高效液相色譜技術在中藥配方顆粒質量控制中應用現狀

陳紅林，楊撿美，汪蘭，夏新華，黃本東，肖利輝，胡波，譚桂林

1.湖南華納大藥廠股份有限公司，湖南 長沙 410208；2.中藥配方顆粒湖南省工程研究中心，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208

高效液相色譜技術在中藥配方顆粒質量控制中應用現狀

陳紅林1，2，楊撿美1，2，汪蘭1，2，夏新華2，3，黃本東1，肖利輝1，胡波1，2，譚桂林3

1.湖南華納大藥廠股份有限公司，湖南 長沙 410208；2.中藥配方顆粒湖南省工程研究中心，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208

中藥配方顆粒是中藥飲片改革的新成果，在國內外有著廣泛的應用前景。建立切實可行的中藥配方顆粒質量控制標準是中藥配方顆粒規范化、國際化的前提條件。高效液相色譜技術的不斷發展，使其成為中藥配方顆粒質量控制與評價中必不可少的技術手段。本文對近年來高效液相色譜技術在中藥配方顆粒有效成分含量測定、指紋圖譜建立、原藥材鑒別及化學成分研究等方面的應用作一綜述，為中藥配方顆粒質量控制提供參考。

中藥配方顆粒；高效液相色譜法；質量控制；綜述

中藥配方顆粒是以符合炮制規范的中藥飲片為原料，經現代工藝提取精制而成的供臨床調劑用的顆粒制劑，是傳統飲片的補充形式。中藥配方顆粒基于處方調配方便性和準確性而誕生，具有隨證加減的優勢和特色，克服了傳統中藥湯劑煎熬費時、服用不便、工藝粗放等缺點，順應了現代社會對藥物的基本要求，是中藥飲片與時俱進的產物。

配方顆粒的出現在國內外有著廣闊的市場前景，但在飲片原有性狀與顯微鑒別特征消失后如何控制其質量，是目前生產研究中的難點與熱點。高效液相色譜法（HPLC）依托多種檢測器及種類豐富的色譜柱，流動相選擇廣，適用性強，適合大多數中藥成分的分離分析，成為中藥質量評價研究中重要方法之一，在中藥配方顆粒失去飲片外形后的質量檢驗與鑒別等方面具有應用優勢。茲就HPLC技術近年在中藥配方顆粒質量控制中的應用作一綜述，為中藥配方顆粒質量控制提供思路。

1　中藥配方顆粒含量測定研究

有效成分的含量是影響中藥藥效的關鍵因素，建立必要的有效成分含量檢測手段是質量控制的關鍵，同樣在中藥配方顆粒質量標準中有效成分的含量測定也不可或缺。中藥所含化學成分復雜，其療效是多組分、多靶點的綜合表現，HPLC具有分離和測定的雙重作用，在中藥配方顆粒有效成分含量測定中不僅能對單一有效成分進行含量測定，還能建立起多指標成分的定量方法。

張氏等[1]采用HPLC測定甘草配方顆粒中甘草酸含量，采用Agilent Extend-C18柱，并對流動相系統進行比較和調整研究，在甲醇-0.2 mol/L醋酸銨系統中甘草酸分離效果較好，流速為1.0 mL/min，250 nm波長檢測，甘草酸在0.492～7.872 μg呈現良好線性關系，方法精密度、重復性良好，測定結果準確。積雪草配方顆粒的活性成分積雪草苷屬于紫外末端吸收的化合物，紫外檢測器無法檢測。曹氏等[2]首次采用HPLC-蒸發光散射檢測器（ELSD）法測定了積雪草配方顆粒中積雪草苷的含量，積雪草苷在23.2～580 μg/mL范圍內呈良好線性關系，此分析方法簡便，且結果準確，適用于積雪草配方顆粒劑的質量控制。而在玄參配方顆粒研究中，3種主要成分哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸在高效液相單一波長下同時檢出干擾較大，定量誤差大。周氏等[3]通過紫外吸收波長考察發現，210、278 nm雙波長檢測能準確定量三者含量，故可為玄參配方顆粒的質量控制及標準研究提供參考依據。

