探討藥物GLP試驗用Beagle犬檢疫驗收的技術要點

孫昌華，劉 毅，肖 英，魏 霞，祝清芬

(山東省食品藥品檢驗研究院，濟南 250101)

探討藥物GLP試驗用Beagle犬檢疫驗收的技術要點

孫昌華，劉 毅，肖 英，魏 霞，祝清芬

(山東省食品藥品檢驗研究院，濟南 250101)

實驗動物的檢疫驗收是一項控制動物在流通環節免受污染、防止疫病發生和傳播的重要工作，是實現實驗動物質量標準化的關鍵。Beagle犬因其遺傳穩定，對環境的適應能力和抗病力較強，在試驗中反應一致性好，是被國際所公認的專用實驗犬，在藥物安全性評價實驗中應用廣泛。建立藥物GLP機構試驗用Beagle犬檢疫驗收的標準操作規程，細化檢疫驗收的技術要點，加強檢疫人員的技術培訓，努力提高檢疫水平，最終確保實驗動物質量。

GLP；Beagle犬；檢疫

實驗動物的健康是保證動物試驗結果準確性，實現動物質量標準化的基礎。在實驗動物飼養與應用條件標準化的基礎上， 防止實驗動物流通環節免受污染、切斷傳播途徑、淘汰非健康實驗動物顯的尤為重要。同時，“以檢促防”嚴格的檢疫驗收也是對實驗動物供給單位的有效監督[1]。優良實驗室規范(Good Laboratory Practice，GLP)是用于規范與人類健康和環境有關的非臨床安全性研究的一整套組織管理體系，包括機構設置、人員資質、試驗計劃、試驗實施過程、試驗的監督、記錄、檔案和報告的管理[5]。GLP的目的是組織、規范和管理科學技術人員的研究行為，促進科研人員提高實驗數據的質量和完整性，從而避免出現假陰性或假陽性結果，保障實驗結果的可靠性、完整性和可重復性[2]。在試驗實施過程中，實驗動物的檢疫驗收是試驗即將開始的第一步，做好動物的檢疫驗收工作，對動物質量進行把關，也是保證實驗順利開展的重要一步。

Beagle犬(比格犬)，又叫小獵兔犬，原產英國，是獵犬中較小的一種。1880年引入美國，體型小(成年體重為7～10 kg，體長為30～49 cm)，短毛和體質均一，性溫和，具有性成熟期早(8～12個月)，產仔數多等優點，而且對環境的適應力強、抗病力強[3，4]。Beagle犬在試驗中反應一致性好，是目前生命科學領域中最標準的犬種，是被國際所公認的專用實驗犬，在藥物安全性評價實驗中獲得廣泛應用[5]。結合本中心的在實際工作中的情況，現將Beagle犬在檢疫驗收環節的經驗進行交流，相互學習，共同進步。

1 Beagle犬的采購

實驗專題負責人根據實驗方案填寫《動物申購書》，動物管理負責人依據《動物申購書》，選擇有動物生產許可資質、質量合格、管理體制健全、信譽好[6]和具有一定規模的實驗動物供應單位。如果初次建立供求關系，可以提前安排人員到供應單位進行實地考察或參考兄弟單位的意見。獸醫應依據實驗方案和/或《動物申購書》提前了解供應單位情況及所購進Beagle犬的數量、年齡、性別、體重范圍等基本信息。

2 Beagle犬的運輸

國家科學技術委員會1988年發布的《實驗動物管理條例》第21條規定，實驗動物的運輸應當有專人負責，運裝工具應當安全、可靠，不得將不同品種、品系或者不同等級的實驗動物混合裝運[7]。國家科技部2006年發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》關于實驗動物運輸的內容已經相對完備[8，9]。《實驗動物環境及設施》國家標準中對運輸籠具、運輸工具、運輸動物都做了明確的規定，在運輸途中，運輸工具應配備空調等設備，使實驗動物周圍環境的溫度和濕度維持在正常范圍內，以保證動物的質量。如果運輸時間超過6 h，應保證實驗動物在運輸途中有充足的符合要求的飼料和飲水[10，11]。此外，《中華人民共和國動物防疫法》[12]，《中華人民共和國野生動物保護法》[13]，《國家重點保護野生動物馴養繁殖許可證管理辦法》[14]等法律法規從各方面對全部或特定的實驗動物的運輸提出了監管要求。

3 運輸工具、運輸籠具的檢查

動物管理負責人應與動物運輸負責人保持暢通的聯系，安排相關人員進行動物接收。當動物到達目的地后，動物管理負責人和獸醫應對運輸工具和籠具進行檢查，查看運輸條件是否符合要求，檢查車廂內的溫濕度、運輸密度。運輸犬的籠具要堅固耐用，內外角圓滑，籠內無尖銳的突起，保證犬的安全[3]。同時，檢查籠具內有無飲水用具及動物飲水情況。

