紫云英苷在黃頂菊適生土壤中的遷移及降解

張瑞海，宋振，付衛(wèi)東，張婷，黃成成，朱昌雄，張國良

中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所，北京 100081

紫云英苷在黃頂菊適生土壤中的遷移及降解

張瑞海，宋振，付衛(wèi)東，張婷，黃成成，朱昌雄，張國良*

中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所，北京 100081

近年來植物黃酮類次生代謝物質(zhì)已成為外來植物入侵機制研究的熱點。黃頂菊（Flaveria bidentis）自2001年入侵我國以來，已對自然生態(tài)系統(tǒng)及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴重危害。紫云英苷是黃頂菊植株體內(nèi)含量最高的黃酮類次生代謝物質(zhì)，可抑制種子萌發(fā)，影響植物生長，目前對其被分泌到土壤后，在土壤中的遷移性及降解等行為尚不清楚。本文研究了紫云英苷在不同土壤中的遷移及降解規(guī)律，并以潮土為例，通過土壤酶活性測定與高通量測序技術(shù)，試圖揭示紫云英苷在土壤中的降解機制。結(jié)果表明：紫云英苷在不同土壤中的遷移值Rf為0.14～0.51，呈現(xiàn)弱至中等移動特性；紫云英苷在不同土壤中的降解符合一級動力學方程，降解半衰期為2.68～18.55 h，在滅菌潮土中的半衰期為111.8 h；紫云英苷加入土壤后土壤脫氫酶、多酚氧化酶及β-葡萄糖苷酶活性均表現(xiàn)出一定程度的升高；高通量測序結(jié)果表明，紫云英苷改變了土壤細菌群落結(jié)構(gòu)，其中諾卡氏菌屬（Nocardioides）、鞘氨醇單胞菌屬（Sohingomonas）、新鞘氨醇桿菌屬（Novosphingobium）、脂肪桿菌屬（Pimelobacter）、Aeromicrobium屬、Pedobacter屬、溶桿菌屬（Lysobacter）、熱單胞菌屬（Thermomonas）、枝動菌屬（Mycoplana）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、紅球菌屬（Rhodococcus）、支原體屬（Mycoplasma）等菌群在紫云英苷加入土壤后表現(xiàn)出較高的豐度，可能在紫云英苷降解過程中起重要作用。

黃頂菊；紫云英苷；次生代謝物質(zhì)；土壤遷移；微生物降解；高通量測序

植物在長期進化過程中，逐漸形成了一些適應(yīng)環(huán)境的生理生態(tài)功能，其根據(jù)自身初生生長的需要產(chǎn)生各種類型的次生代謝物質(zhì)，釋放到土壤中后與土壤中的生物與非生物互作，從而影響植物的生長與發(fā)育（Bais et al.，2006；Jones et al.，2012）。黃酮類化合物（flavonoids）是一種被研究得較多的植物次生代謝物質(zhì)，在植物體內(nèi)具有重要生理作用，目前已知的生理作用包括控制生長素的運輸（Peer et al.，2004；Buer et al.，2007）、種子萌發(fā)（周小理等，2012）、植物抗氧化（Agati et al.，2012）、紫外線損傷保護和抵御脅迫等（Eichholz et al.，2012；何永美等，2013；Hideg et al.，2013）等。黃酮類化合物經(jīng)植物根系分泌到根際土壤后，可以影響土壤氮循環(huán)（Cesco et al.，2012），保護植物免受病蟲害侵害（Gahukar，2012；Gurjar et al.，2012），影響植物根系生長與發(fā)育（Samanta et al.，2011），產(chǎn)生化感作用（Huang et al.，2013；Schulz et al.，2013）以及影響根際土壤微生物（Hassan et al.，2012）等。

近年來植物黃酮類次生代謝物質(zhì)已成為外來植物入侵機制研究的熱點（Weng et al.，2012；Wang et al.，2012；Salles et al.，2014），研究發(fā)現(xiàn)入侵植物斑點矢車菊（Centaurea maculosa）分泌的黃酮類物質(zhì)兒茶素（catechin）可對其他植物及土壤中的微生物等產(chǎn)生化感作用（Pollock et al.，2009）；何首烏屬（Fallopia）植物釋放的黃酮類植物抑制了根際土壤中細菌的代謝活動，從而有利于其成功入侵（Dassonville et al.，2011；Bardon et al.，2014）。

自2001年外來入侵植物黃頂菊（Flaveria bidentis）在天津南開及河北衡水湖被發(fā)現(xiàn)以來，已在我國華北地區(qū)大面積蔓延，嚴重破壞了入侵地的生態(tài)環(huán)境，在入侵農(nóng)田后造成農(nóng)作物減產(chǎn)，導致嚴重的經(jīng)濟損失（高賢明等，2004；劉全儒，2005；張國良等，2014119-125）。黃頂菊入侵機制已成為現(xiàn)階段的研究熱點之一（任艷萍等，2008）。黃頂菊可分泌化感物質(zhì)到土壤中，影響周圍植物種子萌發(fā)及幼苗生長（馮建永等，2009；彭軍等，2011），并改變根際微生物群落結(jié)構(gòu)（紀巧鳳等，2014；Huangfu et al.，2015；宋振等，2016）。已有研究表明，黃酮類物質(zhì)是其植株體內(nèi)主要的次生代謝物質(zhì)，全株中最大總量可達5.78%，紫云英苷（astragalin）是其中相對含量最高的黃酮類物質(zhì)，其在不同植株部位中的質(zhì)量分數(shù)為0.79～16.36 mg?g-1（Agnese et al.，1999；Xie et al.，2010；Wei et al.，2011），在一些研究中，紫云英苷也被認為是一些植物的化感物質(zhì)，可抑制蘿卜種子胚根及胚芽的生長（黃洪武，2008；戴靈超，2011；張凱，2011）。然而，紫云英苷被釋放到根際土壤后，其遷移、降解過程和滯留動態(tài)以及土壤微生物在紫云英苷降解過程中所發(fā)揮的作用尚缺乏系統(tǒng)研究，解析這些信息對了解黃頂菊成功入侵的機理具有重要理論指導意義。

