辣蓼黃酮中蘆丁、槲皮素與槲皮苷的含量分析

谷俐媛，陶俊宇，曾 蕓，韋英益，胡庭俊*

(1廣西大學動物科學技術學院，南寧530005；2廣西醫科大學基礎醫學院，南寧530021)

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.10.06

辣蓼黃酮中蘆丁、槲皮素與槲皮苷的含量分析

谷俐媛1，陶俊宇2，曾 蕓1，韋英益1，胡庭俊1*

(1廣西大學動物科學技術學院，南寧530005；2廣西醫科大學基礎醫學院，南寧530021)

為保障辣蓼黃酮工業化生產中的質量控制，建立辣蓼黃酮中蘆丁、槲皮素與槲皮苷含量測定高效液相色譜法。結果表明，運用高效液相色譜法測定辣蓼黃酮乙酸乙酯部分(FEA)中蘆丁、槲皮苷與槲皮素的含量分別為281.97、160.98、83.31 mg/g，辣蓼黃酮正丁醇部分(FNB)中蘆丁、槲皮苷與槲皮素的含量分別為150.33、147.51、73.82 mg/g。該方法簡單、準確、靈敏、重復性好，可作為辣蓼黃酮中蘆丁、槲皮素與槲皮苷含量分析的參考方法。

辣蓼；黃酮；高效液相色譜；含量分析

辣蓼，味辛、溫，具有祛風利濕，散瘀止痛，解毒消腫，殺蟲止癢之功效[1]。張國英等采用聚酰胺柱層析的方法，從辣蓼中分離得到5個黃酮類化合物：金絲桃苷、蘆丁、槲皮素、異鼠李素、山奈酚[2]。現代科學研究表明，黃酮類化合物具有生物抗氧化性、清除自由基作用以及抗衰老的活性，能影響血管的脆性與通透性、改善血液循環狀態，凈化血液，有降血脂、降血壓、降血糖的作用，還有鎮痛、免疫、抗炎、抗菌等藥用保健功能[3]。

目前，用于黃酮類化合物檢測的方法包括分光光度法、薄層色譜法、超臨界流體色譜法、質譜法、高效液相色譜法和毛細管電泳法[4-9]。其中，分光光度法操作簡單，但誤差較大。質譜及其聯用技術所用儀器精密，但價格非常昂貴。薄層色譜法和毛細管電泳法在靈敏度和精確度方面都不如高效液相色譜法。因此，本研究選用進樣量少，分辨效率高、靈敏度和準確度高的高效液相色譜法作為測定辣蓼黃酮中蘆丁、槲皮素與槲皮苷含量的分析方法。高效液相色譜法(HPLC)應用廣泛，已成為生命科學，臨床化學，藥物研究等方面的重要檢測方法[10]。HPLC法具有分離效能高，靈敏度高，重現性好的優點[11]。本試驗運用高效液相色譜法，以蘆丁、槲皮素與槲皮苷為對照品對辣蓼總黃酮進行目標成分含量測定，為獲得質量穩定含量均一的辣蓼總黃酮提供方法依據。

1 材 料

1.1 儀器與試劑 Waters 2695分離單元，Waters2998二極管陣列檢測器，Empower色譜工作站，超聲波清洗機(DTDN，寧波新芝生物科技有限公司)，純水儀(CD-UPT-1，成都純越科技有限公司)，微量離心機(TYPE1-14，SIGMA)，旋轉蒸發儀(ALPHA RA-8，Heidolph)，電熱恒溫干燥箱(DHG-9071A，上海精宏實驗設備有限公司)，乙腈(色譜純，TEDIA)，磷酸(色譜純，Fisher)，甲醇(色譜純，TEDIA)，石油醚(分析純，西隴化工股份有限公司)，三氯甲烷(分析純，西隴化工股份有限公司)，無水乙醇(分析純，北京化工廠)，蘆丁對照品(中國食品藥品檢定研究院 100080-200707)，槲皮素對照品(中國食品藥品檢定研究院 100081-201408)，槲皮苷對照品(中國食品藥品檢定研究院 111538-200504)。

1.2 辣蓼黃酮 辣蓼生藥購自南寧市山草堂，經酶解-超聲偶聯法提取后濾液經過石油醚、氯仿、乙酸乙酯以及正丁醇萃取。收集乙酸乙酯與部分與正丁醇部分，經XDA-8大孔吸附樹脂分離純化，得辣蓼黃酮乙酸乙酯部分(FEA)與辣蓼黃酮正丁醇部分(FNB)。FEA為淡黃色粉末，FNB為棕黃色粉末。