4 Beagle犬的驗收檢查

動物管理人員按照《動物申購書》的要求，結合供應商提供的《實驗動物生產許可證》復印件、《動物質量合格證》、《動物健康檔案》、《動物檢疫合格證》，認真核對相關信息。信息核對完畢無誤后，動物管理人員將全部動物資料移交獸醫。新入室的動物應由獸醫進行檢疫[15]，獸醫是藥物安全性評價單位中的檢疫驗收的負責人，負責整個檢疫驗收環節。

犬常用的標識方法主要有掛牌法和針刺法。掛牌法是指用金屬或其他材質等制作的標牌，寫上編號掛在動物的頸部、耳朵等部位，但掛牌可能使動物感到不適，常會用前爪搔抓號牌而使掛牌的部位損傷。針刺法則是采用人工或機器針刺號碼打號，然后涂以酒精黑墨即可，通常選擇耳部進行標記。供應商所選擇的動物標識方式各不相同，通常情況下大多選擇犬耳廓內側針刺標記法識別。

由于在運輸過程中Beagle犬處于一種特殊的不斷變化的環境之中，非常容易遭遇驚恐、疲勞或導致額外的痛苦或損傷，以及病原微生物的感染。此外，運輸也會對犬造成一定的應激，因此在卸車時一定要輕卸輕放，動物卸車由動物管理負責人統籌安排，卸車過程切不可著急，以井然有序為標準。動物卸車后工作人員及時向獸醫報告動物編號，獸醫根據動物編號逐一核查《動物質量合格證》、《動物檢疫合格證》、《健康檔案》的信息，隨后進行動物個體進行驗收檢查。

4.1 動物整體及一般狀態檢查

4.1.1 體格發育、營養程度的檢查：體格、發育狀況通常可根據骨骼與肌肉的發育程度及各部的比例關系來判定。體格分為體格強壯、體格中等和體格纖弱；發育狀況可分為發育良好和發育不良[16]。營養程度通常根據肌肉的豐滿度，特別是皮下脂肪的蓄積量來判定，被毛的狀態和光澤，也可作為參考。動物的營養狀態，是動物體營養代謝情況的標志[17]。通常情況下將營養程度分為營養過肥和營養不良。

首先對Beagle犬做一個初步的檢查，包括軀體結構的勻稱度，肌肉結實度。下一步用手緊貼皮膚觸摸其軀干部，感受皮膚的彈性、肌肉的豐滿度。正常狀態犬應表現為軀體勻稱、發育良好、肌肉豐滿、被毛光澤；反之病理狀態則表現為軀體矮小、結構不勻稱、消瘦、被毛蓬亂無光澤、皮膚缺乏彈性等，多提示為營養不良或慢性消耗性疾病的表現。

4.1.2 精神狀態、姿勢與體態的檢查：動物的精神狀態，是其中樞神經機能的標志，可根據其對外界刺激的反應能力及其行為表現進行判定[17]。犬有不同的神經類型，導致不同的性格。巴甫洛夫將犬分為四種神經類型：均衡的靈活性，即多血質(活潑型)；均衡的遲鈍型，即黏液質(安靜型)；不均衡，興奮占優勢的興奮型，即膽汁質(不可抑制型)；興奮和抑制不發達，即憂郁質(衰弱型)[18]。因此，在檢疫驗收過程中應與其他檢查項目相結合進行綜合考慮和分析。

姿勢與體態則是指動物在相對靜止或運動過程中的空間位置和呈現的姿態。此項檢查相對來講比較直觀，很容易發現，主要是犬姿勢的自然、動作的靈活性。若犬在站立或行走時，四肢軟弱無力，四肢強拘，不敢負重，多數情況下表明四肢有異常；如果犬躺臥不起，體軀蜷縮，頭置于腹下或臥姿不自然，不時翻動，則表明有腹痛癥狀。

4.1.3 表被狀態、淺表淋巴結的檢查：表被狀態的檢查，主要注意被毛、鼻尖、皮膚、皮下組織的變化，以及表在外科病變的有無情況。犬的淺表淋巴結檢查通常選擇下頜淋巴結。

正常情況下，犬每年春、秋季節會脫換新毛。健康的犬被毛平順而富有有光澤，病理狀態下被毛蓬松粗亂、失去光澤、容易脫毛，多伴有精神不振等表現。通常情況下，病理性脫毛現象分營養性脫毛和皮膚病及外寄生蟲病脫毛。

