HPLC法測定赤芝不同生長期不同部位靈芝酸A的含量

黃文康，黃琴偉，郭增喜，張文婷*（．浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 30053；．浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江 杭州 3005）

HPLC法測定赤芝不同生長期不同部位靈芝酸A的含量

黃文康1，黃琴偉2，郭增喜2，張文婷2*
（1．浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053；2．浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江 杭州 310052）

建立測定赤芝中靈芝酸A的HPLC方法，并研究赤芝不同生長期和不同部位靈芝酸A的含量。Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（250 mm×4．6 mm，5 m），乙腈（A）-0．05 mol·L-1磷酸二氫銨水溶液（B）作為流動相梯度洗脫，體積流量1．0 mL·min-1，柱溫25℃，檢測波長254 nm。結(jié)果表明，靈芝酸A在0．6165 mg～8．16 mg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系；平均回收率為96．1%（n=9）。不同生長期和不同部位靈芝酸A含量有差異：未成熟的靈芝蕾＞成熟期的子實(shí)體，菌蓋＞柄。通過對不同生長期和不同部位靈芝酸A的含量比較分析，為建立赤芝質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和合理開發(fā)利用提供了參考依據(jù)。

赤芝；生長期；不同部位；高效液相色譜

靈芝（Ganoderma lucidum） 是屬于擔(dān)子菌綱、多孔菌屬、靈芝科的一類大型真菌，以子實(shí)體入藥，是我國傳統(tǒng)珍貴藥材，目前進(jìn)行人工培養(yǎng)的有赤芝（紅芝） [Ganoderma lucidum（Leyss．ex Fr．）Karst]、紫芝（Ganoderma sinense Zhao,xu et Zhang）等。臨床和藥理實(shí)驗(yàn)研究廣泛應(yīng)用的是赤芝[1]。靈芝性平味甘，歸心、肺、肝、腎經(jīng)。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明赤芝具有鎮(zhèn)靜安神，降血糖，保肝解毒，抗腫瘤，免疫調(diào)節(jié)等作用[2]。靈芝中含有多種化學(xué)成分，其中有效化學(xué)成分包括多糖、三萜類化合物、肽和氨基酸、蛋白質(zhì)、腺苷、有機(jī)酸、生物堿等，Kutoba等[3]首次從靈芝中分離得到靈芝酸A、靈芝酸B，研究表明靈芝酸有較強(qiáng)藥理活性，是靈芝的主要有效成分[4]。靈芝酸A抑制細(xì)胞組織胺的釋放，增強(qiáng)了消化系統(tǒng)機(jī)能[5]。本文建立靈芝酸A測定方法，并對赤芝不同生長期和不同部位靈芝酸含量進(jìn)行比較，為靈芝研究提供合理參考。

1 儀器與試劑

Agilent 1200 Series液相色譜儀（G1311A Quat Pump；G1329A ALS；G1316A TCC；G1314B DAD）；賽多利斯CP225D電子天平；TU-1901型紫外-可見分光光度計(jì)，北京普析通用公司；液相色譜流動相用色譜純乙腈，水為純化水，所用試劑（乙醇、甲醇、氯仿、磷酸磷酸二氫銨）均為分析純。

對照品靈芝酸A，購于中科院藥用植物研究所，純度98%以上，可供含量測定用。

實(shí)驗(yàn)原料靈芝由金華壽仙谷藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院鑒定為多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum（Leyss．ex Fr．）Karst的干燥子實(shí)體。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 HPLC測試條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0．05 mol·L-1磷酸二氫銨水溶液（B） 梯度洗脫（0～8 min，18．5%～22．5%A；8 min～90 min，25．5%～38%A）；檢測波長：254 nm；柱溫：25℃；流速：1．0 mL·min-1。進(jìn)樣量：10 μL（圖1）。

