室內混合藻種荒漠藻結皮培養條件優化研究

景麗百合，劉左軍，徐 文，楊利云，藍雯琳(蘭州理工大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州730050)

室內混合藻種荒漠藻結皮培養條件優化研究

景麗百合，劉左軍，徐 文，楊利云，藍雯琳

(蘭州理工大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州730050)

荒漠；藻結皮；土壤水分；具鞘微鞘藻；爪哇偽枝藻

為了探索促進荒漠藻結皮形成的最優條件，以民勤地區優勢藻具鞘微鞘藻和爪哇偽枝藻為材料，通過室內控制試驗，研究了混合藻比例、土壤含水量和接種量對藻結皮培植與發育的影響。結果表明：混合藻種荒漠藻結皮中藻類生物量隨接種量和土壤含水量的增加而增加，一定比例的爪哇偽枝藻可顯著地促進藻類生物量的積累；混合藻種荒漠藻結皮中藻類生物量積累的最優條件是混合藻比例為8∶2(具鞘微鞘藻∶爪哇偽枝藻)、土壤含水量為10%、接種量為10 μg/cm2(以葉綠素a含量計)。

1 研究背景

土地荒漠化是當前全球性的重要環境問題之一。我國荒漠化土地面積約占國土陸地面積的1/3，嚴重影響了農牧業生產和生態環境的可持續發展[1-2]?；哪孱愖鳛橄蠕h拓殖植物，能夠在干旱、營養匱乏、高溫、大風、強紫外線輻射等極端惡劣環境下生長、繁殖，通過自身的活動影響并改變環境，具有極為重要且不可替代的生態學意義[3-5]。土壤結皮是指土壤表面由苔蘚、地衣、藻類、細菌等生物組分與其下很薄的土壤共同形成的一個復合的生物土壤層。在廣大的干旱沙漠地區，隨著流動沙丘的逐步固定，地表常伴隨出現大量的結皮層，這些結皮層有效地阻止了流沙的移動，同時也對以后的植被演替進程起到了積極的作用[6-9]。這種結皮可與表層土壤牢固地結合在一起，其主要組成部分是荒漠藻，特別是藍藻[10]。大量報道表明，泌糖絲狀藍藻是這些生物結皮中的優勢種[11]，其中微鞘藻屬(Microcoleus)和偽枝藻屬(Scytonema)無論在垂直分布還是在生態分布上都很廣泛。具鞘微鞘藻(M.vaginatusGom.)和爪哇偽枝藻(S.javanicumBornetFlah)是生物結皮的先鋒拓殖優勢物種，對于生物結皮的形成和發育具有十分重要的作用。

盡管荒漠藻是荒漠生境的先鋒拓殖植物，但是沙丘表面自然藻結皮的形成需要若干年才能完成。為了在流沙表面快速形成藻結皮來治理荒漠化，需要人為地接入適量的荒漠藻[5]。影響藻結皮形成、發育的因素有很多，包括種類組成及其比例、生物量、有機質、土壤理化性質及氣候等[12]。在以往的研究中通常是以單一優勢藻種為試驗材料，對于具鞘微鞘藻和爪哇偽枝藻這兩種優勢藻的不同比例構成對藻結皮形成和藻類生物量積累的影響并沒有深入研究。本研究利用從民勤荒漠藻結皮中純化、分離的這兩種主要的優勢藻類，通過實驗室模擬自然生境試驗，對混合藻比例構成、土壤含水量和接種量3個因素進行優化，旨在在最優條件下讓活體藻在流沙上迅速進行生物量的積累和荒漠藻結皮的形成，為下一步將藻類廣泛應用于荒漠地區植被的恢復與重建過程提供理論依據和試驗數據，這對于接種荒漠藻固沙技術的應用具有積極的意義。

