甘草SRAP-PCR正交試驗設計優化及引物篩選

艾鵬飛，蘇 姍，靳占忠

(河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊 050018)

甘草SRAP-PCR正交試驗設計優化及引物篩選

艾鵬飛，蘇 姍，靳占忠

(河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊 050018)

為了建立甘草SRAP技術，采用四因素(Taq酶，Mg2+，dNTP，引物)四水平的正交試驗設計[L16(44)]對甘草進行SRAP-PCR試驗，電泳結果采用軟件SPSS分析，退火溫度和引物篩選采用單因子試驗。結果發現，4種因素對甘草SRAP-PCR的影響依次為dNTP>Taq酶>Mg2+>引物；優化后的甘草SRAP-PCR體系(20 μL)為1×PCR緩沖液，引物0.6 μmol/L，Mg2+2.5 mmol/L，Taq酶 1.5 U，dNTP 0.3 mmol/L，模板DNA 40 ng；最佳的退火溫度為50 ℃；81對引物中有22對擴增出明亮、清晰的譜帶。該優化的SRAP-PCR反應體系為進行甘草資源遺傳分析提供了技術支持。

植物遺傳學；甘草；SRAP；PCR；正交試驗設計；引物篩選

相關序列擴增多態性(sequence-relatedamplifiedpolymorphism，SRAP)是基于PCR的一種顯性標記，它通過獨特的雙引物對基因的ORFs(openreadingframes，開放閱讀框)特定區域進行擴增(上游引物17bp，擴增外顯子區域；下游引物18bp，擴增內含子、啟動子區域)。

由于不同物種、同物種的不同個體彼此之間的啟動子、外顯子、內含子和間隔區域長度不同，SRAP-PCR的結果表現出多態性。相較于其他的分子標記(如RAPD，SSR，ISSR，AFLP等)，SRAP具有引物通用性強、操作簡單、PCR產物穩定、多態性豐富等優點[1]，目前廣泛應用于物種鑒定[2]、遺傳多樣性分析[3-4]、遺傳圖譜構建[5]、比較基因組學[6]等方面。

本試驗采用L16(44)正交試驗設計[7]，對甘草SRAP-PCR反應體系中的4個因素(Taq酶，Mg2+，dNTP，引物)在4個水平上進行試驗，優化甘草的SRAP-PCR體系，為評價和利用其種質資源提供技術支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以本研究小組選育出來的甘草(Glycyrrhiza uralensisFisch.)優系JA-1(甘草酸質量分數為3.2%)為試材，SRAP引物序列(見表1)由北京賽百盛生物公司合成，dNTP和Taq酶等購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 試驗方法

1)DNA提取與電泳檢測

CTAB法[8]提取甘草株系JA-1葉片基因組DNA，經1.2%(質量分數，下同)瓊脂糖凝膠電泳檢測，無菌水稀釋至質量濃度為40 ng/μL，-20 ℃冰箱保存。

2)SRAP-PCR正交試驗設計

采用引物組合M5-E5(表1)對影響SRAP-PCR反應的dNTP，Mg2+，引物，Taq酶進行四因素四水平的正交L16(44)試驗設計(表2)。在20 μL的PCR反應體系中，含有1×PCR 緩沖液和40 ng模板DNA，其他成分含量按表2進行，共16個處理，3次重復。

PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，35 ℃復性45 s,72 ℃延伸1 min，5次循環；94 ℃變性40 s，50 ℃復性45 s，72 ℃延伸1 min，30次循環；72 ℃延伸8 min。1.2%瓊脂糖凝膠(添加0.5 μg/mL EB)電泳擴增產物后，采用凝膠成像分析儀拍照。基于條帶清晰和帶型豐富程度，電泳圖譜中最佳組合記為16分，其次記15分，依次類推，最差的記1分，統計結果采用軟件SPSS V13.0分析。