黃頂菊是一種入侵性極高的雜草，其入侵范圍有不斷擴大的趨勢，有學者分別用不同的軟件模型模擬了黃頂菊在中國的潛在適生分布區(qū)域（白藝珍等，2009；曹向鋒等，2010），但由于建模的環(huán)境因素多與氣候相關(guān)，而土壤類型等因素并未包含其中，故研究結(jié)果較為片面。本文選取了分別來自黃頂菊入侵區(qū)（潮土、堿土）、黃頂菊入侵風險區(qū)（紫色土、紅壤及風沙土）的不同類型土壤，通過模擬黃頂菊在土壤中釋放紫云英苷的行為，研究紫云英苷在不同土壤中的遷移、降解特性，并利用高通量測序技術(shù)進一步揭示土壤細菌對紫云英苷降解的影響，以期為黃頂菊在不同類型土壤中的擴散風險差異研究提供理論參考。

表1 各土壤的土壤理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical characteristics of soil

1 材料與方法

1.1 供試土壤及紫云英苷標準品

所用土壤分別為潮土（采自河北省滄州市，記作CT）、紫色土（采自云南，記作ZST）、紅壤（采自湖南，記作HR）、堿土（采自天津，記作JT）、風沙土（采自遼寧，記作FST），以上土壤均未生長過黃頂菊，采樣深度均為0～20 cm，剔除土壤中的砂石和動植物殘體等非土壤組分，混勻后過40目篩，備用。參照鮑士旦（2000）的方法測定土壤pH（電極法）、有機質(zhì)含量（重鉻酸鉀容量法）、鐵含量（比色法）、錳含量（KMnO4比色法）、陽離子交換量（CEC）（氯化鋇-硫酸法）（張彥雄等，2010），土壤粒徑分析利用激光粒度分析儀（HELOS/RODOS）測定，測得土壤基本理化性質(zhì)如表1所示。紫云英苷標準品購于上海純優(yōu)生物科技有限公司（純度大于98.9%），用甲醇配置1 mg?mL-1母液置于-20 ℃保存、備用。

1.2 土壤中紫云英苷的提取及檢測

稱取5 g土壤，用15 mL甲醇-2% EDTA（V/V，1∶1）在25 ℃下超聲提取30 min，然后2800 g離心5 min，收集上清液，提取2次。將收集的上清液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮去除有機溶劑。采用固相萃取方法（solid phase extraction）（Hennion，1999）分離紫云英苷。預(yù)先平衡固相萃取SPE柱（購于上海安譜實驗科技股份有限公司）：依次加入5 mL甲醇、5 mL去離子水，將樣品上清液全部通過柱子后，用20 mL甲醇沖洗，收集；然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮蒸干，用2 mL甲醇定容，用0.22 μm濾膜過濾；HPLC測定紫云英苷含量，每個處理重復3次。通過該方法測得紫云英苷回收率為67.1%～78.4%。

利用超高效液相色譜儀（Waters）測定土壤中紫云英苷含量。色譜條件如下，（1）色譜柱：CAPCELL PAK MG C18色譜柱（250 mm×4.6 mm I.D.，5 μm）；（2）流動相：A：乙腈，B：1‰乙酸水溶液；（3）梯度洗脫條件：0～10 min，A：10%，B：90%；10～15 min，A：15%，B：85%；15～18 min，A：25%，B：75%；18～22 min，A：35%，B：65%；22～23 min，A：45%，B：55%；23～25 min，A：10%，B：90%；（4）柱溫：35 ℃；（5）檢測波長：360 nm；（6）流速：1.0 mL?min-1。

配制不同質(zhì)量濃度的紫云英苷甲醇溶液，得紫云英苷標準曲線為Y=0.1951X+0.0001，在0.025～50 mg?L-1具有良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)R=0.9999，RSD=0.7344%。

1.3 紫云英苷在土壤中的遷移

采用土壤薄層層析法（soil TLC）（Ravanel et al.，1999）研究紫云英苷在土壤中的遷移。取20 g供試土壤用蒸餾水調(diào)成流動的泥漿，倒在玻璃板（10 cm×10 cm）上，用玻璃棒涂布成厚度約1 mm的均勻平板，室溫自然晾干后備用。以玻璃板板基部1.0 cm處為基線，將紫云英苷溶液用微型注射器在基線處點樣，點樣量分別為1 μg?g-1（低水平，L）和10 μg?g-1（高水平，H）。玻璃板水平放置于裝有水的密閉容器中，用濾紙條引展開劑到達玻璃板的基部，使之保持相對均勻的流動。待展開劑遷移到9.5 cm（R0）后停止層析。進行不等距取樣，取樣時用小刀將每個取樣距離段的土壤全部刮下，然后按照1.2的方法提取、土壤中的紫云英苷并測定其含量，確定紫云英苷遷移距離。利用紫云英苷在薄層板上的遷移距離（R1）和溶劑水遷移位置（R0）的比值計算出比移值：

Rf的大小直接反映紫云英苷在土壤中的遷移性，每個處理重復3次。

1.4 紫云英苷在土壤中的降解

準確稱取5 g供試土壤于試管中，加入一定量的紫云英苷甲醇標液，使土壤中的紫云英苷質(zhì)量分數(shù)達到10 μg?g-1，為避免甲醇對土壤微生物活性產(chǎn)生影響，將試管置于通風櫥中進行，并攪拌至甲醇完全蒸發(fā)。加入去離子水，使樣品含水量達到飽和持水量60%，保持試管內(nèi)氣體和外界流通以保持微生物活性。將試管置于25 ℃恒溫箱中進行避光培養(yǎng)，及時補充水分，使其含水量保持穩(wěn)定。分別于0、6、12、24、72、120、168 h取樣，測定土壤中的紫云英苷含量，每個處理3個重復。

利用一級動力學公式（Martins et al.，1998）描述紫云英苷降解規(guī)律：

其中，Ct為t時土壤中滯留的紫云英苷質(zhì)量分數(shù)，μg?g-1；C0為紫云英苷加入土壤中的起始質(zhì)量分數(shù)，μg?g-1；t為培養(yǎng)時間，h；k為降解速率常數(shù)，h-1；t1/2為紫云英苷的降解半衰期，h。