2 研究材料與方法

2.1 樣區概況

甘肅省民勤綜合治沙試驗站研究區位于甘肅河西走廊東北側，石羊河下游，地處騰格里沙漠西緣，地理位置101°59′～104°12′E、38°08′～39°26′N[13]，屬于典型的干旱荒漠氣候。年均氣溫7.7 ℃，極端最高氣溫41.0 ℃(1999年7月22日)，極端最低氣溫-30.8 ℃(1991年12月27日)，1960—2005年年平均降水量115.9 mm，年潛在蒸發量2 452.7 mm，干燥度5.85。年平均風速為2.4 m/s，多年平均風速≥17 m/s的大風日數為27.4 d，沙塵暴日數37.1 d。土壤為風沙土，pH值為7.8～8.5。試驗樣地周圍地勢平坦，流動沙丘、固定沙丘、半固定沙丘等為主要的地貌類型。

2.2 研究材料

研究中荒漠藻結皮土樣(2015年4月)采自民勤綜合治沙試驗站研究區治理3年的固定沙丘(102°58′29.04″E，38°36′34.44″N)表層(0～2 cm)。土樣經研磨、過篩(孔徑0.25 mm)后，稱取10 g放在盛有150 mL的BG11液體培養基的250 mL三角瓶中(已滅菌)，震蕩24 h，制得均勻的土懸液，然后置于溫度(25±5)℃、光照度1 000～2 000 lx、光周期為16 h/8 h(光/暗)的光照培養架上進行培養。待培養20 d后，將生長出的藻類用小鑷子夾出制片，在數碼顯微鏡下觀察，并將各種藻類進行分離、純化。將純化后的具鞘微鞘藻與爪哇偽枝藻分別采用BG11培養基與BG110培養基在室溫下通氣擴大培養，為后續試驗提供充足藻種。

2.3 人工荒漠藻結皮的培養

先將土樣(采自民勤綜合治沙試驗站研究區治理3年的固定沙丘)平鋪(厚度<1 cm)在烘箱中，調節溫度為(95±5)℃，烘4 h以上，再將滅菌后的土樣冷卻，分裝在16 cm×10 cm的塑料盒中(每盒0.8 kg土)，然后在無菌條件下將具鞘微鞘藻和爪哇偽枝藻的藻培養物以不同比例(按鮮質量計)充分混勻，最后將不同比例的混合藻種均勻地噴灑在塑料盒中的土樣表面。每個處理均設5個平行。將接種后的塑料盒置于(25±5)℃、1 000～2 000 lx、光周期16 h/8 h(光/暗)的光照培養架上進行結皮培養。培養期間，于每天上午9：00將接種過的塑料盒放在天平上，使用微噴補足試驗需水量。自接種后每隔7 d補充一次BG11營養液(方法同補水一致)，補充營養液當天不再補水。

2.4 不同因子的梯度設置

在實驗室模擬生境中，主要的生態因子有溫度、光照、水分、接種量、混合藻比例和土壤類型等。本試驗選取混合藻比例、土壤含水量、接種量3個因子研究其對人工荒漠藻結皮形成的影響。混合藻種的搭配比例(具鞘微鞘藻∶爪哇偽枝藻，按鮮質量計)為10∶0(CK)、9∶1、8∶2、7∶3；土壤含水量設為0(CK)、5%、10%、15%、20%；接種量(以葉綠素a含量計)設為0(CK)、5、10、20、40 μg/cm2。在研究每個因子時，均固定其他因子，每個因子重復5次。

2.5 結皮采樣與試驗指標的測定

從各因子試驗的當天開始，每隔2 d采集正方形結皮小塊4 cm2，小心去除結皮底層過多的沙粒，將結皮樣品放入預先準備好的離心管中，加入95%乙醇5 mL震蕩，在室溫暗環境放置并過夜，8 000 rpm/min離心5 min，取上清，定容至10 mL，于波長665、649 nm處測量吸光度值OD665、OD649，然后計算1 cm2的結皮樣品所含葉綠素a的含量(μg/cm2)，公式為