除小檗堿外，巴馬汀、黃連堿、表小檗堿、藥根堿等生物堿也是黃連的主要有效成分。在僅有小檗堿一個對照品的基礎上，劉氏等[4]通過高效液相一測多評法實現了黃連配方顆粒中上述成分的同步含量測定。在線性范圍內，成分的量與檢測器響應成正比，以小檗堿為內標，建立該組分與其他組分之間的相對校正因子，計算其他組分含量，建立了黃連配方顆粒一測多評的多指標質量控制方法。在對三七配方顆粒4種皂苷R1、Rg1、Re、Rb1進行HPLC分離時，李氏等[5]采用了溶劑/流速雙梯度-整體柱的方法。三七中Rg1和Re同屬于20（S）-原人參三醇類，結構性質相近，而R1和Rb1極性相差較大，應用一般的十八烷基填充柱因柱壓限制難以對4個組分進行分離，且耗時長，因此李氏等[5]采用整體柱，通過對乙腈濃度、流速進行雙梯度優化，20 min內完成了三七配方顆粒中4種皂苷成分質量分析。在建立炒蒼耳子配方顆粒多成分質量控制標準研究中，Chen B等[6]運用超高效液相色譜，采用小粒徑填料的Acquity BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），選取炒蒼耳子中與臨床抗炎療效相關的5種酚酸類成分——新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸和洋薊素作定量分析，10 min內實現了此5種綠原酸類化合物的同時測定，分析時間短，準確性高。此外，另有應用HPLC分別對配方顆粒銀翹散[7]、荷葉[8]、紫花地丁[9]中有效物質含量進行了測定，為上述配方顆粒質量控制提供了簡便、快速、可行的檢測方法。

2　中藥配方顆粒指紋圖譜研究

在中藥配方顆粒質量控制研究中，其多組分的特性，要求采用與之相適應的、能提供豐富鑒別信息的檢測方法評價質量。指紋圖譜是近年迅速發展起來的中藥質量控制模式中的一種，是建立在中藥化學成分系統研究基礎上，能較全面反映中藥中所含化學成分種類與含量，進而對質量進行整體描述和評價的方法。在現階段，中藥絕大多數有效成分未明確的情況下，指紋圖譜的建立能大大提高中藥質量控制的技術水平及科技含量。HPLC能實現中藥中絕大多數成分的分離分析檢測，在中藥配方顆粒的指紋圖譜的研究中，HPLC技術應用最為廣泛。

梁氏等[10]采用HPLC-線性梯度洗脫法對12批不同廠家虎杖配方顆粒進行研究，通過采用SunFire C18色譜柱，乙腈-0.05%磷酸溶液1.0 mL/min流速梯度洗脫，230 nm波長檢測，確定了14個共有峰，且相似度評價均大于0.98，獲得的指紋圖譜穩定可靠，為虎杖配方顆粒質量控制和評價提供了參考。陳氏等[11]對淫羊藿、骨碎補等單味配方顆粒按處方量混合制成的補腎壯骨配方顆粒HPLC指紋圖譜進行了研究，采用Inertsil C18柱，乙腈-水梯度洗脫，流速為1 mL/min，檢測波長285 nm，柱溫30 ℃。10批樣品共標定了9個共有峰且相似度＞0.930，獲得的圖譜可清晰反映主要藥味骨碎補與淫羊藿藥材指紋特征。超高效液相色譜較常規HPLC峰容量、靈敏度、分析效率及分辨率有很大提高。在三七配方顆粒指紋圖譜分析研究中，胥氏等[12]采用超高效液相色譜法，Agilent poroshell 120EC C18色譜柱（100 mm×4.6 mm，2.7 μm），乙腈-水為流動相梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，203 nm波長檢測，提高了工作效率，超高效液相建立的三七配方顆粒的指紋圖譜只需23 min，為中藥配方顆粒的快速質量控制提供了可靠的方法。應用HPLC對中藥配方顆粒進行指紋圖譜的研究[13-15]，為配方顆粒全面和整體的質量評價提供了參考。

