外泌體在腫瘤診療中的研究進展

郭 靜，徐桂英，黃 昊，楊星九，高 苒

(北京協和醫學院比較醫學中心，中國醫學科學院北京協和醫學院實驗動物研究所，北京 100021)

綜述與專論

外泌體在腫瘤診療中的研究進展

郭 靜，徐桂英，黃 昊，楊星九，高 苒

(北京協和醫學院比較醫學中心，中國醫學科學院北京協和醫學院實驗動物研究所，北京 100021)

外泌體是具有磷脂雙分子膜結構的納米級囊泡，直徑在30～100 nm，廣泛分布于血清、唾液、尿液等體液中。外泌體中包含多種蛋白質、核苷酸、甚至病毒等遺傳物質，廣泛參與細胞間物質交換和信息傳遞。最近研究發現，腫瘤細胞分泌的外泌體中mRNA和miRNA等遺傳物質直接來自母體腫瘤細胞，此外外泌體攜帶的遺傳物質可以直接作用于受體細胞，因此外泌體可能成為腫瘤診斷和治療的新靶點。本文對外泌體作為腫瘤診斷的標志物以及外泌體對腫瘤治療的作用作一綜述。

外泌體；腫瘤；miRNA；診斷；治療

大多數細胞(包括正常細胞和病變細胞)都會向胞外和體液中釋放具有雙分子膜結構的納米級囊泡。這些胞外囊泡按尺寸大小可分為三大類：外泌體(20～100 nm)，微囊泡(100～1000 nm)，凋亡小體(1～5 μm)。凋亡小體是細胞在凋亡或受機械壓力時為了排出來自凋亡細胞的有毒成分而形成的泡狀小體[1]；微囊泡直接由細胞質膜向胞外發芽而形成[2]；外泌體是Trams等在1980年最先發現的[3]，外泌體在尺寸、組成和功能等方面與微囊泡和凋亡小體差異很大，外泌體直徑在30～100 nm，外泌體中含有多種蛋白質，其中四跨膜蛋白是目前發現最大的蛋白家族，包括CD9和CD63等。外泌體不是直接來源于質膜的發芽或脫落[4]，而是多泡體(multivesicular body，MVB)在細胞內吞過程中與細胞膜融合最終外排形成的囊泡[5]。外泌體廣泛存在于體液中，如血清、唾液、乳汁[6]、腦脊液[7]、尿液[8]、和精液[9]等體液中。外泌體在腫瘤微環境中含量尤其豐富，與腫瘤的發生發展、免疫逃逸、微環境建立密切相關[10]。大量研究表明，腫瘤細胞來源的外泌體可以應用于腫瘤早期檢測和治療。本文對腫瘤細胞來源的外泌體在腫瘤早期檢測和外泌體在腫瘤治療方面的作用進行概述。

1 外泌體的組成、分泌、分離及功能

1.1 外泌體的組成

外泌體包含多種蛋白質、DNA、 mRNA、 miRNA，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)，甚至病毒和朊病毒等遺傳物質。不同細胞來源的外泌體擁有相同的一組蛋白或蛋白家族，這些蛋白可以作為外泌體的標記物，包括膜相關蛋白，如四跨膜蛋白CD9、CD63、CD81和CD82；細胞質蛋白，如Hsp 70和Hsp 90；細胞分選所需的運輸蛋白，如Alix和TSG101；膜運輸和融合蛋白，如Rab家族GTP酶和膜聯蛋白；而大部分外泌體包含熱休克蛋白和主要組織相容性復合物(MHC)I類分子[4,11]。外泌體也包含各種特異性蛋白，取決于供體細胞和具體功能，如B淋巴細胞和樹突狀細胞分泌的外泌體包含MHC-I類和MHC-II類蛋白[12]。一些腫瘤細胞分泌的外泌體攜帶細胞粘附分子、金屬蛋白酶和組織特異性蛋白，與腫瘤的發生發展密切相關[13]。此外，脂類分析顯示外泌體中還含有膽固醇和其他脂類[4,14]。