圖1 赤芝樣品HPLC色譜圖Fig．1 Chromatogram of Ganoderma lucidum

2.2 溶液的制備

2．2．1 對照品溶液的制備

精密稱取靈芝酸A對照品適量，加甲醇制成每1mL含約123．3 μg的溶液，即得。

2．2．2 供試品溶液的制備

精密稱取赤芝（金華壽仙谷藥業(yè)有限公司，批號11120501-1）2 g，加95%乙醇50 mL，水浴回流1 h，過濾，用溶劑洗滌濾渣及容器，蒸干，用甲醇定容至5 mL，用0．45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察

3．1．1 線性關(guān)系的考察

精密吸取靈芝酸A對照品溶液（濃度為123．3 μg·mL-1） 5 μL、10 μL、15 μL、20 μL：靈芝酸A對照品溶液（濃度為0．816 mg·mL-1） 5 μL，10 μL進(jìn)樣，記錄峰面積，以色譜峰面積（Y）對進(jìn)樣量（X）進(jìn)行回歸，計(jì)算回歸方程，靈芝酸A的線性方程為Y=801．9X＋11．924，r=1．0000，說明靈芝酸A在進(jìn)樣量0．6165 mg～8．16 mg范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系。

3．1．2 精密度試驗(yàn)

精密吸取靈芝酸A對照品溶液，按2．1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積。結(jié)果靈芝酸A面積的RSD為0．6%。表明本實(shí)驗(yàn)儀器的精密度良好。

3．1．3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密取同一批赤芝（金華壽仙谷藥業(yè)有限公司，批號11120501-1）粉末6份，按2．2．2項(xiàng)下方法制備樣品溶液，測定峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果顯示，靈芝酸A平均含量為0．195 mg·g-1，RSD為2．7%。

3．1．4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一份供試品溶液和對照品溶液，分別在0、1 h、4．5 h、11．5 h、16．5 h、30 h進(jìn)樣，結(jié)果靈芝酸A對照品RSD為1．08%、供試品溶液為1．34%，表明供試品溶液和對照品溶液在30 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3．1．5 回收率試驗(yàn)

精密稱取同一批赤芝（金華壽仙谷藥業(yè)有限公司，批號11120501-1）粉末9份，分別精密加入靈芝酸A對照品溶液適量，按2．2．2項(xiàng)下方法制備，按

2．1項(xiàng)下色譜條件測定，結(jié)果見表1。

表1 赤芝中靈芝酸A的加樣回收率實(shí)驗(yàn)Tab．1 Recoveries of ganoderic acid A in Ganoderma lucidum

回收率為加入對照品后測得量減去加入對照品前原有量除以對照品的量，結(jié)果表明HPLC法測定具有良好的回收率，系統(tǒng)誤差小，本方法準(zhǔn)確度高。

3.2 樣品測定

對收集的實(shí)驗(yàn)藥材按2．2．2項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按2．1項(xiàng)下色譜條件測定3批樣品子實(shí)體、靈芝蕾靈芝酸A含量，3批樣品不同部位的靈芝酸A含量，結(jié)果見表2、表3。

表2 樣品子實(shí)體、靈芝蕾含量測定結(jié)果Tab．2 Assay results of fruiting body and Ganoderma lucidum bud

表3 靈芝樣品不同部位含量測定結(jié)果Tab．3 Assay results of different part in Ganoderma lucidum

從表2、表3可以看出，3批樣品靈芝蕾中靈芝酸A含量均大于子實(shí)體中靈芝酸A含量，菌蓋中靈芝酸A含量均大于柄中靈芝酸A含量，表明本測定方法簡單、方便。

4 結(jié)論

在Agilent 1200 Series上，采用Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4．6 mm，5 μm）色譜柱，考察了甲醇-乙酸水溶液、乙腈-乙酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液、乙腈-磷酸二氫銨水溶液等流動相系統(tǒng)，最終選擇乙腈-0．05 mol·L-1磷酸二氫銨水溶液作為流動相，并且比較不同的pH，結(jié)果顯示其pH值須小于4，靈芝酸A與其他成分色譜峰分離良好，達(dá)到基線分離。