1.5 土壤酶活性及土壤細菌測定

以潮土（CT）為例，觀察土壤酶及土壤細菌對紫云英苷在土壤中滯留所產(chǎn)生的影響，具體方法為：

（1）土壤酶活性測定：分別稱取滅菌潮土（120 ℃濕熱滅菌50 min，滅菌3次）與未滅菌潮土5 g于玻璃試管中，加入一定量紫云英苷標準溶液，使紫云英苷質(zhì)量分數(shù)達到10 μg?g-1，其余操作同1.4，分別于0、6、12、24、72、120、168 h進行取樣，用1.2的方法提取滅菌土壤中紫云英苷并測定其含量（未滅菌土壤中紫云英苷含量已在1.4中檢測），每個處理3個重復。并利用土壤酶試劑盒（購于北京索萊寶科技有限公司）測定土壤中多酚氧化酶（s-PPO）、土壤脫氫酶（s-DHA）以及β-葡萄糖苷酶（s-β-GC）活性，土壤酶活性參照試劑盒說明書進行測定。

（2）土壤高通量測定：稱取50 g潮土于小燒杯中，加入一定量紫云英苷甲醇溶液，使土壤中的紫云英苷質(zhì)量分數(shù)達到10 μg?g-1（記作T），同時設(shè)添加等量的甲醇為對照（CK），操作過程同1.4。分別于24、72、120、168 h進行取樣，分別記作T1、T3、T5、T7及CK1、CK3、CK5、CK7，空白潮土記作CK0，每個處理3個重復。

利用PowerSoil? DNA Isolation Kit（MoBio, Carlsbad，CA，USA）提取各土壤樣品中的總DNA。以純化后的DNA為模板，以細菌16S rDNA V3-V4區(qū)通用引物（V3F：5’-TACGGRAGGCAGCAG-3’，V4R：5’-AGGGTATCTAATCCT-3’），PCR擴增16S rDNA V3-V4區(qū)片段。PCR反應(yīng)體系為30 μL，DNA模版10 μL，Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer（New England Biolabs，USA）15 μL，上、下游引物（0.2 μM）各0.5 μL，補充ddH2O至30 μL。PCR擴增程序為：98 ℃預(yù)變性1 min，98 ℃變性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30個循環(huán)，最后于72 ℃延伸5 min。使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和QPCR定量，文庫合格后，使用Illumina MiSeq測序平臺（由北京諾禾致源生物信息科技有限公司提供）進行上機測序。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Uparse軟件（v7.0.1001）（Li et al.，2013）對所有樣品的全部Effective Tags進行聚類，默認以97%的一致性（Identity）將序列聚類成為OTUs（Operational Taxonomic Units），根據(jù)所有樣品的物種注釋結(jié)果和OTUs豐度信息，將相同分類的OTUs信息合并處理得到物種豐度信息表（Profiling Table）；同時采用MUSCLE軟件構(gòu)建OTUs之間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，采用Qiime軟件（Version 1.7.0）計算Unifrac距離（Unweighted Unifrac）、構(gòu)建樣品聚類樹（Caporaso et al.，2010）。采用SPSS 19.0進行多重方差分析（ANOVA）及相關(guān)分析。

表2 紫云英苷在不同土壤中的Rf值Table 2 The Rf value of astragalin in the soil

表3 紫云英苷在不同土壤中的Rf值與半衰期（t1/2）與土壤理化性質(zhì)相關(guān)分析Table 3 The correlation between Rf value, t1/2and soil physical and chemical properties

表4 紫云英苷在土壤中的降解動態(tài)方程及其特征值Table 4 The kinetics equation and characteristic value of astragalin

2 結(jié)果與分析

2.1 紫云英苷在不同土壤中的遷移

兩種濃度紫云英苷在不同土壤中的遷移值存在較大差異，且紫云英苷濃度越高，在不同土壤中的遷移距離越遠，與之相對應(yīng)的Rf越高，遷移性越好。兩種濃度紫云英苷在不同土壤中均呈現(xiàn)不同的遷移規(guī)律，但均以紫色土遷移最遠，紅壤遷移最近。（表2），其中，低濃度紫云英苷在土壤中的遷移值Rf為0.14～0.25，遷移性高低順序為：紫色土＞風沙土＞堿土＞潮土＞紅壤；高濃度紫云英苷在土壤中的遷移值為0.36～0.51，遷移性高低順序為：紫色土＞堿土＞潮土＞風沙土＞紅壤。由此可知，紫云英苷在各種土壤中都呈現(xiàn)弱至中等移動特性（Helling et al.，1968）。

相關(guān)分析結(jié)果表明（表3），紫云英苷在土壤中的遷移性與土壤有機質(zhì)、土壤pH及土壤砂粒含量呈正相關(guān)，而與土壤粘粒含量、粉粒含量、土壤中金屬離子含量（Fe、Mn）呈負相關(guān)。其中，低濃度紫云英苷遷移性與土壤粘粒組成相關(guān)性達到顯著水平，同樣高濃度紫云英苷在土壤中的遷移性與土壤中Fe離子含量相關(guān)性也達到顯著水平；低濃度紫云英苷遷移性與陽離子交換量呈負相關(guān)，而高濃度紫云英苷遷移性與陽離子交換量呈正相關(guān)，由此說明紫云英苷在土壤中的遷移較復雜。

2.2 紫云英苷在不同土壤中的降解動態(tài)

