乳制品中黃曲霉毒素M1的常用檢測(cè)方法比較分析

丁松喬，肖志剛

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,哈爾濱150030；2.黑龍江省質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院,哈爾濱150028）

乳制品中黃曲霉毒素M1的常用檢測(cè)方法比較分析

丁松喬1，2，肖志剛1

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,哈爾濱150030；2.黑龍江省質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院,哈爾濱150028）

本文介紹了黃曲霉毒素M1的性質(zhì)、產(chǎn)生、危害、國(guó)內(nèi)外的限量標(biāo)準(zhǔn)以及集中常用的黃曲霉毒素M1的檢測(cè)方法，并對(duì)幾種常用的檢測(cè)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。通過(guò)對(duì)檢出限、靈敏度及回收率等實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較，綜合前處理過(guò)程的環(huán)保安全性、過(guò)程繁瑣情況及投資成本，提出該幾種常用方法的優(yōu)缺點(diǎn)，分析目前幾種方法在檢測(cè)黃曲霉毒素M1的應(yīng)用中存在的問(wèn)題。結(jié)合我國(guó)目前發(fā)展需要和常用檢測(cè)方法的運(yùn)用情況，提出將目前常用幾種方法互補(bǔ)聯(lián)用，研究廉價(jià)快速的檢測(cè)試紙是未來(lái)工作的重點(diǎn)和今后發(fā)展的方向。

黃曲霉毒素M1；危害；限量標(biāo)準(zhǔn)；檢測(cè)方法；比較

0 引 言

乳制品營(yíng)養(yǎng)豐富，能夠增強(qiáng)人體免疫力，受到很多國(guó)家的重視。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)居民平均每人每年攝入牛奶約8.1 kg，歐美國(guó)家人均攝入牛奶300 kg，日本約62.1kg[1]。改革開(kāi)放以來(lái)，我國(guó)奶業(yè)快速發(fā)展，乳品加工成為食品工業(yè)中發(fā)展最快的行業(yè)。但是我們必須重視起快速發(fā)展的同時(shí)突顯的問(wèn)題。近年來(lái)頻頻爆發(fā)乳源性疾病，1999年比利時(shí)二惡英污染[2]，2000年日本金黃色葡萄球菌污染[3]，2002年俄羅斯劣質(zhì)乳制品中毒事件，2003年廣東“結(jié)核奶”事件[4]，2004年阜陽(yáng)劣質(zhì)奶粉事件[5]，由此看來(lái)，現(xiàn)有的乳制品安全控制體系仍然不夠健全和完善，不能完全的保障乳制品的安全，發(fā)展“安全牛奶”成為當(dāng)前乳制品發(fā)展的首要任務(wù)。

1 黃曲霉毒素M1的性質(zhì)、產(chǎn)生及危害

黃曲霉毒素M1的基本結(jié)構(gòu)為二呋喃環(huán)的氧雜萘鄰?fù)肿邮綖镃17H12O7，分子量為328，熔點(diǎn)299℃，形狀為無(wú)色的長(zhǎng)方形片狀晶體。在365 nm紫外光的照射下產(chǎn)生藍(lán)紫色熒光。不溶于石油醚，乙醚，正己烷等非極性溶劑，溶于甲醇，氯仿等有機(jī)溶劑，化學(xué)及物理性質(zhì)相當(dāng)穩(wěn)定，巴氏殺菌不能破壞其理化性質(zhì)。

乳制品中的黃曲霉毒素主要為黃曲霉毒素M1（A flatoxins M1，AFM1），AFM1是黃曲霉毒素B1（A flatoxins B1，AFB1）的羥化代謝產(chǎn)物。動(dòng)物在攝入被AFB1污染的飼料后，飼料中的AFB1在肝臟微粒體單氧化酶的催化下，通過(guò)細(xì)胞色素P-448調(diào)節(jié)，AFB1末端的呋喃環(huán)C-10被羥化而生成AFM1，經(jīng)過(guò)代謝產(chǎn)生的AFM1隨乳汁排出[7]。AFM1毒性強(qiáng)，對(duì)人體危害大，1993年世界衛(wèi)生組織WHO將AFM1歸為I類致癌物[8]，其毒性是氰化鉀的5倍，砒霜的40倍。AFM1具有強(qiáng)致癌性和致基因突變性。AFM1進(jìn)入人體后，對(duì)血液、肝臟、腎臟、肌肉有不同程度的破壞，其中對(duì)肝臟和腎臟的危害最大。當(dāng)與乙肝病毒共同作用于肝臟時(shí)形成倍乘風(fēng)險(xiǎn)效應(yīng)，導(dǎo)致肝癌發(fā)生[9,10]。另外，當(dāng)嬰幼兒乳品中含有AFM1時(shí)，對(duì)嬰幼兒健康會(huì)造成很大影響，可以造成發(fā)育遲緩，腎功能降低，肝細(xì)胞癌早發(fā)，甚至可能導(dǎo)致急性中毒死亡。