2 方 法

2.1 色譜條件 色譜柱為Waters XBridgeTM C18 (4.6 mm×250 mm 5 μm)；柱溫30 ℃；流速為1 mL/min；進樣量10 μL；檢測波長為359 nm；流動相：A相為乙腈，B相為0.3%磷酸水溶液，A∶B為(27∶73)等度洗脫。

2.2 供試樣品的制備 精密稱取0.1 g FNB與0.1 g FEA分別置于10 mL容量瓶中，加入流動相至刻度線于37 ℃下超聲20 min充分溶解，補足失重后4 ℃保存。

2.3 對照品的制備 取蘆丁、槲皮素與槲皮苷對照品均精密稱定為3 mg，分別置于10 mL 量瓶中混合，用流動相定容至刻度。取上述標準品溶液各1 mL置于5 mL容量瓶中并用用流動相定容至刻度，此時蘆丁、槲皮素與槲皮苷質量濃度為60 μg/ml。

2.4 專屬性試驗 在“2.1”所述的液相色譜條件下注入對照品與樣品，記錄蘆丁、槲皮苷與槲皮素保留時間，計算分離度，理論塔板數。

2.5 線性關系與線性范圍 取“2.3”項下混合對照品溶液配制成系列梯度的混合標準品對照液，按“2.1”項下所述色譜條件測定，記錄蘆丁、槲皮苷與槲皮素的峰面積。以混合對照品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線并進行線性回歸。

2.6 精密度試驗 取“2.3”項下混合對照品溶液按“2.1”項下所述色譜條件重復進樣測定6次，記錄蘆丁、槲皮苷與槲皮素的峰面積，計算RSD值。

2.7 重復性試驗 分別取FEA與FNB6份，按“2.2”項下制備成供試樣品，按“2.1”項下所述色譜條件測定蘆丁、槲皮苷與槲皮素的峰面積，計算RSD值。

2.8 穩定性試驗 取FEA與FNB按“2.2”項下制備成供試樣品于室溫中放置0、2、4、6、8、10、12 h，按“2.1”項下所述色譜條件測定蘆丁、槲皮苷與槲皮素的峰面積，計算RSD值。

2.9 加樣回收率試驗 取同一批已知含量的FEA與FNB，并加入一定含量的對照品，按“2.2”項下制備成供試樣品，按“2.1”項下所述色譜條件測定蘆丁、槲皮苷與槲皮素的峰面積。計算蘆丁、槲皮苷與槲皮素的含量，計算回收率，結果見表1～表4。由表中結果可知，用本方法檢測辣蓼黃酮中蘆丁、槲皮苷與槲皮素含量時對目標成分的損耗低，回收率在97%～99%之間。

2.10 樣品測定 取不同批次的FEA與FNB每批次樣品取3份，按“2.2”項下制備成供試樣品，按“2.1”項下所述色譜條件測定蘆丁、槲皮苷與槲皮素的峰面積。計算蘆丁、槲皮苷與槲皮素的含量。

3 結果與分析

3.1 回歸方程與線性關系 以各標準品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標建立回歸方程，如圖1所示。蘆丁：Y=381177X-4828.4，R2=0.9999，槲皮苷:Y=823682X-665955，R2=0.9998，槲皮素:Y=659877X-442376，R2=0.9999。結果表明蘆丁在進樣量在10～100 μg/mL，槲皮苷在進樣量在10～100 μg/mL，槲皮素在20～200 μg/mL內與峰面積呈良好線性關系。在“2.1”所述的液相色譜條件下，蘆丁、槲皮苷與槲皮素保留時間分別為7.9、11.9和26.5 min，各峰分離度大于1.5，理論塔板數大于3000。供試樣品相同的保留時間處無雜峰干擾，表明方法專屬性良好。色譜圖如圖2～圖6所示。

3.2 精密度試驗 結果顯示蘆丁、槲皮苷與槲皮素的RSD值分別為0.12%、0.45%和0.25%，精密度符合獸藥典要求。

3.3 重復性試驗 按重復性實驗要求，結果顯示： 蘆丁、槲皮苷與槲皮素的RSD值分別為1.10%、1.02%和1.03%，FNB的RSD值分別為0.68%、1.19%和0.61%。

