定量檢測SLIT2基因甲基化對高級別宮頸癌前病變的診斷價值

袁立芹，胡元晶

定量檢測SLIT2基因甲基化對高級別宮頸癌前病變的診斷價值

袁立芹1，胡元晶2△

目的 探討神經導向因子2（SLIT2）基因甲基化定量檢測對于高級別宮頸癌前病變的臨床診斷價值。方法收集178例高危型人乳頭瘤病毒（HPV）感染患者的宮頸脫落細胞，以組織病理學診斷作為金標準，分為正常宮頸組（n=45）、低級別病變組（n=50）和高級別病變組（n=83）。采用焦磷酸測序法定量檢測各樣本中SLIT2基因的甲基化水平。采用受試者工作特征（ROC）曲線確定SLIT2基因的甲基化水平對高級別宮頸癌前病變的診斷閾值。結果正常宮頸組SLIT2基因的甲基化水平為（4.53±1.37）%，低級別病變組為（5.81±2.26）%，高級別病變組為（11.80± 8.47）%，組間差異有統計學意義（F=27.61，P＜0.001）；高級別病變組高于正常宮頸組和低級別病變組（均P＜0.001），正常宮頸組和低級別病變組之間差異無統計學意義（P=0.297）。SLIT2基因甲基化定量檢測診斷高級別宮頸癌前病變的靈敏度為80.7%，特異度為83.2%，最佳界值為6.41%。結論采用焦磷酸測序法定量檢測宮頸脫落細胞中SLIT2基因甲基化水平能夠有效診斷高級別宮頸癌前病變。

宮頸腫瘤；癌前狀態；DNA甲基化；α乳頭狀瘤病毒屬；宮頸癌前病變；神經導向因子2

宮頸癌是導致婦女死亡的第4位惡性腫瘤［1］，嚴重威脅著女性的生命健康。有研究表明超過85%的宮頸癌發生在發展中國家［2］。持續性高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）感染是導致宮頸癌前病變和浸潤性宮頸癌的主要原因［3］。近二十年來，細胞學檢查和HPV檢測的篩查方法有效降低了宮頸癌的病死率［4］。但并不是所有感染HR-HPV的婦女都會發展為宮頸癌，還有其他因素參與宮頸癌的發生發展過程。

腫瘤抑制基因的高甲基化會影響基因的正常表達，導致細胞的增殖失控，促進腫瘤的發生發展［5］。已有研究表明，神經導向因子2（SLIT2）基因在宮頸癌前病變和宮頸癌中發生啟動子高甲基化［6］。本研究旨在探討在高危型HPV陽性的人群中定量檢測宮頸脫落細胞中SLIT2基因甲基化對于宮頸高級別癌前病變的臨床診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2015年9月—2016年3月在天津市中心婦產科醫院陰道鏡門診就診的178例HR-HPV感染者的宮頸脫落細胞，入組同時進行宮頸組織活檢，并以組織病理學診斷作為“金標準”。根據病理診斷結果，將178例患者分為正常宮頸組45例、低級別病變組50例、高級別病變組83例。除外妊娠、其他部位的腫瘤、宮頸病變史、放化療、激素治療的患者。本研究獲醫院倫理委員會通過，所有的研究對象均簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器微量樣品基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；基因組DNA亞硫酸氫鹽處理試劑盒（Zymo Research）；Dream Taq TM Green Master Mix（Fermentas），紫外可見分光光度計NanoDrop 2000（Thermo）；梯度96孔熱循環儀（美國，ABI）；焦磷酸測序儀及相關試劑盒（德國，QIAGEN）；所有引物均由上海生工生物工程公司合成。

1.2.2 DNA提取及化學修飾參照北京天根生化科技有限公司的微量樣品基因組DNA提取試劑盒說明進行DNA的提取。參照美國Zymo Research公司EZ DNA Methylation-Gold kitTM試劑盒的說明書步驟，對基因組DNA進行亞硫酸氫鹽修飾，修飾后的DNA保存于-20℃備用。