2 國(guó)內(nèi)外限量標(biāo)準(zhǔn)

鑒于AFM1對(duì)乳及乳制品的污染，目前世界上包括我國(guó)在內(nèi)的60多個(gè)國(guó)家和地區(qū)制定了乳及乳制品中AFM1的限量和標(biāo)準(zhǔn)。包括中國(guó)、美國(guó)和日本在內(nèi)的許多國(guó)家規(guī)定乳及乳制品中AFM1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得超過(guò)0.5μg/kg，歐盟制定的標(biāo)準(zhǔn)更為嚴(yán)格，為0.05μg/kg。其中中國(guó)規(guī)定嬰兒乳品及代乳品中AFM1不得檢出。2004年，歐盟制定嬰兒配方食品的限量標(biāo)準(zhǔn)，AFM1的最大限量為0.025μg/kg。一些主要國(guó)家乳制品中的限量標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 主要國(guó)家乳及乳制品中AFM1的限量標(biāo)準(zhǔn)

3 乳品中常見(jiàn)的AFM1的檢測(cè)方法

自1963年A llcroft發(fā)現(xiàn)牛奶中含有AFM1以來(lái)，對(duì)AFM1的檢測(cè)方法，各國(guó)科學(xué)家做了大量的研究，建立了30余種檢測(cè)方法。AFM1的檢測(cè)方法主要有五大類：一類是定性檢測(cè)方法，即生物學(xué)方法，現(xiàn)已基本停止使用；第二類是半定量檢測(cè)方法，如薄層色譜法（TLC）；第三類AFM1定量檢測(cè)方法，包括建立在色譜基礎(chǔ)上的理化方法，如液相色譜法（LC）、高效液相色譜法（HPLC）和近年來(lái)新發(fā)展起來(lái)的質(zhì)譜檢測(cè)（M ASS）；第四類是建立在免疫化學(xué)基礎(chǔ)上的快速測(cè)定方法，如放射免疫測(cè)定（R IA）和酶聯(lián)免疫測(cè)定法（ELISA）；第五類是免疫化學(xué)和儀器分析結(jié)合的方法，如免疫親和柱-熒光分光光度法、免疫親和柱-HPLC法等[11]。

3.1 薄層層析法(TLC)

薄層層析法又稱薄層色譜，是色譜法中的一種，是快速分離定性分析或半定量分析少量物質(zhì)的檢測(cè)方法。1990年美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)（AOAC）將薄層層析法（TLC）定為標(biāo)準(zhǔn)方法。該種方法樣品經(jīng)提取、濃縮、薄層分離，AFM1經(jīng)波長(zhǎng)365 nm的紫外光產(chǎn)生藍(lán)紫色熒光，根據(jù)其在薄板上顯示的熒光最低檢出量與標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度比較測(cè)定強(qiáng)度。

黃曲霉毒素M1用氯仿萃取，揮去氯仿，加入四氯化碳和氯化鈉-甲醇溶液于殘?jiān)校儆寐确绿崛。詈笥帽訉游龇ǘ繖z測(cè)。奶粉中黃曲霉毒素M1的檢出限為0.5μg/kg，該方法用1∶3硫酸顯色后檢出限可提高為0.3μg/kg。以空白樣品為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行3種質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5，2.0，10.0μg/kg的回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果平均回收率可達(dá)到85.6%～98.6%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為11%，符合實(shí)驗(yàn)要求。

由于薄層層析法不依賴儀器、成本低并且易于普及，20世紀(jì)60年代是國(guó)內(nèi)外檢測(cè)AFM1的主要方法，常在檢出限較低的情況下使用。但是，由于該方法在嬰幼兒乳品AFM1檢測(cè)時(shí)靈敏性和重現(xiàn)性較差，且檢出限無(wú)法滿足國(guó)家規(guī)定的限量要求，逐漸被更靈敏高效的方法取代。

3.2 免疫親和柱法

20世紀(jì)90年代，分析領(lǐng)域得到一種具備高專一性吸附和抗干擾特性，靈敏度高，凈化效果好的新技術(shù)-免疫親和柱法。在乳粉試樣中分別加入水和鹽制成復(fù)原乳，離心使脂肪與AFM1乳清分離。吸取上清液，過(guò)濾，通過(guò)免疫親和柱，使AFM1與專一抗體結(jié)合。用洗滌液去除免疫親和柱中的雜質(zhì)，用甲醇過(guò)柱，使AFM1與抗體分離洗脫。甲醇洗脫液中加入顯色劑后以熒光分析儀測(cè)定，檢測(cè)低限為≤0.1μg/kg。