除蛋白質和脂質體外，外泌體還包含大量的核苷酸，如mRNA、microRNA、lncRNA和DNA等。這些核苷酸能夠通過靶細胞膜的融合被受體細胞吸收，控制受體細胞的蛋白表達或激活信號通路[15]。目前，外泌體中大概有1639種mRNA被發現，這個數量還在逐年上升。雖然細胞分泌的外泌體中含有大量的RNA，但是每一個外泌體中RNA分子的種類是唯一的或不含有RNA分子[16]。研究發現，鼠源外泌體中的RNA被運送到人源細胞后，新的鼠蛋白會在受體細胞中發現，說明外泌體可以誘導受體細胞的轉錄過程[15]。

miRNA作為外泌體中重要的內含物，是生理和病理過程中重要的調控者。研究發現，腫瘤患者血清來源的外泌體中一些miRNA的表達明顯上調，表明這些miRNA可以作為腫瘤早期診斷的標志物[17]。

1.2 外泌體的分泌調節和提取

如今人們對外泌體的起源和分泌的分子機制知之甚少，但外泌體的分泌被多種信號分子精確控制[18]。通常，外泌體的分泌受多種因素的影響，如：神經酰胺的合成、鈣信號、p53基因、酸中毒、高溫和外界應力等[19-22]。外泌體的分泌主要受保守的細胞質蛋白家族控制，如Rab家族GTP酶，尤其是Rab27a和Rab27b[23]。

超速離心能夠得到較高純度的外泌體是目前公認的提取外泌體的有效方法[24]，但是其過程復雜且耗時較長。外泌體試劑盒在許多試驗中證明了它的高效性，其操作簡單方便無需超速離心，通過加入幾種試劑就能夠得到外泌體沉淀[25]。2009年，Logozzi M等人設計了一種內部具有三明治結構的酶聯反應吸附試驗，應用管家蛋白(CD63和Rab5b)的表達與腫瘤細胞關聯作為標記物，成功捕獲并量化了血漿來源的外泌體[26]。同時，發現相比較健康對照組腫瘤患者血漿中外泌體含量更高[27]。

1.3 外泌體的功能

隨著生態新城的建設，規劃區域內的耕地將被逐步開發建設，灌溉渠道亦將逐漸失去功能，但規劃區域下游尚有3萬多畝耕地需引水灌溉。考慮到灌溉渠道水位高于周邊地面0.5～1 m，若保持現有灌溉渠系，不利于新城的市政基礎設施建設，影響周邊區域環境。

一直以來，外泌體被看做是細胞內運送“垃圾”的載體，允許細胞排出廢物，如對細胞分化不利的分子和對細胞有損傷的藥物分子[28]，但研究發現外泌體是免疫表達重要的調控者和抗原遞呈者[29]，之后外泌體的功能被廣泛研究。雖然外泌體在生理和病理方面作用的具體細節仍在研究，但其主要功能是通過自身膜蛋白與靶細胞識別并融合，進而參與細胞間信息和物質的傳遞，可以調節受體細胞的轉錄及表型[4,30]。外泌體是天然的細胞間RNA傳輸的信使，Cossetti C等[31]構建了一種人源黑色素瘤細胞移植瘤穩定表達EGFR編碼質粒的小鼠模型，發現EGFR編碼的RNA被外泌體運送到血液，最終到達小鼠的精子中，說明外泌體可以將遺傳信息運送到受體細胞。

2 外泌體在腫瘤診斷中的應用

大量研究發現，腫瘤細胞來源的外泌體中含有大量特異性miRNA，且生化性能穩定易于保存，可以作為腫瘤早期診斷的標志物[32]。 Madhavan 等[33]對胰腺癌患者血清來源的外泌體研究表明， 83%患者的外泌體中miR-1246、 miR-4644、miR-3976 和miR-4306表達水平明顯上調，然而健康對照組則較少表達。Ogata-Kawata 等[34]研究發現，結直腸癌患者血清來源的外泌體中let-7a、miR-1229、miR-1246、miR-150、miR-21、miR-223 和miR-23a的表達水平明顯高于健康對照組。I期結腸癌患者，miR-23a 和miR-1246 的表達具有較高的敏感度，分別達到95%和90%，手術后它們的表達水平明顯下調。