3)退火溫度優化

基于正交試驗設計篩選出的最佳組合，采用單因子試驗對退火溫度進行優化。退火溫度5個水平依次為46，48，50，52，54 ℃。

4)SRAP引物篩選

基于試驗結果得出的SRAP-PCR最佳反應體系和反應程序，采用81對SRAP引物組合(見表1)進行穩定性驗證和引物篩選。

表1 SRAP 引物序列

2 結果與分析

2.1 SRAP-PCR正交試驗設計結果直觀分析

由于Taq酶、引物、dNTP和Mg2+的濃度不同，SRAP-PCR擴增的譜帶條數和清晰度也不同[8]，正如圖1所示的正交試驗設計的SRAP-PCR電泳結果。正交試驗設計L16(44)的統計結果見表2，極差分析表明4個因素對SRAP-PCR反應的影響大小依次為dNTP濃度、Taq聚合酶量、Mg2+濃度、引物濃度，方差分析(見表3)表明4個因素彼此之間的差異均表現出顯著性水平(P<0.05)。因此，需要對4個因素的不同水平進行分析，其SRAP-PCR結果數值見圖2。

表2 SRAP-PCR 正交試驗設計L16(44)

注：K1—K4分別表示各因素1—4種水平的結果平均值；R表示平均值的極差值。

圖1 正交試驗設計SRAP-PCR電泳結果Fig.1 Electrophoresis profiles of SRAP-PCR by orthogonal test design

因素偏差平方和自由度F值顯著性水平P<0．05P<0．01c(dNTP)212．503111．25???c(引物)19．5039．75?Taq酶65．50332．75???c(Mg2+)30．50315．250?

注：* 表示差異顯著；**表示差異極顯著。

圖2 4個因素對SRAP-PCR 結果數值的影響Fig.2 Effects of four factors on the outcoming value in SRAP-PCR

2.2 dNTP濃度對SRAP-PCR結果數值的影響

dNTP是PCR反應的原料[9]。本試驗中，dNTP濃度對SRAP-PCR結果的影響顯示出極顯著性水平P<0.01(見表3)。由圖2可知，SRAP-PCR結果數值隨著dNTP濃度0.10 mmol/L增至0.40 mmol/L時先增大后減小，且在0.30 mmol/L時結果數值最大，此時表現出帶型清晰，主帶明顯(見圖1)。應東山等[10]認為dNTP濃度過高時會結合Mg2+，使得反應體系中游離的Mg2+濃度降低。故dNTP最適濃度為0.30 mmol/L。

2.3Taq酶對SRAP-PCR結果數值的影響

表3表明，Taq酶對SRAP-PCR擴增結果的影響表現出差異極顯著(P<0.01)。如圖2所示，SRAP-PCR結果數值隨著Taq酶用量的增加先增大后減小，且為1.5U時結果數值最大。圖1中，Taq酶1.5U時譜帶清晰、明亮、無雜帶。因此。20μL體系中Taq酶為1.5U時較好。

2.4 Mg2+濃度對SRAP-PCR結果數值的影響

在PCR反應體系中，Mg2+是Taq酶的激活劑[10]。圖2表明，Mg2+濃度為1.5 ～3.0 mmol/L時，SRAP-PCR擴增的結果數值先增大后減小，且在2.5 mmol/L時最大。其原因是Mg2+濃度過低時降低了Taq酶活性，減少了PCR產物量，過高時引起非特異性擴增[10]。故本試驗最佳的Mg2+濃度為2.5 mmol/L。

2.5 引物濃度對SRAP-PCR結果數值的影響

引物濃度對SRAP-PCR結果數值的影響見圖2，當引物濃度為0.2 ～0.8μmol/L時，SRAP-PCR的結果數值變化不大，其中引物濃度為0.6μmol/L時結果數值最大。圖1也表明，引物濃度較低時擴增的譜帶(非主帶)較弱，濃度過高時譜帶信號強，但同時背景加深。其原因是引物濃度過低時影響擴增效率，過高時引起與DNA模板鏈錯配產生假陽性條帶[11]。因此，引物濃度可選用0.6μmol/L。

2.6 退火溫度對SRAP-PCR結果的影響

在PCR反應體系中，退火溫度影響引物與DNA模板鏈的特異性結合[11]。由圖3可知，退火溫度過高或過低時擴增效果都不理想，當退火溫度為50 ℃時，擴增出的譜帶清晰、明亮，帶型豐富。因此，適宜的退火溫度為50 ℃。

圖3 不同退火溫度的SRAP-PCR電泳結果Fig.3 Electrophoresis profiles of SRAP-PCR at various annealing temperatures

