基于蛋白質和DNA的食品過敏原檢測技術的研究進展

丁亮，付琳，吳秀蓮，李夢雪

（南京市質量技術監督局高淳區質量計量檢測所，江蘇南京211300）

基于蛋白質和DNA的食品過敏原檢測技術的研究進展

丁亮，付琳，吳秀蓮，李夢雪

（南京市質量技術監督局高淳區質量計量檢測所，江蘇南京211300）

目前，食品過敏問題已成為全球性的健康問題。在食品加工過程中產生的食品過敏成分或微量過敏原對敏感機體都是巨大的健康威脅。因此，可靠的分析方法是鑒別和檢測食品中過敏成分所必需的。該文綜述了基于蛋白質和脫氧核糖核酸(DNA)的食品過敏原檢測技術的應用及發展，并展望了其未來發展趨勢。

食品過敏原；蛋白質；脫氧核糖核酸；檢測

食品過敏是致敏機體在再次受到食品中同種抗原刺激時引起的不良免疫反應。食品過敏反應通常由免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）介導，主要分為致敏和發敏兩階段。在機體初次受食品中抗原刺激后會產生抗原特異性IgE，并與肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面的Fc受體結合，使機體處于致敏狀態。當機體再次接觸同一食品抗原后，會在肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面通過交聯抗原特異性IgE產生過敏反應，使得大量蛋白水解酶、白三烯或促炎細胞因子釋放，引起過敏癥狀。致敏個體由于過敏原的攝入而產生的臨床癥狀包括蕁麻疹、瘙癢、水腫、支氣管痙攣、鼻炎、嘔吐、腹瀉、痙攣，甚至致命的過敏性休克[1-2]。

目前，食品過敏被世界衛生組織納入五個最重要的公共健康問題之一，特別是在工業國家，有2%成年人和4%～8%幼兒受其影響。由于不同地區飲食習慣的不同，食品過敏的發病率和患病率還在不斷增加。在已確認的可引起過敏反應的160多種食物中，有8種被認為與90%食物過敏有關。這些“主要的食品過敏原”包括牛奶、蛋類、魚、甲殼動物貝類、堅果、小麥、花生和大豆[3-4]。為保護消費者安全及向消費者提供更多信息，多國立法規定食品包裝袋上需要標注過敏原。另一方面，提高現有食品過敏原的檢測分析方法，并制定新的標準化方法，為食品和餐飲業提供適當的工具以及為“食品過敏”消費者提供“無過敏原”食品也是避免食物過敏重要的途徑。本文對基于蛋白質和脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的檢測方法在食品過敏原檢測中的應用進行了介紹，如免疫化學法、蛋白質組學方法、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）等，及對食品過敏原檢測方法的發展進行了探討。

1 食品過敏原成分檢測的靶目標分子

食品過敏原成分檢測主要依賴于過敏原自身或過敏原成分的標記分子。通常有兩類標記分子用于檢測過敏原：過敏原成分中的特征性蛋白和能表征過敏成分的特定的DNA序列。由于蛋白靶標和DNA靶標各有利弊，因此應根據食品自身進行選擇。一般選擇某種靶分子的重要依據在于其在樣品中的豐度，這將影響到檢測方法的靈敏性。蛋白同源性也是重要參考因素，當選擇某種蛋白作為靶分子檢測不同物種中的過敏原時，應選擇保守性較高的同源蛋白。盡管蛋白檢測方法比較常用，但蛋白成分容易受到食品加工和外界變化的影響，如季節和地理的影響；熱加工也會降低目的蛋白溶解度。而DNA分子則具有更好的穩定性，且不受表型變異影響，因此更有助于定量分析及用于對敏感性要求較高的場合。

在DNA靶標中，常用的靶向分子包括單拷貝或多拷貝分子，如線粒體、葉綠體或其他高度重復序列。由于多拷貝分子在樣品中數量較多，其可提高分析敏感性，而單拷貝分子則因恒定的拷貝數而更適合定量分析。DNA靶標的選擇也受公共數據庫中DNA序列可利用度的影響。盡管可能缺少某些過敏成分的DNA序列，但隨著高通量和低成本技術的發展（如下一代測序），越來越多可利用的序列正存儲在公共數據庫，這也有助于依賴DNA的過敏原檢測技術的發展。