3.2.1 實(shí)驗(yàn)分析

在定容到50 mL的未檢出黃曲霉毒素M1樣品中分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0，0.1，0.5，1.0μg/kg的黃曲霉毒素M1，進(jìn)行回收率檢測(cè)，其結(jié)果如表2所示。

表2 奶粉及液乳樣品添加回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，該種方法檢測(cè)乳制品中AM F1在0.1～1μg/kg濃度范圍內(nèi)，平均回收率為89.6%～96.0%，CV變異系數(shù)為0.52%～5.8%，滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)要求。根據(jù)檢測(cè)，免疫親和柱法檢出限為0.1μg/kg，低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)0.5μg/kg。

Scott[12]也使用此方法，用免疫親和柱分離樣品，利用熒光光度計(jì)檢測(cè)牛乳中的AFM1，檢出限為0.05μg/L，平均回收率可達(dá)到97%。此方法顯著簡(jiǎn)化了樣品的前處理過(guò)程，無(wú)需使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)AFM1，降低實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)操作者潛在的危害，但整體操作較繁雜，耗時(shí)長(zhǎng)，且存在試劑浪費(fèi)和污染環(huán)境的不足，使該方法的應(yīng)用推廣受到一定限制。

3.3高效液相色譜法(HPLC)

目前國(guó)內(nèi)外檢測(cè)AFM1應(yīng)用最廣泛的方法是高效液相色譜法（HPLC）[13]。其原理是樣品經(jīng)過(guò)固定比例的有機(jī)溶劑萃取后，經(jīng)裝有相應(yīng)填料的凈化柱去除雜質(zhì)，樣品經(jīng)凈化處理后再進(jìn)行濃縮干燥，弱酸條件下衍生，最后經(jīng)過(guò)反向C 18柱分離，檢測(cè)器定量檢測(cè)。取樣品10 g，用水將其溶解并定容至100mL，離心，取上清液通過(guò)免疫親和柱，用1 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，定容至2 mL，混勻后用高效液相色譜儀進(jìn)行分析。此方法以甲醇和水為流動(dòng)相，柱溫30℃，流速0.8 mL/min；熒光檢測(cè)器發(fā)射波長(zhǎng)435 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為365 nm，進(jìn)樣體積為50μL。

3.3.1 實(shí)驗(yàn)分析

向黃曲霉毒素M1本底值未檢出的乳粉樣品中分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5，1.0，2.0μg/kg的黃曲霉毒素M 1，進(jìn)行回收率檢測(cè)，結(jié)果如表3所示。

表3 HPLC法測(cè)定乳粉中黃曲霉毒素M1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)以上結(jié)果分析，回收率為91.2%～106.4%，乳粉中黃曲霉毒素M1的最低檢出限可達(dá)0.04μg/kg。

取黃曲霉毒素M1真值為0.085μg/kg的陽(yáng)性奶粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)30 g，一式3份平行樣，用該種方法進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果分別為0.0812，0.0837，0.0841μg/kg，3次結(jié)果均在允許范圍內(nèi)，與真值相近。

通過(guò)采用HPLC法進(jìn)行檢測(cè)分析，該方法具有高效、靈敏、快速、準(zhǔn)確、檢出限低、特異性強(qiáng)及重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，但是樣品處理繁瑣（前處理會(huì)造成AFM 1損失）、凈化柱消耗大、檢測(cè)成本較高，同時(shí)對(duì)操作者的專業(yè)素養(yǎng)要求較高。

3.4 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）

1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmannn，荷蘭學(xué)者Uan Weerman和Schuurs分別報(bào)道了將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方法，最初主要用于病毒的檢測(cè)，70年代中后期開(kāi)始用于真菌毒素的檢測(cè)。取適量鮮乳，稱取2 kg離心5 min，去除脂肪，取上清液用于檢測(cè)。向微孔中加入200μL樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，室溫2 h，除去微孔中的內(nèi)容物，用緩沖液洗滌微孔3次，輕拍微孔板，棄去殘留液。加入100μL酶標(biāo)物于微孔中，室溫15 min，洗滌微孔；加入100μL底物于微孔中，室溫15min；添加100μL終止液，使用酶標(biāo)儀在450 nm下記錄每個(gè)微孔的OD值，根據(jù)對(duì)應(yīng)的黃曲霉毒素M1濃度值繪制曲線。