1.2.3 基因擴增PCR所需上游引物為5′-GGGAGGAGGGATTGTTTAGATAT-3′，下游引物為5′-CACCACTCTAAACTCTACTCACT-3′。對下游引物的5′端進行生物素標記。PCR反應條件：95℃預變性15 min；95℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，共40個循環；72℃延伸10 min。完成后反應產物采用2%的瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.4 焦磷酸測序首先需要制備單鏈DNA模板，然后進行焦磷酸測序反應。SLIT2基因所需測序引物為5′-GAGGATAGGTTTAGGTT-3′。通過Pyro Q-CpG 1.0.9軟件可獲得SLIT2基因啟動子區6個位點的甲基化水平的數據。以每個基因所有檢測位點的甲基化率的平均值來表示每份標本的該基因甲基化水平，見圖1。

1.3 統計學方法采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差表示，同一指標的多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t方法，以P＜0.05為差異有統計學意義。采用受試者工作特征（ROC）曲線確定SLIT2基因的甲基化對于高級別宮頸癌前病變的診斷閾值。

Fig.1 Detection of SLIT2 gene methylation using pyrosequencing in a sample of HG-CIN圖1 采用焦磷酸測序定量檢測1例高級別上皮內瘤變中SLIT2基因的甲基化

2 結果

2.1 各組患者臨床資料的比較正常宮頸組的平均年齡為（38.40±9.06）歲，低級別病變組為（38.90± 7.93）歲，高級別病變組為（41.14±9.79）歲，3組間年齡差異無統計學意義（F=1.675，P=0.190）。3組的HR-HPV的DNA定量平均值(ng/L)分別為220.01（29.71,698.31）、309.92（4.83,833.64）、385.92（45.19, 1 026.69），3組間差異無統計學意義（H=3.933，P= 0.140）。

2.2 各組患者宮頸病變脫落細胞中SLIT2基因甲基化水平的定量檢測正常宮頸組、低級別病變組、高級別病變組的SLIT2基因甲基化水平分別為（4.53±1.37）%，（5.81±2.26）%、（11.80±8.47）%，3組間差異有統計學意義（F=27.61，P＜0.001），多重比較示高級別病變組高于正常宮頸組和低級別病變組（均P＜0.001），正常宮頸組和低級別病變組之間差異無統計學意義（P=0.297）。

2.3 定量檢測SLIT2基因甲基化水平診斷高級別宮頸癌前病變的診斷試驗結果分析ROC曲線示SLIT2基因甲基化水平診斷高級別宮頸癌前病變的最佳界值為6.41%，此時靈敏度為80.7%，特異度為83.2%，ROC曲線下面積為0.895，見圖2。

Fig.2 The ROC curve for the diagnosis of HG-CIN by the quantification of SLIT2 gene methylation圖2 SLIT2基因甲基化定量檢測在診斷高級別宮頸癌前病變中的ROC曲線

3 討論

SLIT2基因定位于4p15.2，編碼人類與果蠅slit2同源的細胞外基質分泌性糖蛋白，是SLIT基因家族（SLIT1～3）的一員，其主要功能是在中樞神經系統發育過程中調節軸突導向、分支和神經細胞的遷移［7］。已有研究證明，SLIT2基因具有腫瘤抑制活性，且在多種腫瘤中發現了SLIT2基因甲基化［8-13］，SLIT2基因甲基化與其表達呈負相關。Narayan等［6］研究了浸潤性宮頸癌及癌前病變中SLIT1、SLIT2、SLIT3、受體Robo1和受體Robo3的表達水平及啟動子甲基化的情況，結果表明在浸潤性宮頸癌中Slit/ Robo的表達下調、啟動子區域存在高度甲基化，并且啟動子高甲基化是腫瘤發生的一個早期事件。因此，SLIT2有望作為宮頸癌早期診斷的分子標志物。