3　中藥配方顆粒鑒別研究

中藥配方顆粒的原材料鑒別、真偽鑒別、優劣鑒別等是控制配方顆粒質量的有效途徑，目前HPLC技術在該方面研究相對較少。蘇氏等[16]對黃連中的川連（味連、雅連）及云連配方顆粒進行了HPLC分析，結果云連的色譜圖與味連和雅連有明顯差別，云連缺少表小檗堿的色譜峰，據此可鑒別川連（味連、雅連）和云連，從而對藥材來源進行鑒別。王氏等[17]對白鮮皮配方顆粒的HPLC特征圖譜進行了研究，選擇了Megres5-C18色譜柱（Hanbon，250×4.6 mm，5 μm），用二極管陣列檢測器（DAD）記錄白鮮皮配方顆粒樣品溶液的三維吸收圖，發現在228 nm左右可檢測到最多的色譜峰，同時主要有效成分黃柏酮和梣酮均可得到較好的檢測，以乙腈-0.1%磷酸系統進行梯度洗脫，流速1 mL/min，6個共有峰組成了白鮮皮配方顆粒的特征圖譜，共有峰具有專屬性，相對保留時間比較穩定，為白鮮皮配方顆粒質量控制提供了檢測依據，可用于鑒別白鮮皮配方顆粒的真偽。楊氏等[18]對半夏及其炮制品姜半夏不同提取部位的HPLC特征圖譜進行研究，通過HPLC梯度洗脫建立半夏及其炮制品姜半夏的水及75%、95%乙醇提取部位的特征圖譜，分別建立了半夏及其炮制品姜半夏不同部位的HPLC特征圖譜共有模式，確認了肌苷、鳥苷、腺苷、琥珀酸、鹽酸麻黃堿、6-姜辣素6個特征峰。與半夏HPLC特征圖譜相比，姜半夏在保留時間18.3、73.5 min附近新增2個峰（10號峰、19號峰6-姜辣素），首次建立了半夏及其炮制品姜半夏不同提取部位HPLC特征圖譜。該方法穩定、簡便、可靠，可有效控制半夏及姜半夏飲片的質量。

4　中藥配方顆粒化學成分研究

化學成分是藥物發揮作用的基礎，HPLC高效的分離特性結合質譜（MS）強大的結構表征能力，為中藥提取物快速確定已知化合物，以及鑒別未知化合物或微量成分提供了有效方法，為中藥配方顆粒化學成分快速分離鑒別創造了條件。

Li S L等[19]以三黃瀉心湯為例，采用超高效液相色譜-光電二極管陣列檢測器-飛行時間質譜法（UPLC-PDA-TOF/MS），快速對傳統湯劑和配方顆粒進行了全成分分析，總共鑒定出了39種化合物。利用最小二乘判別分析（OPLS-DA）對差異成分進行鑒別，發現合煎湯劑小檗堿、巴馬汀、表小檗堿、黃芩苷、wonogoside和2-O-golloyl-1-O-cinnamoylglucose明顯降低，而大黃素明顯升高。Ma C H等[20]采用UPLC-PDA-TOF/MS技術對三拗湯配方顆粒和傳統湯劑化學成分一致性進行對比分析，總共鑒定了42個化合物，其中麻黃堿、偽麻黃堿、去甲偽麻黃堿、甘草苷G2、甘草苷H2，苦杏仁苷等14個化合物在煎煮過程中發生了改變。Shang E X等[21]通過UPLC-QTOF-MS技術對桃紅四物湯配方顆粒與傳統湯劑的化學成分對比研究，發現芍藥內酯苷、芍藥苷、沒食子酸、苦杏仁苷和羥基紅花黃色素A在兩者含量上具有顯著差異，并提出用線性回歸分析對配方顆粒的用量比例進行優化，將桃紅四物湯（當歸∶川芎∶白芍∶熟地黃∶桃仁∶紅花）配方顆粒比例調整為2.5∶0.2∶1∶0.5∶0.6∶0.1，以保持配方顆粒與傳統湯劑成分含量的一致。

5　其他應用

Zhang X L等[22]將HPLC及UPLC-PDA-QTOFMS/MS技術用于快速尋找配方顆粒質量控制的特征化學標記物，以川芎配方顆粒為例，首先對川芎生藥材、傳統煎劑及配方顆粒HPLC指紋圖譜進行了構建，采用中位數法產生對照指紋圖譜，找出其特征峰，進一步利用液質聯用技術對特征峰進行鑒定，從而找出特征成分并進行定量分析，川芎中3個主要峰成分鑒定為阿魏酸、川芎內酯I和川芎內酯H。定量結果顯示，阿魏酸及川芎內酯H含量低于1.0 mg/g，川芎內酯I含量為4.40 mg/g，適合作為川芎配方顆粒質量控制的定量標志物，而阿魏酸及川芎內酯H則作為配方顆粒質量評價的定性指標，此方法為其他中藥配方顆粒的質量評價指標的建立提供了參考。Chen H G等[23]采用HPLC-二極管陣列檢測器-蒸發光檢測器（HPLC-DAD-ELSD）聯用技術，結合藥效學和血清藥物化學的方法，對黃芪配方顆粒進行質量評估。黃芪顆粒灌胃大鼠之后對血液進行鑒定發現毛蕊-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮苷、黃芪甲苷、芒柄花素能夠吸收入血，指定這五者作為生物標志物對黃芪顆粒進行質量控制，通過HPLC-DADELSD聯用技術實現了這5個成分的同時定量。