Melo等[35]發現腫瘤細胞來源的外泌體中磷脂酰肌醇聚糖-1(glypican-1, GPC1)屬于細胞表面蛋白多糖在外泌體中含量豐富，在患者血清和患癌小鼠體內成功分離出含GPC1的外泌體與健康對照組相比其含量有明顯差異，利用蛋白多糖含量的高低，在胰腺癌中還成功區分了早期和晚期腫瘤，此外含GPC1的外泌體還攜帶特殊的KRAS突變基因，可以預測預后和輔助化療效果。Zhou等[36]同樣發現使用表面處理后的金屬納米顆粒可以特異性的識別外泌體，前列腺癌細胞分泌的外泌體表面蛋白能夠被這些特異性的納米顆粒識別，如上皮細胞粘附分子(Epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)，也可以成為新的腫瘤診斷標記物。

3 腫瘤細胞分泌的外泌體在腫瘤發展和治療中的作用

3.1 促進腫瘤細胞發展，侵襲和轉移

腫瘤轉移是大部分腫瘤治療失敗的主要原因。腫瘤轉移是一種過程，這個過程允許腫瘤細胞侵襲某些特定的正常人類器官，形成新的轉移灶。腫瘤細胞來源的外泌體能夠提供自分泌、旁分泌、內分泌和其它能夠促進腫瘤生長的信號，促進腫瘤的侵襲和轉移[37]。

Hong BS等[38]發現結直腸癌細胞來源的外泌體富含與細胞周期相關的mRNAs，能夠促進內皮細胞增殖，促進腫瘤生長和轉移。研究發現，肝癌細胞來源的外泌體通過調節β活化激酶-1及其相關信號通路的表達可以促進肝癌細胞的生長[39]。除腫瘤細胞外，其它細胞(巨噬細胞、人骨髓間充質干細胞、肥大細胞)分泌的外泌體通過調控相應的信號通路，同樣可以促進腫瘤細胞增殖[40]。

轉移前腫瘤細胞會控制局部微環境，使其最有利于遷移和移植，其控制范圍甚至會在遠端病灶區[44]，這個過程需要腫瘤基質間復雜的相互作用，包括各種細胞間通信[37]。外泌體在腫瘤轉移中扮演重要的角色，它們會排出腫瘤抑制相關的miRNA，如miR23b，使受體區獲得轉移特性，促進腫瘤細胞遠端轉移[34]。黑色素瘤細胞分泌的外泌體能夠為腫瘤轉移創造微環境，增強黑色素瘤細胞的遷移能力[45]，此外，腫瘤細胞來源的外泌體能夠誘導宿主免疫應答及其表型的轉化，在前哨淋巴結中建立一個利于腫瘤的環境[46]。雖然這些現象在不同的腫瘤模型中已經被發現，但是具體的可能機制仍然需要繼續探索。

3.2 促進腫瘤的血管新生

腫瘤血管新生主要受缺氧誘導因子家族的調節，腫瘤細胞中供給和消耗氧量的不平衡，使腫瘤細胞處于低氧環境，特別是腫瘤晚期患者[47]，在低氧環境下腫瘤細胞會表現出更強的生長能力，腫瘤細胞在低氧環境下能夠分泌更多外泌體，調節腫瘤微環境促進腫瘤血管新生和轉移[48]。缺氧環境能夠促進腫瘤細胞分泌外泌體，主要受低氧誘導因子的控制。當乳腺癌細胞在低氧(1%氧含量)和嚴重缺氧(0.1%氧含量)時，外泌體的獲得量分別提高32.3±4.8%和90.9±7.1%[49]。

外泌體促進腫瘤血管新生，緩解腫瘤細胞的缺氧狀態，然而在缺氧條件下形成的新血管是混亂的無序的，研究發現，使腫瘤血管系統正常化可以改善化療效果和腫瘤放射敏感度[50]。因此，抑制外泌體的分泌或轉移，可能會抑制或正常化腫瘤血管新生。在臨床中，抑制血管新生可以通過調控一些靶向分子基因，如貝伐單抗(Bevacizumab, Avastin)。對于結直腸癌患者和晚期非小細胞肺癌患者，通過使用貝伐單抗使得化療效果能夠更加持久[51]。美國食品和藥品監督管理局已經批準，在轉移性結直腸癌和晚期非小細胞肺癌的治療中可以使用貝伐單抗，并且建議和鼓勵阻斷腫瘤細胞來源的外泌體對血管新生的促進作用，從而改善腫瘤治療效果。