取靈芝酸A對照品溶液適量，置于紫外分光光度計(jì)中進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果顯示靈芝酸A在254．00 nm波長處有最大吸收光譜圖，確定254 nm為測定波長。

在供試品，分別溶液的制備過程中，分別對提取溶液（95%乙醇、甲醇、氯仿）、提取時(shí)間（30 min、60 min、90 min）、提取量（1．0 g、2．0 g、3．0 g）進(jìn)行了考察，結(jié)果表明不同提取條件含量差異性不大，考慮環(huán)保與樣品提取完全等因素，選擇2．0 g樣品粉末用50 mL的95%乙醇加熱回流60 min為最終提取方法。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，赤芝不同部位不同生長期的靈芝酸A含量有所差異。實(shí)驗(yàn)還比較了紫芝中靈芝酸A含量，結(jié)果證明紫芝中幾乎不含靈芝酸A。靈芝酸A是藥材赤芝的主要有效成分，其含量測定是評價(jià)藥材質(zhì)量的有效手段之一，本實(shí)驗(yàn)所建立的HPLC方法簡單快捷，穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性均較好，可為赤芝的質(zhì)量評價(jià)提供依據(jù)。

[1]盧振，陳金和，王雨來，等．靈芝的研究及應(yīng)用進(jìn)展[J]．時(shí)珍國醫(yī)國藥，2003（9）：577-581．

[2]李欽艷，陳逸湘，鐘瑩瑩．靈芝主要活性成分及其功能的研究進(jìn)展（綜述）[J]．食藥用菌，2015（2）：86-91．

[3]Kubota T,Asaka Y,Miura I,et al．Structures of ganoderic acid A and B,two new lanostane type bittertritepenes from Ganoderma lucidum[J]．Helv Chim Acta,1982（62）:611-619．

[4]馬友龍，張學(xué)成，祁海艷，等．靈芝酸的研究進(jìn)展[J]．河北醫(yī)學(xué)，2011（10）：1418-1420．

[5]陳曉明，李淑芳，羅瑩，等．靈芝子實(shí)體中靈芝酸A的HPLC定量測定方法[J]．保鮮與加工，2014（5）：57-61．

Determination on Ganoderic Acid A in Ganoderma lucidum with Different Growth Stages and Different Parts by HPLC

HUANG Wen-kang1,HUANG Qin-wei2,GUO Zeng-xi2,ZHANG Wen-ting2
（1．Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053,China; 2．Zhejiang Institute for Food and Drug Control,Hangzhou 310052,China）

To develop an HPLC method for determination of ganoderic acid A,the content of ganoderic acid A in Ganoderma lucidum（Leys．Ex fr．）Karst with different growth stages and different parts were studied．Agilent Zorbax SB-C18 column （4．6 mm×250 mm,5 μm）was used．The mobile phase was a mixture of acetonitrile（A）-0．05mol·L-1ammonium dihydrogen phosphate（B）at a flow rate of 1．0 mL·min-1for gradient elution．The column temperature was 25℃,and the analysis was monitored at 254 nm．The results showed that ganoderic acid A had good linear relationships in the range of 0．6165 mg～8．16 mg, and the average recoveries was 96．1% （n=9）．The content of ganoderic acid A are different in different growth stages and different parts,such as immature G.lucidum bud＞maturity fruiting body,pileus＞stalk．By comparing contents of ganoderic acid A in different growth stages and different parts,it provides a reference of quality standards and rational exploitation of G.lucidum．

Ganoderma lucidum;growth stages;different parts;HPLC

S646.9

A

1003-8310（2017）01-0056-03

10．13629/j．cnki．53-1054．2017．01．013

黃文康（1993-），男，在讀碩士研究生，主要從事中藥質(zhì)量評價(jià)分析與新藥開發(fā)研究。E-mail：846087613＠qq．com

*通信作者：張文婷（1963-），女，博士，主任中藥師，主要從事中藥質(zhì)量評價(jià)分析與新藥研究。E-mail：leozhwt＠163．com

2016-11-25