紫云英苷加入土壤后，在土壤膠體和土壤微生物的作用下發(fā)生生物或非生物降解反應(yīng)，故其在土壤中的滯留量逐漸減少，利用一級動力學方程可較好地模擬其降解動態(tài)，決定系數(shù)均在0.95以上（表4）。此外，經(jīng)過公式（3）計算的紫云英苷在不同土壤中的降解時間及速率均有所不同，其在風沙土中的半衰期最短，僅有2.68 h，而在紫色土中的半衰期最長，為28.55 h，降解半衰期長短順序為風沙土＜堿土＜潮土＜紅壤＜紫色土。就降解速率而言，紫云英苷在紫色土中的降解速率常數(shù)最小，為0.0243，而在風沙土中的降解速率常數(shù)最大，為0.2591，紫云英苷在土壤中的降解速率常數(shù)大小順序為紫色土＜紅壤＜潮土＜堿土＜風沙土，說明紫云英苷在紫色土中的降解相對較難，而在風沙土中降解較易。通過相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)（表3），紫云英苷在土壤中的降解半衰期與土壤有機質(zhì)、土壤粘粒含量、土壤砂粒含量及土壤陽離子交換量、土壤中金屬離子含量（Fe、Mn）呈正相關(guān)，而與土壤pH及土壤粉粒含量呈負相關(guān)，但僅與土壤有機質(zhì)相關(guān)性達到顯著水平。紫云英苷在經(jīng)過滅菌后的潮土中降解緩慢，半衰期達111.8 h，降解速率常數(shù)僅為0.0062，可見經(jīng)過滅菌后，大部分土壤酶及微生物失去活性，紫云英苷的降解受到較大的影響。

圖1 土壤脫氫酶（s-DHA）、多酚氧化酶（s-PPO）以及β-葡萄糖苷酶（s-β-GC）的變化動態(tài)Fig.1 Dynamic Changes of the activities of soil dehydrogenase (s-DHA), soil polyphenol oxidase (s-PPO) and β-glycosidase (s-β-GC)

2.3 土壤酶在紫云英苷降解過程中的變化趨勢

試驗結(jié)果顯示，紫云英苷加入土壤后，3種土壤酶活性在未滅菌土壤中呈現(xiàn)不同程度的變化，而在滅菌土壤中變化趨勢不明顯（圖1）。土壤脫氫酶（s-DHA）活性在6 h達到高峰，然后趨于平緩，而多酚氧化酶（s-PPO）及β-葡萄糖苷酶（s-β-GC）活性均在12 h達到高峰，然后慢慢升高。可見3種土壤酶活性在紫云英苷快速降解時期及快速降解后期，受到紫云英苷及其降解產(chǎn)物的刺激，呈現(xiàn)不同程度的升高，3種酶在紫云英苷降解過程中可能起一定的作用，但仍需進一步驗證。

2.4 土壤細菌群落在紫云英苷降解過程中的變化趨勢

對9個土壤樣本進行高通量測序，經(jīng)過拼接和過濾處理后，獲得16S rDNA標簽序列，共獲得561162條序列（reads），各樣本序列測序量在49968～65607條之間，覆蓋率均高于97.9%，能夠較大程度地反映該區(qū)域群落的種類和結(jié)構(gòu)。并根據(jù)97%的序列相似性劃分不同的OTUs（Operational taxonomic units），通過測序共獲得19862個OUT，各樣本測序獲得的細菌OTU序列讀數(shù)如表5所示。

表5 各土壤樣品序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 5 Data statistics of each soil sample sequences

圖2 在門級分類水平下各樣品土壤細菌群落的相對豐度及聚類情況Fig.2 Relative abundance and clustering analysis of soil bacterial community at Phylum level

從門級分類水平下各處理細菌群落的聚類樹可以看出，各樣品基本上按照取樣時間聚類到一起，且放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）在各處理中為主要優(yōu)勢類群（圖2），這3門微生物在各樣品中占比均超過了78%。然而，細菌群落結(jié)構(gòu)在對照與紫云英苷處理間存在明顯差異。放線菌門的相對豐度在各處理中均呈現(xiàn)下降趨勢，紫云英苷處理中放線菌門群落豐度較0 d（45.9%）先升高（66.3%）后逐漸降低（P＜0.05），可見紫云英苷加入到土壤中后，刺激了放線菌門群落豐度上升后，又使其降低。紫云英苷處理中變形菌門豐度呈先升高后降低趨勢，在第5天和第7天相對豐度分別達到49.6%和31.6%，而同期對照僅為18.0%和17.6%，差異顯著（P＜0.05）。厚壁菌門群落相對豐度在對照中呈逐漸升高趨勢，而紫云英苷處理后，除第7天處理外，厚壁菌門群落相對豐度均低于同期對照，可見，紫云英苷的添加抑制了厚壁菌門中一些細菌的生長。

圖3 在屬水平下各樣品土壤細菌群落組成Fig.3 Composition of the bacterial community at genus level

根據(jù)所有樣品在屬分類水平的物種注釋及豐度信息，選取豐度排名前35的屬，根據(jù)其在每個樣品中的豐度信息，分別從物種和樣品兩個層面進行聚類，并繪制成熱圖，不同顏色代表細菌的相對豐度（圖3）。從圖中可以看出，1～3 d樣品被聚集在左半?yún)^(qū)，5～7 d樣品被聚集在右半?yún)^(qū)，說明1～3 d樣品群落結(jié)構(gòu)更為相似，而5～7 d樣品與1～3 d樣品群落結(jié)構(gòu)差異較大。在土壤中加入紫云英苷1 d后（T1），放線菌門的脂肪桿菌屬（Pimelobacter）、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）以及Aeromicrobium屬高于同期對照（CK1），有可能是由于此類菌可以紫云英苷及其產(chǎn)物作為碳源，故其豐度提高；而該門小月菌屬（Microlunatus.sp）、紅球菌屬（Rhodococcus）菌群豐度低于同期對照組（CK1），即紫云英苷的加入抑制了該類菌的生長，此外，變形菌門的拜納蒙納斯屬（Balneimonas）、Skermanella屬菌群同樣受到了紫云英苷的抑制作用。而中后期（T5），擬桿菌門（Bacteroidetes）的Pedobacter屬，變形菌門的Ramlibacter屬、拜納蒙納斯屬、Kaistobacter屬、鞘氨醇單胞菌屬（Sohingomonas）、溶桿菌屬（Lysobacter）、熱單胞菌屬（Thermomonas）、枝動菌屬（Mycoplana）以及新鞘氨醇桿菌屬（Novosphingobium）豐度均高于同期對照（CK5），而厚壁菌門的Solibacillus屬生長受到了紫云英苷的抑制，豐度低于同期對照。在降解后期（T7），類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、紅球菌屬（Rhodococcus）、支原體屬（Mycoplasma）3種菌豐度高于同期對照（CK7），分別屬于厚壁菌門、放線菌門、柔膜菌門（Tenericutes），而放線菌門的壤霉菌屬（Agromyces）、地嗜皮菌屬（Geodermatophilus）、Iamia屬低于對照，而其他菌群恢復到對照水平。

