豬流行性腹瀉病毒和大腸桿菌混合感染的診斷

李 超，王宇婷，倪宏波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

豬流行性腹瀉病毒和大腸桿菌混合感染的診斷

李 超，王宇婷，倪宏波?

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

2016年4月，大慶某豬場發(fā)生一起以2～7日齡哺乳仔豬腹瀉、脫水和高死亡率為特征的傳染病，發(fā)病率為30%，死亡率達(dá)50%以上，給豬場造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀觀察、病畜剖檢和實驗室診斷，最終確診為豬流行性腹瀉與大腸桿菌混合感染。對分離細(xì)菌進(jìn)行藥敏試驗，結(jié)果顯示，鹽酸頭孢噻呋鈉、硫酸頭孢喹肟和多黏菌素B對大腸桿菌高度敏感，而慶大霉素和卡那霉素有一定耐藥性。

豬流行性腹瀉病毒；大腸桿菌；混合感染

在集約化養(yǎng)豬生產(chǎn)的條件下，仔豬腹瀉是一種典型的多因素性疾病。近年來，因腹瀉死亡的仔豬占仔豬死亡總數(shù)的38.9%[1]，給養(yǎng)殖場造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。引起仔豬腹瀉的病原很多，其中傳染性病原是導(dǎo)致仔豬高發(fā)病率和高死亡率的重要原因，為了防止疾病的進(jìn)一步蔓延，需要對病原進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的診斷。許多研究證明，引起仔豬腹瀉的重要病原有致病性大腸桿菌（Enteropathogenic Escherichia coli，EPEC）、豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine virus，TGEV）、豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus of swine virus，PEDV）和豬輪狀病毒（Rota virus of swine virus，RDV)[2]。

仔豬高死亡率是亞洲PED爆發(fā)的特點(diǎn)，而且臨床上無法與急性TGEV相區(qū)別，仔豬患病后一般先腹瀉后嘔吐，迅速脫水，皮膚變紅停止吃乳，精神不振，死亡率極高，成年母豬發(fā)病率15%～90%不等，表現(xiàn)為一過性腹瀉并伴有產(chǎn)奶和食欲下降現(xiàn)象[3]。據(jù)報道我國有80%的豬場感染過PEDV，發(fā)病率約40%，哺乳仔豬死亡率達(dá)90%以上，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起豬的一種急性腸道傳染性疾病。臨床上主要表現(xiàn)為腸炎、腸毒血癥等多種癥狀[4]。常見的有仔豬黃痢、仔豬白痢和仔豬水腫病3種。這三種疾病可造成仔豬大量死亡或生長發(fā)育不良，成為養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的嚴(yán)重障礙之一[5]。豬腸道內(nèi)大腸桿菌過量繁殖和腸道內(nèi)菌群失調(diào)是本病的重要病因。江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗證實豬輪狀病毒是仔豬白痢的病因之一。氣候的變化和飼養(yǎng)管理不當(dāng)是本病發(fā)生的最主要的誘因[6]。豬水腫病是由溶血性大腸桿菌毒素所引起的斷奶仔豬眼瞼或其他部位水腫、神經(jīng)癥狀為主要特征的疾病。該病多發(fā)于仔豬斷奶后1～2周，發(fā)病率約5%～30%，病死率達(dá)90%以上[7]。近幾年，本病又有新的流行特點(diǎn)：首先，發(fā)病日齡不斷增加，據(jù)各地反饋情況40～50 kg的豬也有水腫病的發(fā)生；其次，吃得越多、長得越好的豬，其發(fā)病率和死亡率越高。

本文根據(jù)對大慶市某豬場送檢豬的病理剖檢和實驗室診斷，確診其發(fā)病原因是該豬同時感染豬流行性腹瀉病毒和大腸桿菌。

1 材料與方法

1.1 病料的采集 大慶地區(qū)某豬場送檢的無菌采集的豬的肺臟、肝臟、脾臟、腎臟和腸，供實驗室診斷用。

1.2 試劑 Marker DL 2000購自大連寶生物工程有限公司，TIANamp Genomic DNA Kit DNA提取試劑盒購自TIANGEN公司，PCR Master Mix緩沖液，RNeasy Plus Mini Handbook RNA提取試劑盒購自QIAGEN公司，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自MBI公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的豬流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎和輪狀病毒的基因序列設(shè)計特異引物。