2 依賴蛋白質的過敏原檢測技術

2.1 免疫化學法

傳統上，食品過敏原主要用免疫方法檢測，即利用抗體檢測過敏原中的目標蛋白。目前以免疫化學為基礎的食品過敏原檢測方法主要有放射/酶聯過敏原吸附抑制實驗（radio-allergosorbent/enzyme allergosorbent inhibition test，RAST/EAST）法、火箭免疫電泳（rocketimmuno-electrophoresis，RIE）、酶聯免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和斑點免疫印跡（dot immunoblotting）法等。其中，ELISA是食品工業中檢測食品過敏原最常用的方法，其靈敏度好，操作方便[5-6]。ELISA中過敏原與特異性酶標記的抗體結合后，通過檢測酶活性而產生比色反應來對過敏原進行定量或定性分析。目前，已有大量商品化的ELISA試劑盒可檢測或定量復雜食品中的小麥、雞蛋、花生、大豆、牛奶、杏仁、榛子、羽扇豆、芝麻、芥菜和蕎麥等，檢測限達0.1～20 mg/kg[7-9]。

RAST/EAST是一種競爭性IgE結合試驗，即先將與人體特異IgE抗體結合的過敏原固定在固定相，樣品中的過敏原則抑制固相上的過敏原與IgE結合，再通過顯色反應檢測結合的IgE，從而定量樣品中的過敏原[10]。RAST/EAST多用于臨床中食品過敏原診斷，其用于商業中過敏原定量檢測主要受限于對過敏者血清的依賴性及實驗的標準化。RIE則是用含有抗體的凝膠進行檢測，過敏原根據自身的電泳遷移率進行遷移直到抗原-抗體復合物在凝膠中沉淀[11]。盡管RIE已被用于檢測多種食品過敏原，但其未能被廣泛應用的原因在于繁瑣的凝膠制備過程及免疫染色程序。隨后發展的側流免疫層析法和試紙檢測是ELISA試劑盒方法的進階，主要在膜帶上進行，然而其僅能用于蛋白定性檢測[12]。還有其他較少用于食品過敏原檢測的免疫化學方法，如斑點免疫印跡試驗可用于檢測牛奶乳清蛋白、花生、榛子和巴西堅果等[13]。

總體而言，免疫化學方法，特別是ELISA在檢測食品過敏原時，靈敏性好，容易操作。然而，其也存在多種缺陷，如抗體的交叉反應，易產生假陽性；食品中其他成分的干擾；在固體基質的吸附可能破壞過敏原表位等。盡管如此，ELISA仍是食品過敏原鑒別和定量的重要方法。

2.2 蛋白質組學方法

蛋白質組學包括蛋白序列與改造、蛋白功能研究、蛋白間相互作用和定位以及蛋白豐度。由于蛋白質是食品多種特性的生物標記分子，蛋白質組學在食品科學研究中具有重要作用。樣品的蛋白組學分析包括蛋白水平的多步分離和質譜分析。目前有2種蛋白組學分析流程：一是蛋白質先被酶水解后得到多肽，然后進行質譜分子；二是在質譜儀中直接將整個蛋白碎片化，避免了蛋白酶解過程[14]。在這兩種方法中，通過將蛋白質和多肽的質譜實驗數據與蛋白質數據庫的數據進行對比，匹配最佳的蛋白即為目標蛋白。HEICK J等[15]利用液質聯用多元反應監測方法同時鑒別及定量面粉和面包中多種食品過敏物，如花生、核桃、榛子、杏仁、雞蛋和牛奶，檢測限達3～70 mg/kg。基于蛋白質組學的食品過敏原檢測方法克服了免疫學方法中交叉干擾的弊端，可對多種蛋白質和多肽進行測定，且可同時檢測多種過敏原。蛋白質組學可確定過敏原的分子量、測定其翻譯后修飾、鑒別過敏蛋白的新亞型。基于蛋白質組學的過敏原檢測技術提高了食物鏈的安全性。目前該方法的應用需要相對先進的設備和計算基礎設施，有大量數據產生，其應用依賴于高技能人員，這使得成本增加，有點超出大多常規分析的范疇。

3 依賴DNA的過敏原檢測技術

3.1 終點定量PCR和PCR-ELISA

終點定量聚合酶鏈反應PCR（end point quantitative polymerase chain reaction，End-point quantitative PCR）是簡單低成本的DNA擴增方法。其主要的缺點在于需要通過凝膠電泳檢測擴增產物，由于凝膠電泳檢測的靈敏度有限，使得該技術準確性降低。聚合酶鏈反應酶聯免疫吸附測定（PCR-ELISA）中，用生物素或地高辛標記擴增的DNA片段作為抗原，通過與捕獲探針雜交固定于固相捕獲系統，隨后通過酶標抗體實現顯色定量分析。通過這種方式，PCR-ELISA可以用一組通用引物去檢測和區分多個序列/目標，因此對檢測多種致敏成分比較有優勢。然而，這種方法只能算是半定量，因為該量化是在PCR反應結束后進行。HOLZHAUSER T等[16]在比較PCR-ELISA和ELISA檢測榛子效果的研究中，發現兩種方法敏感性類似，但PCR-ELISA具有更好的特異性。

