酶解與包合技術制備水溶性花粉的比較研究

劉佳霖 殷素會 高麗嬌 曹 蘭 羅文華 程 尚

（重慶市畜牧科學院，榮昌402460）

酶解與包合技術制備水溶性花粉的比較研究

劉佳霖 殷素會 高麗嬌 曹 蘭 羅文華 程 尚

（重慶市畜牧科學院，榮昌402460）

為了探索酶解與包合技術在蜂花粉深加工中的具體作用，試驗選擇了多種酶制劑與環糊精制備水溶性花粉，比較了單一酶制劑、環糊精、復合酶制劑及酶制劑+環糊精復合工藝提取蜂花粉水溶性蛋白質及水溶性黃酮的效果。結果表明：利用單一酶制劑或環糊精制備水溶性花粉，水溶性蛋白質及黃酮提取率最高的為堿性蛋白酶及環糊精1∶2，水溶性蛋白質提取率分別為84.55%和84.33%，黃酮提取率分別為19.51%和18.50%。采用酶解與包合復合技術制備水溶性花粉，水溶性蛋白質提取率最高的為果膠酶+β-環糊精和纖維素酶+β-環糊精，水溶性蛋白質提取率分別為95.40%和88.91%；水溶性黃酮提取率最高的為纖維素+堿性蛋白酶和纖維素酶+β-環糊精，黃酮提取率分別為35.93%和37.86%。綜合比較，采用纖維素酶+β-環糊精制備水溶性花粉能夠獲得較高的水溶性蛋白質提取率和黃酮提取率。由此說明，多種技術的復合使用，有助于蜂花粉深加工的進一步發展。

蜂花粉；酶解技術；包合技術；蛋白質提取率；黃酮提取率

蜂花粉是蜜蜂重要的蛋白質營養物質，是蜜蜂采集外界植物花朵上的花粉，并加入少量花蜜和自身唾液制成的團狀物質。蜂花粉含有豐富的氨基酸、蛋白質以及黃酮類化合物，其營養成分隨粉源植物的不同存在較大差異，通常蜂花粉含水分30～40%，蛋白質11～35%，糖類20～39%，脂質1～20%，還含有多種維生素及生長因子[1]。在蜜蜂蜂群中，蜂花粉質量的好壞、數量的多寡往往決定了蜂群的生長發育狀況、蜂群抗逆能力及蜂群生產能力[2-4]。

研究顯示，蜂花粉對人體具有多種保健功能，其豐富的蛋白質、氨基酸和黃酮類化合物在防治心血管疾病、抗衰老、增強免疫力、保肝護肝、防治前列腺疾病等方面具有十分重要的作用[1,5]。目前，蜂花粉通過破壁、脫敏、滅菌等常規加工后已廣泛應用于食品、日化及飼料加工等產業[6]。然而，蜂花粉的理化形狀仍沒有得到改變，重要功能組分的提取仍處于發展階段，蜂花粉水溶性差、不易吸收等問題仍是限制其深加工的重要難題[7,8]。特別在現代食品產業中，為維持食品原有的特性及口感，蜂花粉的添加量仍保持較低水平。由此，開展多種新工藝、新技術在蜂花粉加工中的應用研究就變的尤為重要。

綜上，本研究比較了酶解改性技術及環糊精包合技術制備水溶性蜂花粉的效果，采用水溶性蛋白質提取率及黃酮提取率評價了單一酶制劑、復合酶制劑、環糊精及酶制劑-環糊精復合工藝在蜂花粉深加工中的具體作用，為拓寬蜂花粉應用領域，推動蜂花粉深加工技術的進一步發展提供理論基礎。

1 材料

1.1 試驗材料

破壁蜂花粉，由重慶市畜牧科學院經濟動物研究所試驗蜂場提供；木瓜蛋白酶（100000 U/g）、中性蛋白酶（100000 U/g）、柚苷酶（50000 U/g）、堿性蛋白酶（30000 U/g）、胃蛋白酶（50000 U/g）、菠蘿蛋白酶（1200000 U/g）、無花果蛋白酶（1200000 U/g），購自河南金潤食品添加劑有限公司；纖維素酶（50000 U/g）、果膠酶（80000 U/g）、β-環糊精，購自河南安銳生物科技有限公司；脂酶（10000 U/g）、β-葡萄糖苷酶（200000 U/g），購自南寧東恒華道生物科技有限公司。

1.2 藥品與試劑

氫氧化鈉NaOH（分析純）、鹽酸HCl（分析純），購自重慶川東化工有限公司；亞硝酸鈉NaNO2（分析純）、硝酸鋁Al(NO3)3（分析純），購自重慶博藝化學試劑有限公司；Bradford蛋白質定量試劑盒，購自TIANGEN；蘆丁標準品，購自中國藥品生物制品檢定所；PBS磷酸緩沖液，購自Solarbio。