3.3 腫瘤免疫調節

腫瘤發展和轉移的過程中，大多數腫瘤細胞受到免疫系統排斥。抑制免疫反應或免疫逃逸對于腫瘤發展至關重要，在這個過程中外泌體充當重要的角色。大多數腫瘤患者存在免疫抑制和免疫缺陷，最近免疫療法在腫瘤治療中越來越受到重視，如惡性黑色素瘤，腎癌，肝癌甚至是非小細胞肺癌[52]。外泌體的另外一個應用是作為腫瘤疫苗的開發，腫瘤細胞來源的外泌體通常包含一些腫瘤抗原可以使抗原遞呈細胞(antigen presenting cells, APC)激活，包括樹突狀細胞[53]。Escudier等[54]在15例轉移性黑色素瘤患者，采用自體樹突狀細胞來源的外泌體進行治療，結果顯示外泌體沒有二級毒性和最大耐受劑量，表明了外泌體的安全性。研究發現樹突狀細胞來源的外泌體能夠顯著增加NK細胞的循環數量，且在一半患者體內上調類分子相關蛋白NKG2D的表達，進而增強NK細胞的抗腫瘤活性[55]。

另外一個類似的臨床研究，在非小細胞肺癌患者的治療中，應用自體樹突狀細胞(dendritic cells, DC)來源的外泌體可以運載黑色素瘤抗原基因(melanoma antigen gene, MAGE)，這項臨床研究表明，外泌體制得的疫苗具有可行性和有效性[56]。Dai等[57]發現，腹水來源的外泌體結合粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)或單獨使用外泌體治療40位結直腸癌患者，結果發現兩種治療方法都是安全且可行的，因為外泌體結合GM-CSF能夠誘導T淋巴細胞免疫反應。同時研究表明，腫瘤細胞來源的外泌體能夠促進免疫抑制[58]。如OVA(ovalbumin)表達的黑色素瘤細胞，包含所有的OVA蛋白，能夠抑制OVA特異性的免疫反應[59]。

腫瘤細胞來源的外泌體可以抑制多種淋巴細胞的免疫反應，也能夠通過下調NKG2D基因的表達引起免疫逃逸[55,60]。Clayton研究發現，NKG2D的下調是由于外泌體遞送轉化生長因子(transforming growth factor B1, TGFβ1)到CD8+T細胞或NK細胞的結果，各種腫瘤細胞來源的外泌體攜帶有NKG2D配體，這些外泌體能夠控制NKG2D在NK細胞和CD8+ T細胞的表達，因此會引起免疫逃逸[61]。雖然很多研究表明，腫瘤細胞分泌的外泌體抑制特定抗原和非特異性抗腫瘤反應，但其同樣能夠激活免疫系統[4,62]。

3.4 腫瘤化療的增敏作用

外泌體可以增強腫瘤耐藥，通過改變腫瘤局部PH值或信號通路，可以影響外泌體的分泌，進而提高化療藥物的效果。由于腫瘤細胞來源的外泌體容易靶向腫瘤細胞，可用外泌體投放化療藥物、活性小分子和基因治療劑[63]。研究發現，表面修飾后的外泌體可靶向腫瘤細胞，同時可以運送阿霉素等藥物[64]。應用外泌體投放microRNA可以增強腫瘤對化療藥物的敏感度，研究發現，miR-15、miR-16、miR-342和anti-miR-221/22均可增強腫瘤細胞對于他莫昔芬的敏感度；其中過表達miR-15和miR-16可以恢復表達Bcl-2抗凋亡基因[65]。過表達miR-342可以增加他莫昔芬誘導的凋亡[66]。吉非替尼的在腫瘤治療時的靶標是PI3K通路，microRNA家族的Let-7可抑制這個信號通路，進而增強腫瘤細胞對吉非替尼的敏感度[67]。Anti-miR-135可以增強肺癌異種移植瘤細胞對紫杉醇的敏感度[68]。miR-34在肺癌、前列腺癌和胰腺癌等腫瘤中表達較低，可以使用miR-34替代療法，起到對常規化療藥物的增敏作用[69]。