3.2 qPCR

實時定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative PCR，qPCR）可監測樣本擴增的每時每刻各熒光值的連續變化。如今，qPCR已被廣泛用于食品分析，包括過敏原成分分析。與終點定量PCR相比，qPCR具有明顯優勢，如可檢測短片段，不需凝膠電泳檢測等。在食品分析中，qPCR方法主要依賴于兩種檢測化學物質：DNA結合染料和水解探針。前者中最常用的是SYBRGreen染料，后者多為TaqMan探針。qPCR可以潛在的用于定量分析食品過敏成分，但目前大部分方法還是基于絕對定量，其主要依賴于標準曲線。COSTA J等[17]成功地利用qPCR在食品中檢測出杏仁，且通過擴增杏仁中Pru du 5（也叫酸性核糖體蛋白P2）過敏原的編碼序列從其相關產品中鑒別杏仁。INIESTO E等[18]研究了烘焙、高壓和蒸汽滅菌處理對榛子過敏原編碼序列的影響，結果表明，熱處理、烘焙、蒸汽滅菌都可降低榛子DNA檢測能力，這是由于DNA提取率和DNA完整性降低。由于某些食品的組成成分可能抑制PCR反應，其會影響qPCR對過敏成分的定量檢測[19]。在DNA提取和純化之前向食品中加入內標物將有助于提高定量結果的可信度，因為食品成分對DNA提取和純化的影響可通過對內標物的影響估量。

3.3 高分辨熔解分析

高分辨率熔解度分析（high resolution melting analysis，HRM）是通過檢測溫度升高時PCR擴增產物逐漸熔解產生的熒光變化，分析樣品中DNA產物[20]。隨著高分辨率儀器和飽和熒光DNA結合染料的發展，HRM分析已被用于基因分型、表觀遺傳學、食品檢測研究。因特定PCR產物的熔融溫度（Tm）可用于在種屬水平區分食品，HRM分析已被用于食品成分鑒定。COSTA J等[21]利用HRM結合實時PCR通過檢測杏仁中的Pru du 5過敏蛋白編碼基因從加工食品中檢測到微量杏仁。MARTíN-FERNáNDEZ B等[22]利用HRM可將小麥與其他谷物（如大麥、黑麥和燕麥）區分開。加工食品產物中榛子也可被DNA條形碼-HRM定量，檢測限達0.01%[23]。

3.4 連接依賴探針擴增

連接依賴探針擴增（ligation-dependent probe amplification，LPA）是基于兩個熒光標記的寡核苷酸片段探針，與靶序列DNA進行雜交，然后連接擴增，分析產物。僅當兩個寡核苷酸探針分別與靶序列完全互補時，連接酶才能將兩段探針連接成一條完整的核酸單鏈，隨后產生特定大小的擴增產物，通過毛細管電泳鑒別[24]。LPA已用于檢測10種不同的過敏成分[25]。在不同的矩陣測試時，LPA可鑒別單一過敏原，檢測限達5 mg/kg。與內部陽性對照信號相比，8種過敏成分信號的檢測限范圍為5～400基因拷貝數[26]。

3.5 DNA arrays

為進行多重檢測，許多芯片被用于檢測PCR產品，并用于檢測食品中的過敏成分。ROSSIS等[27]使用肽核酸（peptide nucleicacids，PNAs）芯片檢測擴增的花生和榛子DNA。PNAs是結合到互補DNA序列的寡核苷酸類似物，較其同源DNA表現出更高的親和力和特異性[28]。電化學DNA芯片可檢測榛子中兩個不同過敏原的特異性DNA片段，且樣品濃度可在納摩爾水平。WANG W等[29]在含硅的表面開發出一種光學薄膜微陣列方法，可在兩個tetraplex PCR系統中同時檢測8種食物過敏成分，如同時檢測腰果、花生、小麥、大豆、魚、雞、蝦和牛肉，及同時檢測芝麻、燕麥、杏仁、芹菜、榛子、核桃、羽扇豆和芥末[30]。此時，信號可肉眼觀察而不需額外的儀器。從榛子、花生和大豆DNA擴增的地高辛標記的PCR產物，可利用5′-生物素探針雜交檢測，該探針可被鏈霉親和素修飾的數字化視頻光盤（digital video disk，DVD）表面固定，檢測限達1 μg/g[31]。基于5′-SH和3′-生物素標記莖環雙探針的電化學DNA傳感器，也可通過檢測Ara h 1基因的片段來檢測花生是否存在，檢測限為0.35 fmol/L，線性響應范圍10-15～10-10mol/L。DNA傳感器可在未進行PCR擴增的情況下定量檢測花生乳飲料的DNA提取物[32]。