1.4 細(xì)菌分離培養(yǎng) 無菌剪取一小塊深部組織臟器，接種涂抹于5%兔血瓊脂培養(yǎng)基上，分別做需氧和厭氧培養(yǎng)，置37℃恒溫箱中24 h，同時用接菌環(huán)挑取腸內(nèi)容物接種在伊紅美藍(lán)和麥康凱培養(yǎng)基上，置37℃恒溫箱中需氧培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)和溶血情況等，挑取疑似菌的單個菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。

表1 引物序列Table 1 Peimer sequence

1.5 核酸的提取及鑒定

1.5.1 組織DNA和RNA提取 按照TIANamp Genomic DNA Kit操作進(jìn)行提取DNA；按照RNeasy Plus Mini Handbook RNA提 取 盒 進(jìn) 行 提 取RNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 RNA反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增 按RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄盒說明書操作步驟將病毒提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA在-20℃進(jìn)行保存?zhèn)溆?。用得到的DNA和cDNA為模板，豬流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎和輪狀病毒特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增，取10 μL的擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.6 藥敏試驗 將鑒定為大腸桿菌的純培養(yǎng)物用接種棒均勻涂布在鮮血培養(yǎng)基上，將藥敏紙片（慶大霉素、卡那霉素、恩諾沙星等10種藥物）分別貼于平皿中，37℃培養(yǎng)24 h，測定抑制菌圈直徑大小，根據(jù)檢測標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 剖檢變化 剖檢可見剖檢病死豬結(jié)腸內(nèi)容物呈漿狀、糊狀或油膏狀，呈乳白色或灰白色，部分粘附于黏膜上，不易完全剝離，腸黏膜有卡他性炎癥變化，腸系膜淋巴結(jié)輕度腫脹，胃黏膜出血伴有凝塊，腎盂有黃色物質(zhì)，腸壁變薄透明狀，小腸伴有鼓氣等癥狀。

圖1 胃黏膜出血伴有凝塊Fig.1 Gastric mucosal bleeding with clot

圖2 腎盂內(nèi)有黃色物質(zhì)Fig.2 Yellow substance in the renal pelvis

圖3 小腸脹氣，腸壁變薄呈半透明狀Fig.3 Intestinal flatulence,intestinal wall became thin and translucent

圖4 腸系膜充血，腸系膜淋巴結(jié)腫大Fig.4 Mesenteric lymph node,mesenteric lymph node

2.2 革蘭氏染色 將病料中所分離的細(xì)菌進(jìn)行純培養(yǎng)，進(jìn)行革蘭氏染色、涂片、鏡檢?？梢姷礁锾m氏染色陰性桿菌，中等大小，直桿菌（見圖5）。由于大腸桿菌和沙門氏菌的形態(tài)及染色特征十分相似，所以為了區(qū)分這兩種細(xì)菌，又分別接種于伊紅美藍(lán)和麥康凱培養(yǎng)基進(jìn)行鑒別培養(yǎng)，結(jié)果為麥康凱培養(yǎng)基長出粉色，光滑，圓形菌落；在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基長出紫黑色，金屬光澤菌落（見圖6、圖7）。

圖5 革蘭氏染色兩端鈍圓桿狀菌（10×10）Fig.5 Gram stain on both ends of blunt round bar(10×10)

圖6 伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基 菌落金屬光澤Fig.6 Eosin methylene blue medium colony metallic luster

圖7 麥康凱培養(yǎng)基 圓形菌落粉色、光滑F(xiàn)ig.7 Makanke culture medium round colony pink,smooth

2.3 PPCCRR結(jié)果 以組織中提取的病毒DNA以及病毒RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，分別選用豬流行性腹瀉、豬傳染性胃腸炎和豬輪狀病毒的特異性引物進(jìn)行PCR鑒定。其中第1孔在507 bp左右有一條條帶，與豬流行性腹瀉病毒預(yù)期片段大小相符（如圖8）。

圖8 PCR電泳分析圖Fig.8 PCR electrophoresis analysis chart

2.4 藥敏試驗結(jié)果

表2 藥敏結(jié)果Table 2 The results of drug susceptibility

3 討論

3.1 發(fā)病原因 對該豬場仔豬的發(fā)病原因進(jìn)行調(diào)查，該豬場飼養(yǎng)管理水平低，飼養(yǎng)密度大，飼料不科學(xué)；環(huán)境消毒不合格，排泄物沒有無害化處理；免疫程序混亂，沒有經(jīng)過科學(xué)的疫苗免疫程序。這些因素給病原提供大量繁殖并發(fā)生變異的機(jī)會，造成多種病原存在豬只體內(nèi)，當(dāng)環(huán)境驟變時，豬體抵抗力下降，病原侵入豬體造成嚴(yán)重?fù)p失。