葉綠素a含量

試驗數據的統計分析利用SPSS 16.0軟件進行，采用Duncan法進行差異顯著性多重比較。利用Excel 2003進行數據計算和圖形制作。

3 結果與分析

3.1 混合藻不同比例構成對荒漠藻結皮中藻類生物量的影響

由圖1和觀測可知，接種后3 d，荒漠藻結皮中藻類生物量迅速下降；接種后6 d，藻類生物量開始增加，且混合藻比例為7∶3、8∶2和9∶1的處理組形成肉眼可見結皮；接種后9 d，荒漠藻生物量迅速增長，出現第一個峰值，各處理組均形成肉眼可見結皮；在接種后21 d出現第二個峰值，藻體整體生物量有明顯增加，結皮增厚，荒漠藻生物量的積累隨時間的推移呈現遞增的趨勢，并逐漸趨于穩定；在接種后30 d藻體生物量有所下降。用SPSS 16.0軟件對藻類生物量進行差異顯著性分析發現，接種后3～6 d的藻類生物量與21 d之后的藻類生物量水平均有顯著差異(P<0.05)。這表明，在接種后荒漠藻對新環境不能迅速適應，表現為部分藻體死亡；接種6 d后，藻類逐漸適應了新的環境，并開始增殖，且一定比例的爪哇偽枝藻可以加快荒漠藻結皮的形成速度；9 d后，隨著藻體基數的增大，藻體進入對數生長期而迅速增長，21 d后，藻體的整體生物量水平已基本穩定；接種后30 d，藻類經過一段時間的生長后，部分藻體衰亡，致使荒漠藻結皮中藻類生物量下降。

圖1 不同混合藻比例處理下荒漠藻生物量的變化

注：初始接種量為10 μg/cm2，土樣含水量為10%，不同小寫字母表示不同處理間在0.05水平上差異顯著。

對不同處理下的荒漠藻生物量進行方差檢驗[14]，結果表明，不同混合藻比例處理對荒漠藻結皮的藻類生物量影響顯著(F=6.757，P<0.05)。由測定結果和圖1可知，荒漠藻生物量最小值(2.382±0.19)μg/cm2出現在接種后3 d的CK處理組，最大值(14.648±0.31)μg/cm2出現在接種后21 d的8∶2處理組。由表1可知，8∶2處理組與7∶3、10∶0處理組的藻類生物量有顯著差異，但與9∶1處理組無顯著差異,各處理組荒漠藻生物量的大小關系為8∶2>9∶1>7∶3>10∶0。這說明，與單一藻種相比，一定比例的爪哇偽枝藻能夠促進荒漠藻結皮中藻類生物量的積累和荒漠藻結皮的快速形成，具鞘微鞘藻與爪哇偽枝藻比例為8∶2時最有利于荒漠藻結皮的形成和藻類生物量的積累。

表1 不同混合藻比例對荒漠藻生物量的影響

3.2 土壤含水量對混合藻種荒漠藻結皮中藻生物量的影響

由圖2和觀測可知，荒漠藻生物量隨土壤含水量的增加而增加，且荒漠藻生物量的積累隨時間的推移呈現遞增的趨勢。在接種9 d后，不同土壤含水量處理組均形成肉眼可見結皮，18 d后，混合藻種荒漠藻結皮厚度明顯增加，且藻體整體的生物量水平逐漸趨于穩定。