4 結束語

如今，為了保護過敏機體免受過敏原反應的困擾，人們提倡減少接觸任何過敏原的機會。但由于加工食品通常還有各種各樣的成分，包括潛在的過敏原，使得很難完全不接觸過敏原。因此，食品過敏原的檢測是當前食品安全的重要任務。由于依賴蛋白質檢測方法的復用能力及質譜儀器的新發展，蛋白質組學方法正被廣泛替代傳統的免疫化學方法和基于DNA的PCR法。同樣的，多種DNA檢測新技術正蓬勃發展，如HRM、LPA和DNA芯片。除上述幾種方法外，寡合苷酸適體，即結合多種目標物的單鏈或RNA寡核苷酸，也逐步作為抗體的另一選擇應用于生物分析，目前已有多種適體用于食品過敏原的檢測；生物傳感器，特別是新型納米材料，也逐步用于檢測食品過敏原。

在食品中的過敏成分檢測中，為得到可靠的具有可比性的分析結果，還需要驗證及協調各分析方法。同樣地，對于新開發的快速檢測方法，如基于生物傳感器的方法，也需要進行驗證，及評估其真實食品樣品中的適用性。

[1]TOSCA M A,SILVESTRI M,OLCESE R,et al.Allergen-specific IgE to food molecular components and age:From early childhood to adulthood [J].Allergol Immunopathol,2017,45(1):87-92.

[2]GASILOVA N,GIRAULT H H.Bioanalytical methods for food allergy diagnosis,allergen detection and new allergen discovery[J].Bioanalysis, 2015,7(9):1175-1190.

[3]森山逹哉，趙欣.大豆過敏源的多樣性及味噌的低過敏性驗證[J].中國釀造，2015，34（3）：166.

[4]LUBER F,DEMMEL A,HERBERT D,et al.Comparative assessment of DNA-based approaches for the quantification of food allergens[J].Food Chem,2014,160:104-111.

[5]張詩堯，趙元，鮑男，等.大豆球蛋白直接ELISA檢測方法的建立與初步應用[J].大豆科學，2016，35（4）：660-665.

[6]何方洋，于信念，王坤，等.酶聯免疫法與液相色譜-串聯質譜法檢測豬肉中沙丁胺醇[J].中國釀造，2015，34（8）：132-135.

[7]IVENS K O,BAUMERT J L,TAYLOR S L.Commercial milk enzymelinked immunosorbent assay(ELISA)kit reactivities to purified milk proteins and milk-derived ingredients[J].J Food Sci,2016,81(7):T1871-T1878.

[8]KHUDA S E,SHARMA G M,GAINES D,et al.Survey of undeclared egg allergen levels in the most frequently recalled food types(including products bearing precautionary labelling)[J].Food Addit Contam PartA,2016,33(8):1265-1273.

[9]胡驍飛，王耀，鄧瑞廣，等.免疫學技術在食品過敏原檢測中的應用[J].食品科學，2014，35（8）：1-5.

[10]ONYEMELUKWE G C.RAST-specific IgE to egg and milk in Nigerian asthmatic patients[J].Afr J Med Sci,2011,40(1):51-57.

[11]MOEN L H,SLETTEN G B,MILLER I,et al.Rocket immunoelectrophoresis and ELISA as complementary methods for the detection of casein in foods?[J].Food Agr Immunol,2005,16(2):83-90.

[12]ITO K,YAMAMOTO T,OYAMA Y,et al.Food allergen analysis for processed food using a novel extraction method to eliminate harmful reagents for both ELISA and lateral-flow tests[J].Anal Bioanal Chem, 2016,408(22):5973-5984.

[13]BLAIS B W,GAUDREAULT M,PHILLIPPE L M.Multiplex enzyme immunoassay system for the simultaneous detection of multiple allergens in foods[J].Food Control,2003,14(1):43-47.

[14]PILOLLI R,ANGELIS E D,MONACI L.Streamlining the analytical workflow for multiplex MS/MS allergen detection in processed foods [J].Food Chem,2017,221:1747-1753.

[15]HEICK J,FISCHER M,P PPING B.First screening method for the simultaneous detection of seven allergens by liquid chromatography mass spectrometry[J].J Chromatogr A,2011,1218(7):938-943.