3.5 腫瘤治療中的應用

外泌體的主要功能就是遞送各種生物分子，包括蛋白質、多肽配體、DNA和RNAs。當外泌體有計劃或有選擇性的包裹特殊生物活性分子時，可以用于投放抑癌分子或化療藥物。如人第10號染色體缺失的磷酸酶-張力蛋白同源的蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN，一種腫瘤抑制蛋白)，被發現存在于鼠胚胎成纖維細胞和人胚胎腎臟細胞來源的外泌體中。PTEN能夠被受體細胞吞噬并抑制細胞增殖[70]。在遺傳工程中，外泌體可以運送自殺式mRNA或蛋白質，也可以運送前體藥物在腫瘤組織中轉化成5-氟 尿嘧啶(5-FU)，能夠誘導腫瘤細胞凋亡[71]。還有學者發現，修飾后的外泌體能夠有效的遞送let-7a miRNA到乳腺癌細胞，使表皮生長因子表達[72]。然而，所有的應用都僅處于實驗階段，外泌體在臨床上的應用還需要進一步探索。

腫瘤細胞來源的外泌體含有腫瘤活化分子，這些分子可以引起宿主的免疫反應參與腫瘤治療。因此，開發靶向性、功能性的外泌體對腫瘤治療具有深遠的意義。在1989年，Lentz MR發現，使用血液提取法，降低血液中外泌體的含量，6/16患者的腫瘤體積減少50%以上[73]。Aethlon Medical設計了一種血液過濾治療方案，叫做自適應親和力平臺技術系統(adaptive dialysis-like affinity platform technology, Aethlon ADAPT)，這個系統能夠捕獲大量的抗體和其他類似物質，如核酸適配體、蛋白配體和外泌體[74]。除了血液凈化，質子泵抑制劑(Proton pump inhibitors, PPIs)同樣能夠改善低PH值條件的腫瘤細胞，在活體內用PPI預處理能夠減少腫瘤細胞來源的外泌體在血漿中的含量，因此PPI很有可能成為抑制腫瘤細胞分泌外泌體的有效方法[75]。

4 問題與展望

一直以來，對外泌體的研究主要集中在腫瘤疫苗方面，但外泌體對腫瘤的具體作用及其調節機制尚不明確仍需深層次研究。大量研究表明，外泌體中miRNA在腫瘤的發生發展中具有極其重要的作用，其作為腫瘤早期診斷標志物已經得到廣泛研究，但外泌體中miRNA表達譜尚不完善、對于特定腫瘤尚未找到特異性的單個或多個miRNA，同時對于腫瘤細胞選擇性包裹miRNA并釋放外泌體以及受體細胞攝取的外泌體的作用機制目前缺乏有力的理論支撐。由于外泌體與受體細胞具有很好的特異性結合，使其成為理想的藥物載體，蛋白質等大分子物質可以裝載到外泌體內[76]。研究人員已成功將轉載藥物的外泌體應用于臨床治療，然而外泌體如何影響腫瘤環境中遠端細胞的增殖、生長知之甚少，需要不斷探索。外泌體作為具有細胞間物質和信息傳遞功能的活性分子，學者們正在不斷揭開其在腫瘤發生發展過程中的神秘面紗。

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Research progress of exosomes in tumor diagnosis and treatment

GUO Jing, XUE Gui-ying, HUANG Hao, YANG Xing-jiu，GAO Ran

(Comparative Medicine Center, Peking Union College (PUMC) &Institute of Medical Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS), Beijing 100021, China)

Exosomes have a size of 30-100 nm and membrane-bound nanovesicles, which is widely present in nearly all human body fluids, such as serum, saliva and urine, etc. Exosomes contain multiple proteins, nucleotides, and even viruses, and play an important role in the substance exchange and information transmission between cells. Recently, research found that genetic materials secreted from exosomes such as mRNA and miRNA were directly derived from their parent tumor cells, and they can directly effect on the receptor cells. Therefore, exosomes may become a new target for diagnosis and treatment of cancer. In this review, we described exosomes as a marker in early diagnosis of cancer, and its applications in cancer therapy.

Exosome；Cancer；miRNA; Diagnosis; Treatment

中央級公益性科研院所基本科研業務費。

郭靜(1987-)，男，博士研究生，主要研究方向：外泌體與腫瘤，E-mail: guojing5730375@163.com。

高苒(1980-)，女，副研究員，研究方向：比較醫學，E-mail: gaoran26@hotmail.com。

R-33

A

1671-7856(2017) 02-0086-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.02.016

2016-07-25