正常犬鼻尖呈油狀滋潤，能靈敏反應其全身的健康狀況，人以手背觸其鼻尖有涼感，若發現鼻尖如滋潤，手背觸其無涼感，或有熱感，則將得病，或以得病[18]。

犬的汗腺不發達，僅鼻尖有一種鼻鏡腺和腳(枕部)有汗腺。在炎熱的季節，犬常常將舌頭伸出口外做喘式呼吸[1,18,19]。健康犬皮膚濕度觸診時表現不濕不粘。皮膚溫度觸診時最好用手背，因手背對溫度比較敏感，并應與鄰近部位相比較，這樣感覺更準確。皮膚的彈力與皮膚的神經營養狀態、肌纖維的收縮力量以及皮下脂肪含量的多少有密切關系[17]。臨床上常把皮膚彈力減退程度作為判定機體脫水的指標之一[17]。臨診上根據皺褶恢復的速度進行判定，皮膚彈性良好則立即恢復原狀，皮膚彈性減退則恢復原狀緩慢[16]。在藥物非臨床研究機構中，依據國家食品藥品監督管理局頒布的《藥物重復給藥毒性試驗技術指導原則》要求，應根據試驗期限和臨床擬用人群確定動物年齡，Beagle犬6～12月齡[20]。獸醫依據《動物申購書》的年齡要求綜合考慮，幼齡及營養好的犬皮膚富有彈性。

犬皮下組織與表在外科病變通常一起檢查，獸醫通過觸診方式主要檢查是否有局灶性的腫物、疝、創傷等。

淺表淋巴結的檢查犬主要以下頜淋巴結為主，觸診下頜支內側，感觸其大小、形狀、硬度、敏感性及活動性。

4.1.4 眼睛、可視粘膜的檢查：健康犬雙眼明亮、不羞明、不流淚、眼瞼無腫脹、眼瞼無外傷、眼角物分泌物。可視粘膜的檢查通常以檢查眼結膜為主，因其具有豐富的毛細血管，顏色變化除反應其局部的病變外，還可推斷全身的血液循環狀態及血液某些成分的改變[21]。可視粘膜檢查可以在光線良好的條件下或光線不好借助于器械進行檢查。通常用兩手的拇指和食指配合打開上下眼瞼進行檢查[16]。健康犬的眼結膜呈淡紅色，病理情況下可表現為潮紅、蒼白、黃染、發紺。

4.1.5 呼吸系統的觀察：呼吸系統主要以觀察呼吸方式和呼吸是否困難為主。健康動物一般為胸腹式呼吸，即在呼吸時，胸壁和腹壁的運動很協調，強度也大致相等，因此亦可稱為混合式呼吸。只有犬例外，正常時即以胸式呼吸占優勢[17]。

4.1.6 消化、泌尿系統的觀察：消化、泌尿系統主要以觀察是否有嘔吐狀況、糞尿情況為主。因犬是非常容易嘔吐的動物，尤其是在機體不適的情況下，主要觀察是否有嘔吐狀況，如有嘔吐，注意嘔吐物的數量、氣味及性質。此外，還應注意糞尿的氣味、色澤、性狀等。

獸醫對新購入的Beagle犬進行整體及一般狀態檢查完畢后，詳細填寫《動物檢疫書》，對檢查合格的犬進行檢疫驗收的下一個環節，對檢查有異常或有疑似疾病傾向的犬及時匯報實驗專題負責人，并與動物運輸負責人進行溝通，做好Beagle犬的退還工作。

4.2 驅蟲

Beagle犬整體及一般狀態檢查合格后進入檢疫室之前，先進入洗浴室進行體外驅蟲。GLP機構購進的Beagle犬，絕大部分是普通級犬，供應單位在每只犬的健康檔案中詳細記錄了疫苗接種、驅蟲等情況。為了更好的保護動物自身的健康，有效的保障動物實驗室的生物安全和實驗人員的人身安全，及時安排體外驅蟲還是非常有必要的。

體外寄生蟲是指寄生于動物體外并暫時性吸取營養的寄生蟲。如蚊、白蛉、蚤、虱、蜱等，吸血時與宿主體表接觸，多數飲飽后即離[22]。犬常見的體外寄生蟲主要分為蚤和螨兩大類。其中感染犬的跳蚤以貓蚤為常見；感染犬的螨類主要包括耳癢螨、疥螨、虱子、蜱蟲。