3 結(jié)論與討論

3.1 討論

黃頂菊能夠在我國成功定殖并擴散的主要機制之一是具有強烈的化感作用（馮建永等，2009；任艷萍等，2009；皇甫超河等，2010；李建恒等，2014）。國內(nèi)外研究學者發(fā)現(xiàn)，紫云英苷是黃頂菊植株體內(nèi)重要的化感物質(zhì)（Varin et al.，1988；Wei et al.，2011；Shaheen et al.，2015），其一旦被釋放到土壤中，需遷移至鄰近的目標區(qū)域才能發(fā)揮其生物效應(yīng)（孔垂華，2010），這種遷移受土壤質(zhì)地、粒徑大小、有機質(zhì)含量、pH等因素影響。一般而言，粘土土質(zhì)緊實，土壤水分遷移性差，次生代謝物質(zhì)的遷移能力差（王延平等，2010；Li et al.，2013），本研究也發(fā)現(xiàn)了類似的規(guī)律：紫云英苷在土壤中的遷移值Rf與土壤粘粒及粉粒含量呈負相關(guān)，與土壤pH及有機質(zhì)均呈正相關(guān)，但相關(guān)性較差，這可能與紫云英苷自身化學結(jié)構(gòu)及土壤等因素有關(guān)（王延平等，2010）。紫云英苷化學結(jié)構(gòu)中含有較多的羥基（-OH）（張國良，2014）301，容易與土壤中金屬離子螯合（Yuting et al.，1990；曾慶平等，1996），因此紫云英苷在土壤中的遷移性與金屬離子含量呈負相關(guān)，這也是本文在提取土壤中紫云英苷利用螯合劑EDTA的原因之一（程艷等，2009；李瑞等，2014）。

黃酮類物質(zhì)是黃頂菊植株重要的次生代謝物質(zhì)（Xie et al.，2010），其在土壤中的降解與其本身結(jié)構(gòu)、土壤理化性質(zhì)等因素有關(guān)，一般來說，黃酮類物質(zhì)在非滅菌土中比在滅菌土壤中的降解速度要快得多，例如，蔥芥（Alliaria petiolata）分泌的黃酮類物質(zhì)在非滅菌土壤中的半衰期（3～12 h）短于在滅菌土中的半衰期（12～46 h）（Barto et al.，2009）。本研究中紫云英苷在不同的未滅菌土壤中的的半衰期為2.68～18.55 h，在滅菌潮土中的半衰期達111.8 h，可見紫云英苷在滅菌土壤中更易存留，這可能是未滅菌土壤中的土壤酶及土壤微生物在紫云英苷降解過程中起重要作用，而滅菌土壤中紫云英苷僅靠自然降解，因此紫云英苷在滅菌土壤中的半衰期遠遠高于未滅菌土壤中的半衰期。

紫云英苷在植物體內(nèi)通過苯丙氨酸途徑生物合成，是由兩個苯環(huán)與中間3個碳原子相連接而形成的，其基本骨架具有C6-C3-C6的特點（Das，1994），且其骨架C-3位被糖苷化（張國良，2014）301。本文選取了在土壤生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化中起重要作用的3種酶，分別為能催化有機物質(zhì)脫氫，起著中間轉(zhuǎn)化傳遞作用的土壤脫氫酶（Casida et al.，1964）；可降解土壤中的酚類物質(zhì)，完成土壤芳香族化合物循環(huán)的土壤多酚氧化酶（Trasar-Cepeda et al.，2000）；能夠催化、水解芳基或烴基與糖基原子團之間的糖苷鍵而生成葡萄糖的土壤β-葡萄糖苷酶（Eivazi et al.，1988）。紫云英苷結(jié)構(gòu)中含有這3種酶的作用位點，可用來初步驗證土壤酶是否對紫云英苷及其降解產(chǎn)物起降解催化作用。實驗開始階段3種酶的活力均在短時間內(nèi)（6～12 h）出現(xiàn)了大幅增長，可以推斷這3種酶可能在降解紫云英苷及其降解產(chǎn)物中起到了重要作用。

土壤微生物是影響黃酮類物質(zhì)在土壤中的歸趨的一個決定性因素（Sugiyama et al.，2014）。Kong et al.（2008）針對稻田土壤中存在的兩種化感物質(zhì)（黃酮和苯甲酸）在土壤中的降解研究得知降解過程中真菌數(shù)量下降而細菌數(shù)量的增加。本研究通過對16S rDNA的高變異區(qū)V3～V4區(qū)的測序分析發(fā)現(xiàn)，紫云英苷的加入改變了土壤細菌群落結(jié)構(gòu)，類諾卡氏菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、新鞘氨醇桿菌屬等均表現(xiàn)出較高的豐度。有研究發(fā)現(xiàn)，上述3種菌在降解芳香族化合物方面起重要作用（Zylstra et al.，1997；Saito et al.，1999；Baraniecki et al.，2002；Yuan et al.，2008），其他菌群（如脂肪桿菌屬、Aeromicrobium屬、Pedobacter屬、溶桿菌屬、熱單胞菌屬、枝動菌屬、類芽孢桿菌屬、紅球菌屬、支原體屬等）的豐度也均高于同期對照，這些結(jié)果說明了這幾種菌群可能利用紫云英苷及其產(chǎn)物作為碳源，進而起到降解紫云英苷及其降解產(chǎn)物的作用。而Skermanella屬、小月菌屬、紅球菌屬等在紫云英苷加入后豐度顯著降低，可能是受到紫云英苷及其產(chǎn)物的抑制。這種富集或抑制的效果，隨著培養(yǎng)時間的延長及紫云英苷的逐步降解而逐步降低，故后期細菌群落逐步恢復到對照水平。