1.3 儀器

雙光束紫外可見分光光度計（TU-1901），購自北京普析通用儀器有限責任公司；數顯恒溫水浴鍋（H4-4），購自金壇市杰瑞爾電器有限公司；磁力攪拌器（C-MAG HS4），購自 IKA；電子分析天平（FA2004），購自上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

2 試驗方法

2.1 蜂花粉溶液制備

準確稱取25 g蜂花粉，加入225 ml蒸餾水溶解，料液比為1∶9，攪拌混勻。

2.2 酶解技術制備水溶性蜂花粉

2.2.1 木瓜蛋白酶：使用1 mol/L的HCl調節蜂花粉溶液pH=7.5，加入木瓜蛋白酶0.3750 g（酶添加量為1500 U/g），55℃條件下攪拌反應4 h。反應結束后，于100℃下加熱5 min滅酶，過濾[9]。

2.2.2 中性蛋白酶：使用1 mol/L的NaOH或HCl調節蜂花粉溶液pH=7.0，加入中性蛋白酶0.375 g（酶添加量為1500 U/g），50℃條件下攪拌反應4 h。反應結束后，于100℃下加熱5 min滅酶，過濾[10]。

2.2.3 無花果蛋白酶：使用1 mol/L的NaOH或HCl調節蜂花粉溶液pH=7.0，加入無花果蛋白酶0.031 g（酶添加量為1500 U/g），65℃條件下攪拌反應4 h。反應結束后，于100℃下加熱5 min滅酶，過濾[11]。

2.2.4 柚苷酶：使用1 mol/L的HCl調節蜂花粉溶液pH=5.0，加入柚苷酶0.750 g（酶添加量為1500 U/g），60℃條件下攪拌反應4 h。反應結束后，于100℃下加熱5 min 滅酶，過濾[12]。

2.2.5 堿性蛋白酶：使用1 mol/L的NaOH調節蜂花粉溶液pH=9.0，加入堿性蛋白酶1.250 g（酶添加量為1500 U/g），50℃條件下攪拌反應4 h。反應結束后，于100℃下加熱5 min滅酶，過濾[7]。

2.2.6 胃蛋白酶：使用1 mol/L的HCl調節蜂花粉溶液pH=2.0，加入胃蛋白酶0.750 g（酶添加量為1500 U/g），37℃條件下攪拌反應4 h。反應結束后，于100℃下加熱5 min 滅酶，過濾[13]。

2.2.7 菠蘿蛋白酶：使用1 mol/L的NaOH或HCl調節蜂花粉溶液pH=6.5，加入菠蘿蛋白酶0.031 g（酶添加量為1500 U/g），48℃條件下攪拌反應4 h。反應結束后，于100℃下加熱5 min滅酶，過濾[14]。

2.2.8 無花果蛋白酶：使用1 mol/L的NaOH或HCl調節蜂花粉溶液pH=7.0，加入無花果蛋白酶0.031 g（酶添加量為1500 U/g），65℃條件下攪拌反應4 h。反應結束后，于100℃下加熱5 min滅酶，過濾[15]。

2.2.9 纖維素酶：使用1 mol/L的HCl調節蜂花粉溶液pH=5.2，加入纖維素酶0.750 g（酶添加量為1500 U/g），65℃條件下攪拌反應4 h。反應結束后，于100℃下加熱5 min 滅酶，過濾[16]。

2.2.10 果膠酶：使用1 mol/L的HCl調節蜂花粉溶液pH=4.0，加入果膠酶0.469 g（酶添加量為1500 U/g），40℃條件下攪拌反應4 h。反應結束后，于100℃下加熱5 min 滅酶，過濾[17]。

2.2.11 脂酶：使用1 mol/L的HCl調節蜂花粉溶液pH=5.5，加入脂酶 3.750 g（酶添加量為 1500 U/g），40℃條件下攪拌反應4 h。反應結束后，于100℃下加熱5 min滅酶，過濾[18]。

2.2.12 β-葡萄糖苷酶：使用1 mol/L的NaOH調節蜂花粉溶液pH=5.5，加入葡萄糖苷酶0.188 g（酶添加量為1500 U/g），50℃條件下攪拌反應4 h。反應結束后，于100℃下加熱5 min滅酶，過濾[19]。

2.3 β-環糊精制備水溶性蜂花粉

使用1 mol/L的NaOH調節蜂花粉水溶液pH=8.7，加入 β-環糊精 12.500 g、6.250 g、3.125 g（與蜂花粉質量比為 1∶2、1∶4、1∶8），37℃下水浴磁力攪拌 4 h，過濾[20]。