圖2 不同土壤含水量對荒漠藻生物量的影響

注：初始接種量為10 μg/cm2，具鞘微鞘藻與爪哇偽枝藻比例為8∶2，不同小寫字母表示不同處理間在0.05水平上差異顯著。

方差檢驗結果表明，不同土壤含水量對混合藻種荒漠藻結皮中藻類生物量影響顯著(F=9.787，P<0.05)。由測定結果和圖2可知，藻類生物量最小值(1.039±0.17)μg/cm2出現在接種后15 d的CK處理組，最大值(25.942±0.24)μg/cm2出現在接種后24 d的15%處理組。由表2可知,土壤含水量10%、15%與20%處理組的藻類生物量顯著高于CK與5%處理組，土壤含水量5%、10%、15%、20%處理組的藻類生物量顯著高于CK處理組，土壤含水量15%處理組的藻類生物量最高，但與10%、20%處理組差異不顯著。這說明，在混合藻種荒漠藻結皮形成過程中，藻類生物量隨土壤含水量增高而增大，且高于10%時能夠顯著地增加荒漠藻的生物量，考慮到荒漠地區水分供給量不足，故10%為最適土壤含水量。

表2 不同含水量對混合藻種荒漠藻結皮中生物量的影響

3.3 混合藻種接種量對荒漠藻結皮中藻類生物量的影響

由圖3和觀測可知，混合藻種荒漠藻結皮中藻類生物量隨接種量的增加而增加，且藻類生物量的積累隨時間的推移呈現遞增的趨勢。接種后9 d，荒漠藻生物量迅速增長，出現第一個峰值，且接種量為10、20和40 μg/cm2的處理組均形成肉眼可見結皮；在接種后18 d出現第二個峰值，接種后24、27 d藻體整體的生物量水平逐漸趨于穩定，接種后30 d藻體生物量有所下降。

圖3 不同接種量處理對荒漠藻生物量的影響

注:土樣含水量為10%，具鞘微鞘藻與爪哇偽枝藻比例為8∶2，不同小寫字母表示不同處理間在0.05水平差異顯著。

方差檢驗結果表明，不同接種量處理對荒漠藻結皮的藻類生物量影響顯著(F=3.092，P<0.05)。由表3可知，A(CK)與B、C、D及E處理間均有顯著差異，B與D、E處理間也存在顯著差異， 各處理組荒漠藻生物量的大小為E>D>C>B>A(CK)。由測定結果和圖3可知，荒漠藻生物量最大值(28.37±0.23)μg/cm2出現在接種后27 d的E處理組，最小值(0.75±0.047)μg/cm2出現在接種后3 d的A(CK)處理組。 這說明， 人工增施荒漠藻有利于其生物量的迅速積累，且荒漠藻生物量隨接種量增大而增大。當初始接種量為10 μg/cm2以上時各處理下荒漠藻生物量無顯著差異，并在接種一周后形成肉眼可見的荒漠藻結皮。接種量為20和40 μg/cm2處理下藻類生物量均值均低于初始接種量，故最適初始接種量為10 μg/cm2。

表3 混合藻種不同接種量處理對荒漠藻類生物量的影響

4 討 論

4.1 混合藻比例構成對荒漠藻結皮形成的影響

藻類的組成及其比例是影響藻結皮形成和發育的重要因素之一。鄭云普等[12]認為，接入的具鞘微鞘藻中添加適當比例的其他藻類(如眼點偽枝藻、席藻、念珠藻和綠藻等)，能夠產生互惠互利的生態效應，在一定程度上能增加具鞘微鞘藻的生長、繁殖速度。本研究通過對混合藻種的研究發現，在其他因子均固定時，樣品中的藻類生物量基本上隨著具鞘微鞘藻比例的升高而增加，但僅采用具鞘微鞘藻接種時藻類生物量反而減少，一定比例的爪哇偽枝藻能夠加快荒漠藻結皮的形成速度，當具鞘微鞘藻與爪哇偽枝藻比例為8∶2時，藻類生物量的積累量達最高。這是因為，具鞘微鞘藻是一種常與其他藻類混生的物種[15]，它們之間可能存在著某種共生關系[16]。在接種的具鞘微鞘藻中加入適當比例的爪哇偽枝藻，能夠促進藻類增殖和藻結皮的形成，但其相互作用及混合藻種荒漠藻結皮的膠結機理還有待于今后進一步深入研究。

