-11]研究表明，氟化物可使小鼠附睪尾中精子活率、活力、密度均下降，出現大量的畸形精子，并且精子的頂體功能也減弱，頂體素和透明質酸酶含量下降，精子的形狀與代謝發生變化，精子線粒體的活性下降。氟中毒還可使小鼠精子的超激活運動能力[12]、趨化性功能明顯降低[13]，且其損傷程度隨著染氟劑量的增加而加大。氟化物會誘導精子產生活性氧，而過多活性氧會導致氧化應激，嚴重影響精子質膜流動性，危害精子獲能、精卵識別和受精過程，同時破壞精子DNA完整性，常引起不育或者圍產期流產。但至今仍鮮有報道系統性闡述亞慢性氟中毒對精子線粒體有氧呼吸和無氧酵解的影響。

解偶聯劑CCCP（碳酰氰基-對-氯苯腙）可以抑制精子線粒體有氧呼吸作用產生ATP[14]。Hereng等[15]在人體精子中加入外源的丙酮酸鈉，發現精子細胞內ATP水平明顯提高，同時線粒體的氧化磷酸化能力明顯增強。因此，本試驗選擇在精子細胞培養液中加入丙酮酸鈉建立線粒體有氧呼吸模型；在精子細胞培養液中加入葡萄糖和CCCP誘導無氧酵解，建立無氧呼吸模型。結果表明，與對照組相比，隨著NaF濃度的增加，小鼠精子總ATP含量總體呈下降趨勢，且主要通過影響有氧呼吸發揮作用。這些結果可能與氟離子能夠抑制酶的活性中心相關。Chinoy等[16]研究證明，染氟可導致家兔精子的三磷酸腺苷酶（ATPase）、琥珀酸脫氫酶（SDH）和酸性磷酸酶（ACP）的活性下降，而ATPase，SDH，ACP均是能量代謝的重要酶系。其具體機制還有待于今后進一步研究。

［1］牛瑞燕，孫子龍，安麗霞，等.氟對精子毒性作用的研究進展[J].山西農業科學，2010，38（9）：93-95.

［2］孫子龍，牛瑞燕，王俊東.氟對雄性小鼠生長發育及性腺中氟含量的影響[J].中國畜牧獸醫，2012，39（3）：227-229.

［3］Dvorakova-Hortova K，Sandera M，Jursova M.The influence of fluorides on mouse spermcapacitation[J].AnimReprod Sci，2008，108（1/2）：157-170.

［4］Mukai C，Okuno M.Glycolysis plays a major role for adenosine triphosphate supplementation in mouse spermflagellar movement[J]. Biol Reprod，2004，71：540-547.

［5］Storey B T.Mammalian sperm metabolism:oxygen and sugar，friend and foe[J].Int J DevBiol，2008，52：427-437.

［6］王俊東.氟中毒研究[M].北京：中國農業出版社，2007.

［7］WangJ M，ChengX F，Zhou B H，et al.Effects of protein and calciumon bone metabolism and biomechanical indexes in malnutrition-fed rabbits exposed to high fluoride[J].Fluoride，2008，41（1）：18-27.

［8］Adamek E，Paw?owska-Goral K，Bober K.In vitro and in vivo effects of fluoride ions on enzyme activity[J].Ann Acad Med Stetin，2005，51（2）：69-85.

［9］張彩霞.人體精子體外氟化物毒性[J].國外醫學：醫學地理分冊，1996，17（2）：83.

［10］Chinoy N J，Sharma A.Reversal of fluoride-induced alteration in cauda epididymal spermatozoa and fertility impairment in male mice[J].Environ Sci，2000，7（1）：29-38.

［11］Chinoy N J，Mehta D，Jhala D D.Effects of fluoride ingestion with protein deficient or protein enriched diets on sperm function of mice[J].Fluoride，2006，39（1）：11-16.

［12］Lu Z，Wang S，Sun Z，et al.In vivo influence of sodium fluoride on sperm chemotaxis in male mice[J].Arch Toxicol，2014，88（2）：533-539.

［13］Sun Z L，Niu R Y，Su K，et al.Effects of sodiumfluoride on hyperactivation and Ca2+signalingpathwayin spermfrommice：an in vivostudy[J].Arch Toxicol，2010，84：353-361.

［14］Guzmán-Grenfell AM，Bonilla-HernándezMA，González-Martínez MT.Glucose induces a Na+，K+-ATPase-dependent transient hyperpolarization in human sperm.I.Induction of changes in plasma membrane potential bythe proton ionophore CCCP[J].Biochimica Biophysica Acta，2000（2）：188-198.

［15］Hereng T H，Elgstoen K B P，Cederkvist F H，et al.Exogenous pyruvate accelerates glycolysis and promotes capacitation in human spermatozoa[J].HumReprod，2011，26（12）：3249-3263.

［16］Chinoy N J，Sequeira E，Narayana M V.Effects of vitamin C and calciumon the reversibilityoffluoride-induced alterations in spermatozoa ofrabbits[J].Fluoride，1991，24（1）：29-39.

Effect of Fluoride on Sperm ATP in Mice

LI Su-juan1，ZHANGWen2，ZHANGXiao-qing3，SUNZi-long1
（1.College ofAnimal Science and VeterinaryMedicine，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China；2.College ofFood Science and Engineering，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China；3.Department ofBiological Engineering，Shuozhou Vocational Technical College，Shuozhou 036002，China）

To study the effect of sodium fluoride on the ATP of sperm in male mice,24 male mice were randomly divided into control group,lowfluoride group,medium fluoride group,and high fluoride group.The four groups were orally administrated with 0,25, 50,100 mg/L NaF for 180 d.Glycolysis and mitochondrial respiration models were established for the detection of ATP content.The results showed that the sodium fluoride could reduce different breathing sperm ATP content in mice,through the change in the ATP produced bymitochondrial respiration.

fluoride;sperm;ATP

S859.8

A

1002-2481（2016）04-0480-03

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.04.14

2015-12-11

國家自然科學基金項目（31201965）；山西農業大學科技創新基金項目（201203）；山西農業大學青年拔尖創新人才支持計劃項目（TYIT201408）

李素娟（1991-），女，山西運城人，在讀碩士，研究方向：環境獸醫學及營養代謝病。孫子龍為通信作者。