2.4 復合反應制備水溶性蜂花粉

2.4.1 纖維素酶+果膠酶：使用1 mol/L的HCl調節蜂花粉溶液pH=4.0，加入纖維素酶0.750 g（酶添加量為1500 U/g）、果膠酶0.469 g（酶添加量為1500 U/g），40℃條件下攪拌反應4 h。反應結束后，于100℃下加熱5 min 滅酶，過濾[17]。

2.4.2 纖維素酶+果膠酶+堿性蛋白酶：使用1 mol/L的HCl調節蜂花粉溶液pH=4.0，加入纖維素酶（5W單位）0.75 g（酶添加量為 1500 U/g）、果膠酶 0.469 g（酶添加量為1500 U/g），40℃條件下攪拌反應4 h。反應結束后，于100℃下加熱5 min滅酶，冷卻。使用1 mol/L的NaOH調節蜂花粉溶液pH=9.0，加入堿性蛋白酶1.250 g（酶添加量為1500 U/g），50℃條件下攪拌反應4 h。反應結束后，于100℃下加熱5 min滅酶，過濾。

2.4.3 纖維素酶+果膠酶+β-環糊精：使用1 mol/L的HCl調節蜂花粉溶液pH=4.0，加入纖維素酶0.75 g（酶添加量為1500 U/g）、果膠酶0.4688 g（酶添加量為1500 U/g），40℃條件下攪拌反應4 h。反應結束后，于100℃下加熱5 min滅酶，冷卻。使用1 mol/L的NaOH調節蜂花粉水溶液pH=8.7，加入β-環糊精6.250 g（與蜂花粉質量比1:4），37℃下水浴磁力攪拌4 h，過濾。

2.4.4 纖維素酶+堿性蛋白酶：使用1 mol/L的HCl調節蜂花粉溶液pH=5.2，加入纖維素酶0.75 g（酶添加量為1500 U/g），65℃條件下攪拌反應4 h。反應結束后，于100℃下加熱5 min滅酶，冷卻。反應結束后，于100℃下加熱5 min滅酶，冷卻。使用1 mol/L的NaOH調節蜂花粉溶液pH=9.0，加入堿性蛋白酶1.250 g（酶添加量為1500 U/g），50℃條件下攪拌反應4 h。反應結束后，于100℃下加熱5 min滅酶，過濾。

（未完待續）

Comparative Study on Water-Soluble Pollen Produced by Enzymatic Hydrolysis and Inclusion

Liu Jialin,Yin Suhui,Gao Lijiao,Cao Lan,Luo Wenhua,Cheng Shang
（Chongqing Academy of Animal Sciences,Chongqing 402460,China)

For comparing enzymolysis and inclusion in processing of bee pollen products,water-soluble pollen was produced by various enzymes and cyclodextrins.The effect of single enzyme,cyclodextrin,complex enzyme and enzymecyclodextrin on the extraction of water-soluble protein and flavonoids from pollen were analyzed.The result showed that the highest extraction rates of water-soluble protein and flavonoids were alkaline protease and beta cyclodextrin 1:2 in the single enzyme and cyclodextrin groups.The rates of water-soluble protein were 84.55%and 84.33%respectively,flavonoids were 19.51%and 18.50%.In the complex enzyme and enzyme-cyclodextrin groups,the highest extraction rates of water-soluble protein were pectinase-beta cyclodextrin and cellulose-beta cylodextrin,the rates of water-soluble protein were 95.40%and 88.91%.the highest extraction rates of water-soluble flavonoids were cellulose-alkaline protease and cellulase-beta cyclodextrin,the rates of water-soluble flavonoids were 35.93%and 37.86%.By comparison,the extraction of water-soluble pollen with cellulase-beta cyclodextrin get higher extraction rate of water-soluble protein and flavonoids.It shows that the combined use of various technologies will be helpful to the development of bee pollen process.

bee pollen;enzymatic hydrolysis;inclusion;extraction rate of protein;extraction rate of flavone

國家蜂產業技術體系建設專項（CARS-45-SYZ15）；重慶市基礎與前沿研究計劃項目（cstc2015jcyjA80032）；重慶市基本科研業務費（16440）

劉佳霖（1988-），男，研究實習員，碩士，研究方向為蜜蜂授粉行為學及蜂產品研究，E-mail:liujialin5164@163.com。

程尚（1981-），男，助理研究員，碩士，研究方向為蜜蜂授粉行為學及蜂產品研究，E-mail:chengshang3@126.com。