2.7 SRAP-PCR優化體系的驗證與引物篩選

采用優化后的反應體系和反應程序，對81個SRAP引物組合(表1)進行PCR擴增，結果見圖4，22對引物表現出了條帶清晰、豐富，表明優化后的PCR體系適用于甘草的SRAP分析。篩選出的甘草SRAP引物組合22對(圖4)依次為M1-E9，M2-E2，M2-E4，M3-E4，M3-Em8，Me4-E2，M4-E7，M4-E8，M5-E5，M5-E9，M6-E3，M6-E4，M6-E6，M7-E2，M7-E4，M7-E7，M8-E1，M8-E4，M8-E7，M9-E1，M9-E4，M9-E5。

圖4 22對引物組合的SRAP-PCR電泳結果Fig.4 Electrophoresis profiles of SRAP-PCR with 22 primers combined

3 結 論

SRAP-PCR的擴增結果受到反應體系、擴增程序以及物種特性的影響[10-12]。因此，要獲得條帶清晰、穩定的電泳圖譜，需要針對試驗材料調整和優化反應體系中的不同組分和PCR程序等主要影響因子。

正交試驗設計是基于統計學原理，從復因子試驗中選出有代表性的水平組合進行試驗，這樣既減少了處理組合數，又統籌到各因素不同水平間的交互作用，相對于單因素試驗和完全組合設計更加高效[7，13]。另外，在正交試驗設計中，采用統計分析法可有效地考察出各組分不同水平下的差異顯著性，以致試驗結果分析得更加科學和完善[14]。當然，在該方法的直觀分析中，對試驗結果的賦值打分帶有一定的主觀成分，以致影響到最終各因素最佳水平確定的可靠性[15]。在具體試驗中，如本研究中通過增加正交試驗的重復次數和驗證試驗來減少直觀因素帶來的負面影響。

本研究基于正交試驗設計優化了甘草SRAP-PCR反應體系，即在20 μL的反應液中，含dNTP 0.3 mmol/L，Taq酶1.5 U，Mg2+2.5 mmol/L，引物0.6 μmol/L，模板DNA 40 ng，1×PCR 緩沖液。通過單因素試驗確定了最佳的退火溫度為50 ℃。驗證試驗和引物篩選結果表明，該優化體系穩定、可靠，可以用于甘草的遺傳分析和資源評價等研究中。

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Optimization of SRAP-PCR system on Glycyrrhiza uralensis by orthogonal test design and selection of primers

AI Pengfei, SU Shan, JIN Zhanzhong

(School of Bioscience and Bioengineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang, Hebei 050018, China)

In order to establish the SRAP-PCR technology forGlycyrrhizauralensis, an orthogonal design testing is used to optimize the reaction system of SRAP-PCR with 4 factors (Taqpolymerase, Mg2+, dNTP and primer) at 4 levels, and the electrophoresis profiles are analyzed by software SPSS. The annealing temperature and SRAP primer combinations are selected using the single factor experiment. The results show that effects of the 4 factors on the SRAP-PCR are dNTP,Taqpolymerase, Mg2+and primer in turn. The optimized SRAP-PCR reaction system (20 μL) forG.uralensisis constructed of 1×PCR buffer, 0.6 μmol/L primers, 2.5 mmol/L Mg2+, 1.5 UTaqpolymerase, 0.3 mmol/L dNTP and 40 ng DNA template. The optimized annealing temperature is 50 ℃. Using the optimized system, 22 primer combinations are selected among 81 primer combinations, which produced bright and clear bands. The optimized SRAP-PCR system can provide the technique support for the phylogenetic analysis ofG.uralensis.

plantgenetics；Glycyrrhiza uralensisFisch.;SRAP;PCR;orthogonaltestdesign;primerscreening

1008-1534(2017)01-0007-05

2016-06-05;

2016-11-21；責任編輯：王海云

河北省科技計劃項目(14237503D-3)

艾鵬飛(1974—)，男，湖北黃岡人，教授，博士，主要從事植物資源評價與應用方面的研究。

靳占忠教授。E-mail:1820482432@qq.com

Q37

A

10.7535/hbgykj.2017yx01002

艾鵬飛，蘇 姍，靳占忠.甘草SRAP-PCR正交試驗設計優化及引物篩選[J].河北工業科技,2017,34(1):7-11. AI Pengfei, SU Shan, JIN Zhanzhong.Optimization of SRAP-PCR system onGlycyrrhizauralensisby orthogonal test design and selection of primers[J].Hebei Journal of Industrial Science and Technology,2017,34(1):7-11.