[16]HOLZHAUSER T,STEPHAN O,VIETHS S.Detection of potentially allergenic hazelnut(Corylus avellana)residues in food:a comparative study with DNA PCR-ELISA and protein sandwich-ELISA[J].J Agr Food Chem,2002,50(21):5808-5815.

[17]COSTA J,MAFRA I,CARRAPATOSO I,et al.Almond allergens: molecular characterization,detection,and clinical relevance[J].J Agric Food Chem,2012,60(6):1337-1349.

[18]INIESTO E,JIM NEZ A,PRIETO N,et al.Real-time PCR to detect hazelnut allergen coding sequences in processed foods[J].Food Chem, 2013,138(2-3):1976-1981.

[19]KENK M,PANTER S,ENGLER-BLUM G,et al.Sensitive DNA-based allergen detection depends on food matrix and DNA isolation method [J].Eur Food Res Technol,2012,234(2):351-359.

[20]DRUMLB,CICHNAMARKLM.High resolution melting(HRM)analysis of DNA-its role and potential in food analysis[J].Food Chem,2014, 158(9)245-254.

[21]COSTA J,MAFRA I,MBPP O.High resolution melting analysis as a new approach to detect almond DNA encoding for Pru du 5 allergen in foods[J].Food Chem,2012,133(3):1062-1069.

[22]MARTíN-FERNáNDEZB,COSTAJ,DE-LOS-SANTOS-áLVAREZN, et al.High resolution melting analysis as a new approach to discriminate gluten-containing cereals[J].Food Chem,2016,211:383-391.

[23]MADESIS P,GANOPOULOS I,BOSMALI I,et al.Barcode High Resolution Melting analysis for forensic uses in nuts:A case study on allergenic hazelnuts(Corylus avellana)[J].Food Res Int,2013,50(1):351-360.

[24]SCHOUTEN J P,MCELGUNN C J,WAAIJER R,et al.Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification[J].Nucleic Acids Res,2002,30(12):e57.

[25]EHLERT A,DEMMEL A,HUPFER C,et al.Simultaneous detection of DNA from 10 food allergens by ligation-dependent probe amplification [J].Food Addit Contam,2009,26(4):409-418.

[26]MUSTORP S L,DR MTORP S M,HOLCK A L.Multiplex,quantitative,ligation-dependent probe amplification for determination of allergens in food[J].J Agric Food Chem,2011,59(10):5231-5239.

[27]ROSSI S,SCARAVELLI E,GERMINI A.A PNA-array platform for the detection of hidden allergens in foodstuffs[J].Eur Food Res Technolo,2006,223(1):1-6.

[28]EGHOLM M,BUCHARDT O,CHRISTENSEN L,et al.PNA hybridizes to complementaryoligonucleotidesobeyingthe Watson-Crick hydrogenbonding rules[J].Nature,1993,365(6446):566-568.

[29]WANG W,HAN J,WU Y,et al.Simultaneous detection of eight food allergensusingopticalthin-filmbiosensorchips[J].J Agric Food Chem, 2011,59(13):6889-6894.

[30]WANG W,LI Y,ZHAO F,et al.Optical thin-film biochips for multiplex detectionofeightallergensinfood[J].Food Res Int,2011,44(10):3229-3234.

[31]TORTAJADAGENARO L A,SANTIAGOFELIPE S,MORAIS S,et al. Multiplex DNA detection of food allergens on a digital versatile disk[J]. J Agric Food Chem,2012,60(1):36-43.

[32]SUN X,GUAN L,SHAN X,et al.Electrochemical detection of peanut allergen Ara h 1 using a sensitive DNA biosensor based on stem-loop probe[J].J Agric Food Chem,2012,60(44):10979-10984.

Recent advance of detection technology of food allergens based on protein and DNA

DING Liang,FU Lin,WU Xiulian,LI Mengxue
(Gaochun Testing Institute of Quality and Metrology,Nanjing Bureau of Quality and Technical Supervision,Nanjing 211300,China)

At present,food allergies have become global health concern.The food allergenic ingredients or micro-allergens produced during food processing were a huge health threat on sensitive individuals.Therefore,the reliable analytical methods are necessary to identify and detect allergenic ingredients in food.The application and development of food allergen detection technology based on protein and deoxyribonucleic acid(DNA)were summarized,and the future development trend was prospected.

food allergens;protein;deoxyribonucleic acid;detection

TS207.3

0254-5071（2017）07-0157-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.034

2017-05-10

丁亮（1988-），男，助理工程師，本科，研究方向為食品檢測。