宮頸癌的發病過程中有多個基因參與調控，是一個從宮頸不典型增生-原位癌-浸潤癌逐漸進展的過程。及時篩查發現高級別宮頸癌前病變是宮頸癌早期診斷和治療的基本策略。

焦磷酸測序技術是近年來發展起來的一種新的DNA序列分析技術，其是基于4種酶催化的酶級聯化學發光反應，焦磷酸基團最終轉化為可見光的信號的峰值。檢測甲基化位點的峰高比，即可反映DNA的甲基化水平。該技術具有高靈活性和易于操作的特性，可以進行大規模測序，實現高通量和自動化，無需進行熒光標記或者染色的核苷酸和引物，也不需要進行電泳，結果準確可靠并且具有較好的可重復性［14］。本研究采用焦磷酸測序技術對178例HR-HPV感染者的宮頸脫落細胞進行定量檢測SLIT2基因甲基化狀態，發現高級別病變組中SLIT2基因甲基化水平明顯高于低級別病變組和正常宮頸組，并且通過繪制ROC曲線確定了定量檢測SLIT2基因甲基化水平對于高級別宮頸癌前病變的最佳診斷閾值為6.41%，此時診斷的靈敏度和特異度分別為80.7%、83.2%。這提示定量檢測技術在診斷高級別宮頸癌前病變方面具有較好的靈敏度和特異度，具有潛在的臨床應用價值。

雖然國內外很多研究都表明持續性HR-HPV感染是發生宮頸癌前病變和宮頸癌的主要原因［4］，但是目前HPV-DNA病毒載量與宮頸病變的嚴重程度是否存在一定的相關性仍存在爭議。第二代雜交捕獲技術（HC-2）作為一種HPV-DNA載量半定量測定方法，具有客觀性、可重復性、高敏感性和簡單操作等優點，已經被廣泛應用于臨床。一些研究表明，宮頸病變的嚴重程度與HR-HPV病毒負荷量相關，隨著病毒負荷量的增加，宮頸病變的程度越嚴重，認為高病毒負荷量增加了HPV病毒整合事件的發生［15-16］。同時也有研究認為兩者之間并無明顯相關性［17］。本研究發現3組不同宮頸病變級別患者之間HPV-DNA病毒載量值差異無統計學意義，并且標準差的范圍較大。這提示在宮頸癌前病變和宮頸癌的篩查過程中，HPV-DNA病毒載量水平并不能作為診斷宮頸病變嚴重程度的指標。

綜上，在HR-HPV感染患者的宮頸脫落細胞中，采用焦磷酸測序技術定量檢測SLIT2基因的甲基化水平對于高級別宮頸癌前病變的臨床診斷靈敏度和特異度較高，具有潛在的應用價值。

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（2016-08-17收稿 2016-09-17修回）

（本文編輯 閆娟）

Diagnostic value of quantitative detection of SLIT2 methylation for cervical high grade precancerous lesion

YUAN Liqin1,HU Yuanjing2△
1 Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;2 Department of Gynecology and Obstetrics,Tianjin Central Hospital△

ObjectiveTo explore the clinical diagnostic value of quantitative detection of the slit homologue 2(SLIT2）methylation for cervical high grade precancerous lesions.MethodsAccording to histopathologic diagnostic results,178 patients infected with high-risk HPV were divided into normal cervix group(n=45),low-grade lesion group(n=50)and highgrade lesion group(n=83).The cervical exfoliated cells were collected in three groups.The methylation levels of SLIT2 were measured by pyrosequencing in three groups.The diagnostic threshold of SLIT2 in high grade precancerous lesions was estimated by receiver operating characteristic(ROC)curve.ResultsThe percentages of SLIT2 methylation were(4.53± 1.37)%,(5.81±2.26)%and(11.80±8.47)%in normal cervix group,low-grade lesion group and high-grade lesion group, respectively.And the differences between three groups were statistically significant(F=27.61,P＜0.001).The percentage of SLIT2 methylation was significantly higher in high-grade lesion group than that of normal cervix group and low-grade lesion group(P＜0.001).There was no significant difference in the percentage of SLIT2 methylation between normal cervix group and low-grade lesion group(P=0.297).The area under the ROC curve was 0.895 and optimal cut-off value was 6.41%.The sensitivity and specificity were 80.7%and 83.2%,respectively for the detection by SLIT2 methylation.ConclusionThe quantitative detection of SLIT2 gene methylation level in cervical exfoliated cells by pyrosequencing can effectively diagnose cervical high grade precancerous lesions.

uterine cervical neoplasms;precancerous conditions;DNA methylation;alphapapillomavirus;cevical precancerous lesions;slit homologue 2

R711.74

A

10.11958/20160854

天津市衛生局科研課題資助項目（13KG134）

1天津醫科大學（郵編300070）；2天津市中心婦產科醫院

袁立芹（1987），女，碩士在讀，主要從事婦科腫瘤方向研究

△通訊作者E-mail:tdjhyj@hotmail.com