紫云英苷在土壤中的降解與土壤酶及部分土壤細菌大量增殖有密切關(guān)系，這也進而影響著紫云英苷在土壤中的遷移（王延平等，2010）。目前關(guān)于紫云英苷降解產(chǎn)物的文獻報道較少，因此本文暫以紫云英苷在土壤中的時空位移作為研究目標。本研究特定類群細菌的富集或消散現(xiàn)象可能是紫云英苷及其降解產(chǎn)物共同作用的結(jié)果，這種變化對黃頂菊入侵的影響還有待進一步研究。另外，紫云英苷在土壤中的降解產(chǎn)物是什么？含量是多少？這些都是今后研究的重點。

3.2 結(jié)論

紫云英苷添加到土壤中后，在未滅菌土壤中降解較快，半衰期為2.68～18.55 h，并引起土壤脫氫酶、多酚氧化酶和β-葡萄糖苷酶活性升高。高通量分析結(jié)果顯示紫云英苷改變了土壤細菌群落結(jié)構(gòu)，諾卡氏菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、新鞘氨醇桿菌屬、脂肪桿菌屬、Aeromicrobium屬、Pedobacter屬、溶桿菌屬、熱單胞菌屬、枝動菌屬、類芽孢桿菌屬、紅球菌屬、支原體屬等細菌豐度升高，因此其降解與土壤酶及部分土壤細菌大量增殖有密切關(guān)系，這也影響著紫云英苷在土壤中的遷移，另外土壤粒徑組成及土壤金屬離子等因素也是影響其遷移特性的重要因素。

AGATI G, AZZARELLO E, POLLASTRI S, et al.2012.Flavonoids as antioxidants in plants: location and functional significance [J].Plant Science, 196: 67-76.

AGNESE A M, MONTOYA S N, ESPINAR L A, et al.1999.Chemotaxonomic features in Argentinian species of Flaveria (Compositae) [J].Biochemical systematics and Ecology, 27(7): 739-742.

BAIS H P, WEIR T L, PERRY L G, et al.2006.The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms [J].Annual Review of Plant Biology, 57: 233-266.

BARANIECKI C A, AISLABIE J, FOGHT J M.2002.Characterization of Sphingomonas sp.Ant 17, an aromatic hydrocarbon-degrading bacterium isolated from Antarctic soil [J].Microbial Ecology, 43(1): 44-54.

BARDON C, PIOLA F, BELLVERT F, et al.2014.Evidence for biological denitrification inhibition (BDI) by plant secondary metabolites[J].New Phytologist, 204: 620–630.

BARTO E K, CIPOLLINI D.2009.Half-lives and field soil concentrations of Alliaria petiolata secondary metabolites [J].Chemosphere, 76(1): 71-75.

BRUNNER W, FOCHT D D.1984.Deterministic three-half-order kinetic model for microbial degradation of added carbon substrates in soil [J].Applied and Environmental microbiology, 47(1): 167-172.

BUER C S, MUDAY G K, DJORDJEVIC M A.2007.Flavonoids are differentially taken up and transported long distances in Arabidopsis [J].Plant Physiology, 145(2): 478-490.

CAPORASO J G, KUCZYNSKI J, STOMBAUGH J, et al.2010, QIIMEallows analysis of high-throughput community sequencing data [J].Nature Methods, 7(5): 335-336.

CASIDA JR L E, KLEIN D A, SANTORO T.1964.Soil dehydrogenase activity [J].Soil Science, 98(6): 371-376.

CESCO S, MIMMO T, TONON G, et al.2012.Plant-borne flavonoids released into the rhizosphere: impact on soil bio-activities related to plant nutrition.A review [J].Biology and Fertility of Soils, 48(2): 123-149.

DAS D K.1994.Naturally occurring flavonoids: Structure, chemistry, and high-performance liquid chromatography methods for separation and characterization [J].Methods in Enzymology, 234: 410-420.

DASSONVILLE N, GUILLAUMAUD N, PIOLA F, et al.2011.Niche construction by the invasive Asian knotweeds (species complex Fallopia): impact on activity, abundance and community structure of denitrifiers and nitrifiers [J].Biological Invasions, 13(5): 1115-1133.

EICHHOLZ I, ROHN S, GAMM A, et al.2012.UV-B-mediated flavonoid synthesis in white asparagus (Asparagus officinalis L.) [J].Food Research International, 48(1): 196-201.

EIVAZI F, TABATABAI M A.1988.Glucosidases and galactosidases in soils [J].Soil Biology and Biochemistry, 20(5): 601-606.

GAHUKAR R T.2012.Evaluation of plant-derived products against pests and diseases of medicinal plants: a review [J].Crop Protection, 42: 202-209.

GURJAR M S, ALI S, AKHTAR M, et al.2012.Efficacy of plant extracts in plant disease management [J].Agricultural Sciences, 3(3): 425.

HASSAN S, MATHESIUS U.2012.The role of flavonoids in root-rhizosphere signaling: opportunities and challenges for improving plant–microbe interactions [J].Journal of Experimental Botany, 63(9): 3429-3444.

HELLING C S, TURNER B C.1968.Pesticide mobility: determination by soil thin-layer chromatography [J].Science, 162(3853): 562-563.

HENNION M C.1999.Solid-phase extraction: method development, sorbents, and coupling with liquid chromatography [J].Journal of Chromatography A, 856(1): 3-54.

HIDEG é, JANSEN M A K, STRID ?.2013.UV-B exposure, ROS, and stress: inseparable companions or loosely linked associates? [J].Trends in Plant Science, 18(2): 107-115.

HUANG L F, SONG L X, XIA X J, et al.2013.Plant-soil feedbacks and soil sickness: from mechanisms to application in agriculture [J].Journal of Chemical Ecology, 39(2): 232-242.

HUANGFU C H, LI H Y, CHEN X W, et al.2015.The effects of exotic weed Flaveria bidentis with different invasion stages on soil bacterial community structures [J].African Journal of Biotechnology, 14(35): 2636-2643.