3.4.1 實(shí)驗(yàn)分析

向未檢出樣品中添加黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)溶液0.25，0.50，1.0，2.0，5.0μg/kg，分別進(jìn)行回收率測(cè)定，每個(gè)濃度進(jìn)行3個(gè)平行樣品測(cè)定，結(jié)果如表4所示。

表4 ELISA法測(cè)定乳粉中黃曲霉M1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)以上數(shù)據(jù)分析，樣品添加黃曲霉毒素M1的平均回收率為90.0%～107.0%，可見(jiàn)此方法對(duì)于測(cè)定鮮乳中黃曲霉毒素M1質(zhì)量分?jǐn)?shù)的穩(wěn)定性好，結(jié)果可靠。目前利用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）對(duì)AFM1進(jìn)行檢測(cè)已得到廣泛應(yīng)用，該方法樣品處理簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確穩(wěn)定，特異性強(qiáng)，干擾小，方便快捷，靈敏度高且檢測(cè)成本較低，但由于酶本身具有不穩(wěn)定性，可能出現(xiàn)少量的假陽(yáng)性，會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成一定的影響。

4 檢測(cè)結(jié)果對(duì)照

以上4種檢測(cè)方法是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外檢測(cè)分析乳及乳制品中AFM1最常用的方法，各自的特點(diǎn)如表5所示。

表5 4種檢測(cè)方法分析比較

5 結(jié)果與討論

綜上所述，樣品前處理過(guò)程中需要提取凈化的方法，操作復(fù)雜，時(shí)間較長(zhǎng)，勞動(dòng)強(qiáng)度大。TLC的樣品前處理繁瑣，靈敏度較差，特異性差，回收率較低，樣品的污染性較高；免疫親和柱的特異性較好，但是需要兩種方法的結(jié)合才能定量檢測(cè)，檢測(cè)成本和技術(shù)要求較高；HPLC所需要的檢測(cè)成本高，凈化柱消耗較多，所需要的儀器設(shè)備昂貴，投資大，對(duì)人員的操作技術(shù)要求高；ELISA法相對(duì)來(lái)說(shuō)，使用簡(jiǎn)便，操作快捷，污染程度小，特異性強(qiáng)，靈敏度也高，適用于大批量樣品的篩選及檢驗(yàn)，成本較低，適合缺乏大型儀器設(shè)備的實(shí)驗(yàn)室。此外，上述方法都具有相同的不足之處：對(duì)樣品進(jìn)行前處理時(shí)需要接觸有毒、有害的有機(jī)試劑，危害實(shí)驗(yàn)人員健康且污染環(huán)境；操作過(guò)程繁瑣、時(shí)間長(zhǎng)；檢測(cè)方法靈敏度有限，不能滿足歐盟的限量要求，由于當(dāng)前ELISA主要針對(duì)鮮乳進(jìn)行檢測(cè)，添加復(fù)雜成分的嬰幼兒配方乳粉依舊使用檢測(cè)鮮乳的處理方法勢(shì)必造成結(jié)果偏差。

乳及乳制品的品種越來(lái)越多樣化，在我國(guó)的消費(fèi)量也越來(lái)越大。為了確保乳制品市場(chǎng)上的食品質(zhì)量安全，乳制品中AFM1的檢測(cè)尤為重要。常用的分析檢測(cè)方法需在應(yīng)用中不斷的改進(jìn)和完善，克服自身的弊端。全世界也都在努力建立和完善一套過(guò)程完整、有效快速、價(jià)格低廉的AFM1分析檢測(cè)方法。各種方法的互補(bǔ)聯(lián)用，廉價(jià)快速的檢測(cè)試紙是未來(lái)工作的重點(diǎn)和今后發(fā)展的方向。

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Dairy products commonly used detection method of Aflatoxin M1in comparative analysis

DING Song-qiao1、2，XIAO Zhi-gang

(1.Northeast Agricultural University,Resources and Environmental Sciences,Harbin 150030,China;2.The Longjiang environmental Group Co.,Ltd.,Harbin 150056,China)

This paper introduces the harm of Aflatoxin M1and AFM1limits,both at home and abroad,and several common methods used for the detection of Aflatoxin M1,and be analyzed the experimental results of the above methods are analyzed.By comparing the detection limit, sensitivity and recovery,environmental safety,process complexity and investment cost of integrated pre process,the advantages and disadvantages of several common methods are proposed，analyzing the problems existing in these methods.According to China's current development needs and common test methods of application,is proposed to be the focus of future work and the direction of development in the future,is the study of a can combine the advantages of several current method,and the price is cheap,fast detection speed new method.

AflatoxinsM1,harm,limit standard,detection method,contrast

TS252.7

B

1001-2230（2016）05-0036-04

2015-09-30

丁松喬（1986-），男，助理工程師，從事食品檢驗(yàn)工作。