金黃色葡萄球菌檢測方法的研究進展

文/孔祥瑞 王洪柱

（1 黑龍江立高儀器設備有限公司；2 黑龍江龍丹乳業科技股份有限公司）

金黃色葡萄球菌檢測方法的研究進展

文/孔祥瑞1王洪柱2

（1 黑龍江立高儀器設備有限公司；2 黑龍江龍丹乳業科技股份有限公司）

金黃色葡萄球菌是人體致病菌，被其污染的食品會由于金黃色葡萄球菌代謝的腸毒素導致中毒。因此，在原料乳及乳產品檢驗中金黃色葡萄球菌是作為一種致病菌污染的指示菌，其檢測方法的開發和研究具有重要作用和意義。研究論述了金黃色葡萄球菌國內和國外檢測方法的研究進展，旨在為食品生產提供一種快速、方便、準確的檢測技術。

金黃色葡萄球菌；檢測方法；研究進展

金黃色葡萄球菌是廣泛存在于自然界和人體皮膚上的兼性厭氧革蘭氏陽性菌。它存在于人體的鼻黏膜、腸道、皮膚等部位，通常不具致病性，但是皮膚化膿感染常見的病原菌[1]。雖然它不具有致病性，但其產生的腸毒素會導致中毒。食品易受其污染，導致人體食物中毒，主要癥狀是發燒、腹瀉和惡心嘔吐[2～3]。金黃色葡萄球菌分泌20 多種毒性蛋白質，常見為7 種，可耐高溫，100 ℃加熱30 min不被破壞，據報道成人僅食用約100 ng腸毒素A，即可導致食物中毒[4]。近幾年，我國因金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件已居全世界第4位[5]。為控制金黃色葡萄球菌的污染，應定期檢查奶牛乳房，定期檢查工作人員健康狀況，并且應在低溫和通風良好的條件下貯藏生牛乳。金黃色葡萄球菌在乳制品中最常見，因此金黃色葡萄球菌的檢測技術十分重要。本文對目前金黃色葡萄球菌的檢測方法研究進展進行綜述，旨在為從事金黃色葡萄球菌檢測鑒定的工作人員提供指導和參考。

1 金黃色葡萄球菌檢測的常規方法

食品中金黃色葡萄球菌的國標檢測方法大多采用平板計數法，我國食品金黃色葡萄球菌的檢測是以GB 4789.10-2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》為依據。定性檢測前先配制液體培養基進行前增菌，后將混合好的培養物接種到血平板或Baird-Parker平板，當培養終止，觀察特征，鏡檢，通過血漿凝固酶做生化鑒定。定量檢測前先將樣品稀釋，后將樣品接種到Baird-Parker平板，培養一定時間，計數典型菌落。金黃色葡萄球菌腸毒素可通用ELISA快速檢測試劑盒對A、B、C、D、E 5 種腸毒素型進行檢測[6]。

2 快速檢測方法

快速檢測方法是傳統方法的改進，微生物在生長代謝時會產生特異性酶或其它代謝產物，將顯色底物加入到選擇培養基中，微生物生長時會使其具有特殊顏色，從而分離和鑒別金黃色葡萄球菌。快速檢測方法大大縮短了檢測時間，并且能夠快速得到結果，操作方法相對簡單。食源性致病菌的危害是食品安全的一個重要方面。近年來，食源性致病菌污染事件頻頻發生，食品安全國家標準對不同食品有相關規定，近來國家標準化管理委員會還通過了對食品中致病菌、污染物的限量規定。現有致病菌的檢測技術與方法受設備、人員、環境制約，基層人員難以掌握推廣，成熟的快速檢測技術和方法是未來食源性致病菌檢測的發展方向。

2.1 測試片法

測試片法是近年來采用較廣泛的方法，是指以膠片、紙片等作為培養載體，將特定的顯色物質和營養培養基質附在載體上，通過在其上生長的微生物代謝與顯色物反應以測定食品中的微生物含量。其具有操作簡便、價格低廉、污染小，無需配制試劑、無需準備大量器皿，少量樣品也可測定，易于保存和消毒，方便攜帶及運輸，能真實反映檢品中的細菌數等優點，但是其無法準確定性計數。此法現在已應用在快速檢測領域中，其中美國3M公司Petrifilm為載體的測試片應用最為廣泛。該測試片主要由金黃色葡萄球菌熱穩核酸酶片及培養基兩部分組成，第一部分是Baird-Parker改良后的培養基，第二部分是利用金黃色葡萄球菌在生長過程中產生的特異性熱穩核酸酶，盡管加熱到一定溫度，然而仍具有活性，能夠分解DNA鏈，之后與底物四唑指示劑、甲苯胺藍反應，1～3 h后顯色，呈現粉紅色的圓環菌落，從而鑒定金黃色葡萄球菌。隨著國外顯色檢測技術的成熟，國內也主要對顯色培養基進行研究。

2.2 試劑盒法

試劑盒法通常將十多種，甚至幾十種培養基或成分集中在特定微型裝置內，通過觀察微生物的生長和代謝過程的某些產物或現象，對試驗現象進行分析，將傳統試驗中多次試驗通過一次完成，縮短了檢測時間。此法可大大縮短測試時間，在24 h內得出結果，甚至某些可縮短至4 h內。目前，用于檢測金黃色葡萄球菌的成品試劑盒有API、MIS等，以及廣東環凱公司生產的顯色培養基PEN-CF[7]試劑盒。