4.2 土壤含水量對混合藻種荒漠藻結皮形成的影響

干旱或水分的極度短缺是荒漠地區最為顯著的生態環境特征,也是限制沙漠生物生長的重要因子。本研究結果表明，在裸沙表面含水量很低時(<5%)，不能有效地形成藻類結皮，藻類生物量也很低；隨著土壤濕度的增加，藻類生物量顯著增加，當土壤含水量大于10%時，荒漠藻量顯著增加。這與黃文福、張丙昌等[17-18]對單一藻種的研究結果是一致的。但當土壤含水量大于5%時，混合藻種在裸沙表面形成肉眼可見結皮，這不同于黃文福等[17]對單一藻種的研究結果，原因是：爪哇偽枝藻對干旱的適應機理在細胞形態結構方面表現為，細胞和藻絲常以聚集、成堆的方式存在，細胞外有黏膠層、膠鞘和較厚的細胞壁，膠被中蛋白質、多糖和孢粉素等物質呈精致的排列[19]，且細胞整體結構高度穩定，細胞結構中具發色團和折射顆粒等[20]，與具鞘微鞘藻相比爪哇偽枝藻在干旱脅迫下具有更強的抗逆性。因此，在土壤含水量很低的條件下，混合藻種相比于單一藻種更容易形成荒漠藻結皮。

4.3 混合藻種接種量對荒漠藻結皮形成的影響

當裸沙表面的藻類生物量達到一定數量的時候，才能形成肉眼可見的藻類結皮，藻類生物量的積累隨接種量的增加而明顯增加。鄭云普、黃文福、謝作明等對單一藻種在荒漠藻結皮形成過程中的作用[12]、不同培養條件對單一藻種荒漠藻結皮形成[17]及對其生物量的影響[21]做過大量研究。本研究以混合藻為試驗對象，深入研究了不同因子對混合藻種荒漠藻結皮的形成和藻類生物量的影響，結果表明：裸沙表面不人為接種藻類時，不形成荒漠結皮，并且藻類生物量極低，當接種量大于10 μg/cm2時，接種一周后形成肉眼可見的結皮，且藻類生物量積累迅速。這與文獻[12,17]的研究結果是基本一致的。但當混合藻種接種量大于20 μg/cm2時，隨著接種量的增加，藻類生物量的積累速率下降。分析其原因可能是：①隨著藻體密度的增加，藻體之間相互遮擋光源的可能性加大，能夠照射到細胞的有效光強下降，藻細胞的光合作用降低，從而導致藻體生物量增殖速率下降[21]；②初期裸沙表面營養成分低，不足以提供大量藻體生長所必需的營養物質，隨著藻體的生長，營養成分逐漸耗盡，便抑制了藻體的增殖，部分藻體死亡，使得藻體生物量的積累速率下降，藻體整體生物量趨于穩定；③具鞘微鞘藻與爪哇偽枝藻在藻體密度較小時生長相互促進，在藻體密度較大時，生長過程中由于空間和營養物質的限制，可能會發生競爭或產生某種物質抑制對方的生長，具體機理還有待于深入研究。

5 結 論

本研究情況下，促進混合藻種荒漠結皮形成的有利條件是：①接種量為10 μg/cm2(以葉綠素a含量計)；②土壤含水量為10%；③混合藻比例構成為8∶2(具鞘微鞘藻∶爪哇偽枝藻)。

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(責任編輯 徐素霞)

甘肅省科技支撐計劃項目(1011FKCA108)；中國石油天然氣股份有限公司科學研究與技術開發項目(2014D-4610-0501)

S154.3；S288

A

1000-0941(2017)01-0041-05

景麗百合(1991—)，女，甘肅酒泉市人，碩士研究生，主要從事環境修復方面的研究；通信作者劉左軍(1957—)，男，陜西三原縣人，教授，博士，主要從事生態工程方面的研究。

2015-12-17