JONES W P, KINGHORN A D.2012, Extraction of plant secondary metabolites [J].Methods in Molecular Biology, 864(33): 341-66.

KONG C H, WANG P, GU Y, et al.2008.Fate and impact on microorganisms of rice allelochemicals in paddy soil [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56(13): 5043-5049.

LI B, ZHANG X, GUO F, et al.2013.Characterization of tetracycline resistant bacterial community in saline activated sludge using batch stress incubation with high-throughput sequencing analysis [J].Water Research, 47(13): 4207-4216.

LI X J, XIA Z C, KONG C H, et al.2013.Mobility and microbial activity of allelochemicals in soil [J].Journal of Agricultural & Food Chemistry, 61(21): 5072-5079.

MARTINS J M, MERMOUD A.1998.Sorption and degradation of four nitroaromatic herbicides in mono and multi-solute saturated/unsaturated soil batch systems [J].Journal of Contaminant Hydrology, 33(1): 187-210.

PEER W A, BANDYOPADHYAY A, BLAKESLEE J J, et al.2004.Variation in expression and protein localization of the PIN family of auxin efflux facilitator proteins in flavonoid mutants with altered auxin transport in Arabidopsis thaliana [J].The Plant Cell, 16(7): 1898-1911.

POLLOCK J L, HOLBEN W E.2009.Catechin–metal interactions as a mechanism for conditional allelopathy by the invasive plant Centaurea maculosa [J].Journal of Ecology, 97(6):1234-1242.

RAVANEL P, LIEGEOIS M H, CHEVALLIER D, et al.1999.Soil thin-layer chromatography and pesticide mobility through soil microstructures new technical approach [J].Journal of Chromatography A, 864(1): 145-154.

SAITO A, IWABUCHI T, HARAYAMA S.1999.Characterization of genes for enzymes involved in the phenanthrene degradation in Nocardioides sp.KP7 [J].Chemosphere, 38(6): 1331-1337.

SALLES J F, MALLON C A.2014.Invasive plant species set up their own niche [J].New Phytologist, 204(3): 435-437.

SAMANTA A, DAS G, DAS S K.2011.Roles of flavonoids in plants [J].International Journal of Pharmaceutical Science and Technology, 6(1): 12-35.

SCHULZ M, MAROCCO A, TABAGLIO V, et al.2013.Benzoxazinoids in rye allelopathy-from discovery to application in sustainable weed control and organic farming [J].Journal of Chemical Ecology, 39(2): 154-174.

SHAHEEN N, YIN L, GU Y, et al.2015.Separation of isorhamnetin 3-sulphate and astragalin from Flaveria bidentis (L.) Kuntze using macroporous resin and followed by high-speed countercurrent chromatography [J].Journal of Separation Science, 38(11):1933-1941.SUGIYAMA A, YAZAKI K.2014.Flavonoids in plant rhizospheres: secretion, fate and their effects on biological communication [J].Plant Biotechnology, 31(5): 431-443.

TRASAR-CEPEDA C, LEIROS M C, SEOANE S, et al.2000.Limitations of soil enzymes as indicators of soil pollution [J].Soil Biology and Biochemistry, 32(13): 1867-1875.

VARIN L, BARRON D, IBRAHIM R.1998.Identification and Biosynthesis of Glucosylated and Sulfated Flavonols in Flaveria bidentis [J].Zeitschrift für Naturforschung C, 41(9-10):813-819.

WANG Y, SIEMANN E, WHEELER G S, et al.2012.Genetic variation in anti-herbivore chemical defences in an invasive plant [J].Journal of Ecology, 100(4): 894-904.

WEI Y, XIE Q, FISHER D, et al.2011.Separation of patuletin-3-O-glucoside, astragalin, quercetin, kaempferol and isorhamnetin from Flaveria bidentis (L.) Kuntze by elution-pump-out high-performance counter-current chromatography [J].Journal of Chromatography A, 1218(36): 6206-6211.

WENG C J, YEN G C.2012.Flavonoids, a ubiquitous dietary phenolic subclass, exert extensive in vitro anti-invasive and in vivo anti-metastatic activities [J].Cancer and Metastasis Reviews, 31(1-2): 323-351.

XIE Q, WEI Y, ZHANG G.2010.Separation of flavonol glycosides from Flaveria bidentis (L.) Kuntze by high-speed counter-current chromatography [J].Separation and Purification Technology, 72(2): 229-233.

YUAN J, LAI Q, ZHENG T, et al.2008.Polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacterium Novosphingobium sp.H25 isolated from deep sea and its degrading genes [J].Acta Microbiologica Sinica, 48(9): 1208-1213.

YUTING C, RONGLIANG Z, ZHONGJIAN J, et al.1990.Flavonoids as superoxide scavengers and antioxidants [J].Free Radical Biology and Medicine, 9(1): 19-21.

ZYLSTRA G J, KIM E.1997.Aromatic hydrocarbon degradation bySphingomonas yanoikuyae B1 [J].Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 19(5-6): 408-414.

白藝珍, 曹向鋒, 陳晨, 等.2009.黃頂菊在中國的潛在適生區(qū)[J].應(yīng)用生態(tài)學報, 20(10): 2377-2383.

鮑士旦.2000.土壤農(nóng)化分析[M].北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社.

曹向鋒, 錢國良, 胡白石, 等.2010.采用生態(tài)位模型預(yù)測黃頂菊在中國的潛在適生區(qū)[J].應(yīng)用生態(tài)學報, 21(12): 3063-3069.

曾慶平, 郭勇.1996.類黃酮—金屬離子螯合模擬SOD的研究[J].藥物生物技術(shù), 3(4): 210-213.

程艷, 高靜, 徐紅納, 等.2009.螯合劑 EDTA 簡介[J].化學教育, 30(5): 4-6.

戴靈超.2011.黃檗落葉化感物質(zhì)的初步研究[D].北京: 北京協(xié)和醫(yī)學院.馮建永, 陶晡, 龐民好, 等.2009.黃頂菊化感物質(zhì)釋放途徑的初步研究[J].河北農(nóng)業(yè)大學學報, 32(1): 72-77.