6　展望

中藥配方顆粒是中藥飲片新形式改革的產物，是中藥飲片現代化的成果，建立嚴格的質量標準保證其安全性、有效性是一項長期而艱巨的任務，也是實現中藥現代化的重要基礎和關鍵。

在配方顆粒質量控制研究中，HPLC在技術層面上提供了有力支持。隨著更小顆粒填料色譜柱和超高壓輸液泵的使用，HPLC向著超高效液相色譜技術的發展，分離分析速度大大提高；HPLC與質譜聯用，更實現了對微量成分檢測和未知成分的鑒別。HPLC技術的發展能夠滿足現代中藥研究中對高效能分析儀器的迫切需要，對我國中藥科學研究和質量監測具有重大意義。目前HPLC在中藥配方顆粒質量控制研究中以有效成分含量測定和建立指紋圖譜為主。隨著高效液相色譜儀與多種檢測器聯用技術，多波長檢測技術以及“一測多評”等方法的發展，越來越多的配方顆粒含量測定向著多指標成分定量的中藥質量控制模式發展。中藥多成分的特點也使其質量控制體系立足于中藥特色，越來越多的中藥配方顆粒指紋圖譜得以建立，確保其質量，做到國際認可。HPLC同高分辨質譜的聯用結合藥效學指標更為中藥配方顆粒指紋圖譜基礎之上的“譜效相關”質量控制模式的建立提供了強有力的支持。

此外，中藥外源性有害物質如重金屬、農藥殘留等一直是國際社會關注的焦點，目前中藥材及中藥飲片安全研究報道中，HPLC技術的應用也較為普遍[24-25]，但在中藥配方顆粒中尚無相關研究，今后可在配方顆粒中進行相關限量檢測，為配方顆粒規范化提供更加系統的研究思路。總之，HPLC技術的不斷發展使其在中藥配方顆粒質量控制中成為一種必不可少的分析手段，解決了諸多傳統質量控制方面的技術問題，為建立專屬性強的鑒別方法和更加客觀的質量評價方法提供了技術支持，其應用能夠對原藥材、中間產品、成品全程監控，以便更好地保證中藥配方顆粒安全、穩定、有效。筆者建議，中藥配方顆粒的研發單位及生產企業應加強技術合作與交流，采取切實可行的辦法解決中藥配方顆粒失去飲片外形后其品種的真偽鑒別和質量評價技術問題，為中藥配方顆粒的健康發展提供一個新的研究技術平臺。

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Application Status of HPLC Technology in Quality Control of TCM Dispensing Granules

CHEN Hong-lin1,2, YANG Jian-mei1,2, WANG Lan1,2, XIA Xin-hua2,3, HUANG Ben-dong1, XIAO Li-hui1, HU-Bo1,2, TAN Gui-lin3
(1. Hunan Warrant Pharmaceutical Co., Ltd, Changsha 410208, China; 2. Hunan Engineering Research Center of TCM Dispensing Granules, Changsha 410208, China; 3. School of Pharmacy, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China)

TCM dispensing granules are new achievements in the reform of TCM and have a vast application prospect at home and abroad. A viable quality control standard is a prerequisite for the standardization and internationalization of TCM dispensing granules. With the continuous development of HPLC, HPLC has become an essential technique for quality control of TCM dispensing granules. This article reviewed the application of HPLC in dispensing granules, such as the determination of effective components, the establishment of fingerprint, the identification of the original materia medica and chemical components in recent years, in order to provide references for quality control of TCM dispensing granules.

TCM dispensing granules; HPLC; quality control; review

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.12.034

R283.6

A

1005-5304(2016)12-0133-04

夏新華，E-mail：xiaxinhua001@163.com

（2015-10-13；編輯：梅智勝）