3 分子生物學方法

自然界中每一物種都有獨一無二的DNA或RNA核酸結構序列，隨著生命科學和分子生物科學研究的不斷發展，一些菌的核酸序列不斷被發現，并作為檢測目標，形成了靈敏度高、檢測限低、特異性強的檢測方法。

3.1 核酸探針技術

核酸探針技術是利用核酸序列，用已知DNA或RNA片段作探針與這些特異核酸序列發生結合，識別標記，然后根據核酸分子間堿基互補配對原則，通過原位、斑點雜交檢測核酸序列的同源情況。核酸探針技術優點是特異性強，但其檢測周期長，操作繁瑣，容易出現假陽性等問題。陳彬等[8]用熒光素去標記金黃色葡萄球菌特異DNA探針，然后與經過增菌處理的金黃色葡萄球菌rRNA雜交，生成RNA和DNA雜交鏈。在450 nm處用熒光儀讀其吸收峰，當峰面積超過其臨界數值，說明有金黃色葡萄球菌存在；薛力剛等[9]用吖啶酯特異DNA探針檢測金黃色葡萄球菌，此法準確性高；高正琴等[10]利用耐熱核酸酶核酸探針技術對金黃色葡萄球菌進行檢測，與核酸斑點雜交技術對比，結果相符率達100%。

3.2 聚合酶鏈式反應技術

聚合酶鏈式反應英文縮寫為PCR，是無細胞的克隆技術，或是特異性DNA體外酶促擴增技術[11]。該方法可對DNA序列進行分析，但檢測周期長，設備昂貴。Khan等[12]通過PCR法檢測牛奶中的金黃色葡萄球菌，檢出率以及靈敏度都達到100%。田靜等[13]利用PCR法檢測牛奶、肉、冰淇淋等食品中的金黃色葡萄球菌，檢出限高達10 CFU/g。

3.3 環介導等溫擴增技術

環介導等溫擴增，英文縮寫為LAMP。此法是利用4 種特異性引物識別目標基因的特定區域，在BstDNA聚合酶作用下，進行恒溫擴增，30～60 min后目標基因數量能達到109～1010個拷貝數量級，實現快速檢測目標基因的目的。周義正等[14]利用LAMP技術檢測陽性血培養瓶中的金黃色葡萄球菌，其檢測結果與傳統檢測結果一致。

4 免疫學方法

利用特異性標記物如酶、放射性同位素、熒光物質等標記抗原和抗體，通過這些標記的抗原、抗體與抗原抗體特異性物質發生特異性結合，檢測這些標記物的含量而達到定性和定量檢測。

4.1 免疫磁性微球技術

免疫磁性微球技術檢測時間短、精度較高，但成本較高。Yazdankhah等[15]利用酶聯免疫吸附和免疫磁性分離相結合的方式檢測牛奶中的金黃色葡萄球菌。劉琳琳[16]制備金屬螯合免疫磁性微球，用于分離金黃色葡萄球菌的SPA蛋白，進行免疫印記分析檢測金黃色葡萄球菌。

4.2 酶聯免疫技術

酶聯免疫技術靈敏度高、特異性強，但所用的抗原、抗體以及酶標記物等生物制劑穩定性差，不能同時對多種組分進行檢測。段鴻斌[17]利用酶聯免疫吸附法檢測金黃色葡萄球菌的B型腸毒素。陳靖等[18]用此法檢測金黃色葡萄球菌的腸毒素，檢測結果與SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法一致。目前，酶聯免疫吸附技術主要應用在金黃色葡萄球菌所分泌的腸毒素的檢測。

4.3 乳膠凝集技術

乳膠凝集技術操作相對簡單，且成本較低，然而致敏的乳膠會因存儲條件的不利產生自凝，使靈敏度降低，鮑行豪等[19]采用了反向間接血凝技術，通過反向被動使乳膠凝集，由此檢測金黃色葡萄球菌腸毒素。

4.4 免疫熒光技術

免疫熒光技術操作方便、簡單且靈敏，但檢測熒光設備昂貴。朱廣發等[20]采用熒光抗體技術對金黃色葡萄球菌進行快速檢測。Khan等[21]將免疫熒光技術與酶聯免疫技術結合檢測金黃色葡萄球菌腸毒素。

5 生物傳感器技術

將生物分子作為生物傳感器的敏感元件，把生物代謝生長過程中發生的化學、物理、熱、光信號轉化為相應的電信號[22]，并將電信號放大，間接檢測目標物。朱文杰等[23]利用多通道串聯式壓電傳感器對金黃色葡萄球菌進行檢測。

6 計算機視覺技術

綜合人工智能、生物學、物理學、圖像處理、計算機等技術，通過圖像采集分析儀器采集生物圖像，通過計算機以及相關程序分析處理圖像。計算機視覺檢測技術操作簡單、成本較低、準確率高、處理速度快、靈敏度高。

7 結論

隨著人們對乳制品安全需求的提高，常規的檢測方法已不能滿足目前社會快速發展的需求，開發方便、快捷、操作簡便，成本相對較低的檢測方法是未來食品安全檢測的發展方向。

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孔祥瑞（1982-），女，本科，研究方向為乳制品檢測化驗。

2017-06-20）