高賢明, 唐廷貴, 梁宇, 等.2004.外來植物黃頂菊的入侵警報及防控對策[J].生物多樣性, 12(2): 274-279.

何永美, 湛方棟, 祖艷群, 等.2013.大田條件下UV-B輻射對元陽梯田2個地方水稻品種硅、類黃酮和總酚含量的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報, 32(8): 1500-1506.

皇甫超河, 陳冬青, 王楠楠, 等.2010.外來入侵植物黃頂菊與四種牧草間化感互作[J].草業(yè)學報, 19(4): 22-32.

黃洪武.2008.外來生物加拿大一枝黃花的化感作用及其化學防除研究[D].南京: 南京農(nóng)業(yè)大學.

紀巧鳳, 宋振, 張國良, 等.2014. 黃頂菊入侵對土壤磷細菌多樣性的影響[J].農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境學報, 31(2): 175-181.

孔垂華, 婁永根.2010.化學生態(tài)學前沿[M].北京: 高等教育出版社.

李建恒, 侯力峰, 賀學禮.2014.入侵植物黃頂菊的化學成分及生物活性[J].河北大學學報: 自然科學版, 34(1): 107-112.

李瑞, 劉曉娜, 趙中秋.2014.螯合劑和AM菌根對玉米吸收重金屬及重金屬化學形態(tài)的影響[J].生態(tài)環(huán)境學報, 23(2): 332-338.

劉全儒.2005.中國菊科植物一新歸化屬--黃菊屬[J].植物分類學報, 43(2): 178-180.

彭軍, 馬艷, 李香菊, 等.2011.黃頂菊化感作用研究進展[J].雜草科學, 29(1): 17-22.

任艷萍, 江莎, 古松, 等.2008.外來植物黃頂菊（Flaveria bidentis）的研究進展[J].熱帶亞熱帶植物學報, 16(4): 390-396.

任艷萍, 江莎, 古松, 等.2009.外來植物黃頂菊根、莖、葉的化感作用初探[J].植物保護, 35(3): 36-40.

宋振, 紀巧鳳, 付衛(wèi)東, 等.2016.黃頂菊入侵對土壤中主要功能細菌的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學報, 27(8): 2636-2644.

王延平, 王華田, 楊陽, 等.2010.外源酚酸在楊樹人工林土壤中的吸附與滯留動態(tài)研究[J].水土保持學報, 24(2): 251-256.

王延平, 王華田.2010.植物根分泌的化感物質(zhì)及其在土壤中的環(huán)境行為[J].土壤通報, 41(2): 501-507.

張國良, 付衛(wèi)東, 鄭浩.2014.黃頂菊入侵機制及綜合治理 [M].北京:科學出版社.

張凱.2011.黃頂菊中噻吩類和酚酸類物質(zhì)的研究[D].北京: 北京化工大學.

張彥雄, 李丹, 張佐玉, 等.2010.兩種土壤陽離子交換量測定方法的比較[J].貴州林業(yè)科技, 38(2): 45-49.

周小理, 方向, 周一鳴, 等.2012.磁場對苦蕎種子萌發(fā)過程中黃酮類物質(zhì)的誘導效應(yīng)[J].食品科學, 33(21): 20-23.

Migration and Degradation of Astragalin in the Suitable Soil for Flaveria bidentis

ZHANG Ruihai, SONG Zhen, FU Weidong, ZHANG Ting, HUANG Chengcheng,
ZHU Changxiong, ZHANG Guoliang*
Institute of Agricultural Environment and Sustainable Development, CAAS, Beijing 100081, China

The secondary metabolites of plant flavonoids have become one research hotspot on the invasion mechanism of alien plant in recent years.An exotic weed native to South America, Flaveria bidentis, is spreading in northern China where it forms dense monospecific patches threatening native aboveground biodiversity and agricultural production from 2001.F.bidentis contains high amounts of astragalin, one flavonoid metabolite, which can inhibit seed germination and affect growth of neighboring plants, the movement and degradation of astragalin in the soil remain unclear after being released into the soil.The regular of the movement and degradation of astragalin in five soils was study.The mechanism of degradation astragalin was evaluated with soil enzyme activity and the high-throughput sequencing method.Results showed that the Rf of astragalin was 0.14～0.51 with weak to moderate- mobility in five soils; The degradation of astragalin fitted well with a first-order kinetic equation, with astragalin concentrations decreasing rapidly and then maintaining relatively constant thereafter.The half-lives of astragalin in the non-sterilized soils were 2.68～18.55 h, and 111.8 h in the sterilized fluvo-aquic soil.The activities of soil dehydrogenase, polyphenol oxidase and β-glycosidase were all increased after adding astragalin.The high-throughput sequencing results showed that the diversity of soil microbial communities was changed and the relative abundances of Nocardioides, Sohingomonas, Novosphingobium, Pimelobacter, Aeromicrobium, Pedobacter, Lysobacter, Thermomonas, Mycoplana, Paenibacillus, Rhodococcus and Mycoplasma was increased, these bacteria may be involved in the degradation of astragalin in soils.

Flaveria bidentis; astragalin; secondary metabolite; soil movement; biodegradation; high-throughput sequencing

10.16258/j.cnki.1674-5906.2016.10.008

Q14

A

1674-5906（2016）10-1644-09

張瑞海, 宋振, 付衛(wèi)東, 張婷, 黃成成, 朱昌雄, 張國良.2016.紫云英苷在黃頂菊適生土壤中的遷移及降解[J].生態(tài)環(huán)境學報, 25(10): 1644-1652.

ZHANG Ruihai, SONG Zhen, FU Weidong, ZHANG Ting, HUANG Chengcheng, ZHU Changxiong, ZHANG Guoliang.2016.Migration and degradation of astragalin in the suitable soil for Flaveria bidentis [J].Ecology and Environmental Sciences, 25(10): 1644-1652.

國家重點研發(fā)計劃項目（2016YFSF03）；國家自然科學基金項目（41501280）

張瑞海（1985年生），男，博士研究生，研究方向為入侵植物防控。E-mail: ruihai.321@163.com *通信作者。E-mail: zhangguoliang@caas.cn

2016-09-11