隨著驅蟲藥的研發和使用，犬的體外驅蟲方式也有較多的選擇。傳統的體外驅蟲方法主要以藥浴為主，藥物價格比較便宜，以雙甲脒溶液等為代表，此藥為接觸性廣譜殺蟲劑，驅蟲效果好但具有一定的毒性，在使用時一定要掌握好用藥劑量及注意事項。另一種為非藥浴方式，即使用噴劑或滴劑驅蟲藥。此類藥具有使用方便、療效好等特點，價格比傳統藥浴方式要高。代表藥品為輝瑞的大寵愛、梅里亞的福來恩、英國的埃爾金等。噴劑主要是逆毛噴灑，讓犬全身濕透，注意保護眼睛和口鼻(避免接觸藥物)；滴劑給藥部位主要選擇犬頸背部，撥開毛發，直接將藥物滴在皮膚上即可。兩種體外驅蟲方式需要注意的是藥浴方式洗完后需要用吹風機吹干；非藥浴方式最好不用吹風機，自然晾干驅蟲效果更好。

4.3 體重稱量

犬體外驅蟲結束后進行體重稱量，獸醫應結合《動物申購書》認真核對《動物健康檔案》中的體重記錄，填寫《動物檢疫書》，查找最大體重和最小體重，核對《動物申購書》中所要求的體重范圍，如有異常及時匯報實驗專題負責人。

4.4 移入檢疫室

犬稱重完畢后，雌雄區分，依次放入檢疫室內，進行單籠檢疫期飼養。

4.5 籠卡標識

犬進入檢疫室后，依據《實驗方案》要求進行檢疫期籠卡標識。

4.6 完善檢疫記錄

犬進入檢疫室后獸醫檢查標識籠卡，核對籠卡與犬耳廓內側刺青標編號，核對雌雄犬飼養位置及數量，檢查《動物檢疫書》中需要詳細記錄的內容，完善檢疫記錄，確認簽字后方可離開檢疫室。

5 Beagle犬的檢疫檢查

Beagle犬通過驗收環節移入檢疫室后，進入了檢疫期檢查及馴化飼養階段。《藥物重復給藥毒性試驗技術指導原則》要求，給藥前應對動物進行適應性飼養，非嚙齒類動物不少于2周[20]。犬經過至少2周的檢疫期及馴化飼養階段，首先讓其適應新的生活環境，其次通過一定時間的飼養觀察能及早發現動物潛在的病癥，最后動物得到了飼養員、試驗員的馴化，增加了與人的親密度，性情也趨于溫順，便于試驗的順利開展。

檢疫期內獸醫應在每天上班后、飼養人員清理衛生前，進行大體觀察并詢問飼養人員動物的飲水、采食情況，邊觀察邊記錄。大體觀察事項主要包括：營養狀況、自發活動、步態、神經癥狀、皮膚、呼吸、糞便、尿液、眼睛分泌物、飲食、飲水等情況。此外犬在檢疫期內還應進行至少2次體溫、血液學、血液生化和至少1次地心電圖檢測[20]。獸醫詳細記錄觀察結果，發現問題時及時向動物管理負責人和/或實驗專題負責人匯報，共同討論處理措施。

實驗動物質量限于實驗動物生產單位控制微生物的程度。在藥物非臨床研究機構中所使用的Beagle犬主要以普通級犬為主，在市場供需關系的調控下，如何把握好犬檢疫驗收的尺度，如何把握好檢疫驗收的質量控制點，是關系檢疫驗收工作成敗的關鍵。期盼在實驗動物管理部門、實驗動物生產和使用單位以及從事實驗動物工作的人員共同努力下，實驗動物的檢疫驗收工作會不斷開創新的局面。

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Main technical points of quarantine inspection of Beagle dogs used for drug GLP experiment

SUN Chang-hua,LIU Yi, XIAO Ying, WEI Xia, ZHU Qing-fen

(Shandong Institute for Food and Drug Control, Jinan 250101, China)

The quarantine inspection and acceptance of laboratory animals is an important work, which can protect animals from pollution, occurrence and spread of diseases in the surounding area, and it is the key point to realize the quality standardization of laboratory animals. Beagle dogs are acknowledged widely as specialized laboratory dogs which is widely employed in experiments of drug safety evaluation because of the good genetic stability, environmental adaptability, disease resistance and consistency testing in the experiments. Establishment of standard operating procedures of beagle dog quarantine acceptance check for drug GLP organization tests, refining technical points, strengthen the technical training of quarantine officers, and efforts to improve the level of quarantine are needed to finally ensure the quality of laboratory animals.

Good laboratory practice; Beagle dog；Quarantine; Drug safety evaluation; Laboratory animals

孫昌華(1984-)，男，獸醫學博士，國家執業獸醫師，研究方向：食品藥品安全性評價， E-mail： sunchanghuavip@163.com。

祝清芬(1973-)，男，藥理學博士，主任藥師，研究方向：藥檢藥理及食品藥品安全性評價， E-mail： zhuqingfen73@163.com。

經驗交流

R-33

A

1671-7856(2017) 06-0063-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.06.013

2016-12-07