3.2 防治措施 環(huán)境凈化。豬場環(huán)境要經(jīng)常消毒，疫情嚴(yán)重威脅時，每天消毒1次，連續(xù)消毒1周，以后夏天每周2次，冬天每周1次；豬舍凈化。在多數(shù)豬場尚無多點(diǎn)生產(chǎn)體系情況下，保育舍和育肥舍要作到單元式全進(jìn)全出生產(chǎn)管理，即每個豬舍的用具、人員等要獨(dú)立，用具不可共用，人員不要來往[8]。保育豬轉(zhuǎn)舍，育肥豬出欄后，要最少空舍2周，這2周內(nèi)至少要消毒2次；體外凈化。轉(zhuǎn)入新豬舍的第1周每天帶豬消毒1次，以后每周消毒1～2次；體內(nèi)凈化。母豬產(chǎn)前產(chǎn)后7 d、子豬斷奶前后1周、轉(zhuǎn)群前后1周飼料中加中元敗毒威和黃芪多糖。用流行性腹瀉和大腸桿菌疫苗免疫接種，間隔半月再補(bǔ)防1次。要加強(qiáng)護(hù)理，一旦發(fā)現(xiàn)病豬最好隔離，單獨(dú)飼養(yǎng)，給它創(chuàng)造一個安靜舒適的環(huán)境，減少應(yīng)激，有利于疾病的康復(fù)。

4 結(jié)論

通過對該病死豬的病理解剖和實驗室診斷，確診送檢的病死豬死亡原因是該豬感染了豬流行性腹瀉病毒和大腸桿菌，但是主要病因是豬流行性腹瀉病毒，因為免疫力下降時會出現(xiàn)致病性大腸桿菌增多，這種情況下才會有大腸桿菌感染，屬于繼發(fā)感染。

[1]于曉龍.豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸炎病毒混合感染的調(diào)查[J].安徽農(nóng)學(xué)通報，2007，13（14）：156-157.

[2]喬瑾，趙保生.規(guī)模化豬場生物安全控制技術(shù)研究[J].畜牧獸醫(yī)雜志，2011，（4）：102-105.

[3]Kadoi K,Sugioka H,Satoh T,et al.The propagation of a porcine epidemic diarrhea virus in swine cell lines[J].The new microbiologica,2002,25(3)∶285.

[4]錢峰.仔豬出血性大腸桿菌病的診斷與防治[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2009（4）：101.

[5]李永明.豬大腸桿菌病病原學(xué)研究概況[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，1990（4）：39-41.

[6]李志貴.淺談仔豬自痢的綜合防治措施[J].中國畜牧獸醫(yī)義摘，2012，28（7）：44-65.

[7]魏杰，韓方偉，林建平，等.仔豬黃自痢的預(yù)防和治療[J].畜牧與獸醫(yī)，2011（3）：122.

[8]萬遂如.規(guī)?；i場防控豬疫病的綜合技術(shù)措施[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2014（2）：33-40.

Porcine Epidemic Diarrhea Virus and E.coli Infection in Laboratory Diagnosis and Susceptibility Testing

Li Chao，Wang Yuting,Ni Hongbo*
(College of animal science and technology,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Heilongjiang Daqing 163319)

April 2016,a pig farm in DaQing occurred 2 to 7-day-old piglets diarrhea,dehydration and high mortality characteristics of infectious diseases,the incidence rate was 30%and the mortality rate of more than 50%,make farms caused great economic losses.According to epidemiological investigation,clinical observation,autopsy and laboratory diagnosis of sick animals, and ultimately diagnosed as porcine epidemic diarrhea and E.coli infection.Isolated bacteria susceptibility test results showed that sodium hydrochloride ceftiofur,cefquinome sulfate and polymyxin B against E.coli highly sensitive to gentamicin and kanamycin have some resistance.

Porcine epidemic diarrhea virus;Escherichia coli;The mixed infection

S858.28

B

1672-9692(2016)12-0044-04

2016-11-01

李超（1993-），男，黑龍江人，在讀碩士，研究方向為分子細(xì)菌學(xué)和免疫學(xué)。

倪宏波（1972-），男，黑龍江人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事分子細(xì)菌學(xué)和免疫學(xué)研究。