3.4 穩定性試驗 結果顯示：FEA的RSD值分別為0.41%、0.17%和0.52%，得FNB的RSD值分別為0.41%、0.78 %和0.93%，表明供試品室溫內放置12 h內穩定。

3.5 加樣回收率試驗 結果見表1～表3。由表中結果可知，用本方法檢測辣蓼黃酮中蘆丁、槲皮苷與槲皮素含量時對目標成分的損耗低，回收率在97%～99%之間。

3.6 樣品測定 對不同批次，不同提取物的樣品進行含量檢測，結果如表4，結果顯示為FEA中蘆丁、槲皮苷與槲皮素的含量分別為281.97、160.98、83.31 mg/g，FNB中蘆丁、槲皮苷與槲皮素的含量分別為150.33、147.51、73.82 mg/g。

4 討論與小結

前人研究表明，辣蓼中所含黃酮成分有蘆丁、槲皮苷、槲皮素、金絲桃苷、異鼠李素與山柰酚。蘆丁能對糖尿病大鼠的氧化應激損傷，降低尿中蛋白含量[12]。蘆丁與槲皮素在小鼠模型中顯示出明顯的抗驚厥作用[13]。有學者研究發現槲皮苷、蘆丁、槲皮素與山柰酚為辣蓼中含量最多的黃酮[14]。所以本試驗選取3者為指標物質對FEA、FNB相應成分進行含量檢測。

在前期試驗中曾經考察過用甲醇與0.3%磷酸水溶液進行洗脫，但槲皮素的色譜峰會出現拖尾，于是選用乙腈與0.3%磷酸水溶液作為流動相，測得蘆丁、槲皮苷與槲皮素的峰形較好，各組分在各自濃度范圍內線性關系良好。在精密度試驗中，相對標準偏差(RSD)都小于1%，說明該方法精密度高，是可靠的。

運用高效液相色譜法測定FEA中蘆丁、槲皮苷與槲皮素的含量分別為281.97、160.98、83.31 mg/g，FNB中蘆丁、槲皮苷與槲皮素的含量分別為150.33、147.51、73.82 mg/g，本試驗所測的蘆丁、槲皮素與槲皮苷與Zhao F P[15]研究結果相一致。本研究運用的高效液相色譜檢測辣蓼黃酮中蘆丁、槲皮素與槲皮苷含量的方法，峰型對稱性較好，回收率高，且操作簡單、準確，精密度、重復性好，可以用于辣蓼黃酮中蘆丁、槲皮素與槲皮苷的含量分析。

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DeterminationofContentsofRutin,QuercetinandQuercitrininFlavonoidsfromPolygonumhydropiper

GU Li-yuan1, TAO Jun-yu2, ZENG Yun1, WEI Ying-yi1, HU Ting-jun1*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，GuangxiUniversity，Nanning，Guangxi530005,China; 2.SchoolofPreclinicalMedicine,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

HUTing-jun,E-mail:tingjunhu@126.com

The flavonoids ofPolygonumhydropiperwere separated and purified by means of macroporous adsorption resin, and its antioxidant activity was tested in previous research, which gained satisfied results. In order to obtain flavonoids ofPolygonumhydropipewith stable quality, and provide evidence for quality control in industrial production, high performance liquid chromatography for determination of total flavonoids inPolygonumhydropiperwas used with rutin, quercetin and quercitrin as reference substance. The results showed that the contents of rutin, quercetin and quercitrin from flavonoids ethyl acetate (FEA) inPolygonumhydropipewere 281.97, 160.98, 83.31 mg/g respectively; The contents of rutin, quercetin and quercitrin of flavonoids n-butanol (FNB) in polygonum hydropiper were 150.33, 147.51, 73.82 mg/g respectively. The method demonstrated advantage of simply,accuraty and sensitivity, and successfully applied to the analysis of rutin, quercetin and quercitrin content in flavonoids fromPolygonumhydropipe.

Polygonumhydropipe; flavonoids; high performance liquid chromatography

2017-06-26

A

1002-1280 (2017) 10-0039-07

S853.7

國家自然科學基金資助項目(31560708); 廣西大學獸醫學研究生培養基地建設項目(20160976)

谷俐媛，碩士研究生，從事獸醫藥理與毒理學方向研究。

胡庭俊。E-mail:tingjunhu@126.com.

(編輯：陳希)