叢臺酒大曲中高產淀粉酶細菌的分離和鑒定

王鑫昕，耿霄，吳子龍，王磊

（邯鄲學院生命科學與工程學院，河北邯鄲056000）

叢臺酒大曲中高產淀粉酶細菌的分離和鑒定

王鑫昕，耿霄，吳子龍，王磊

（邯鄲學院生命科學與工程學院，河北邯鄲056000）

為從叢臺酒中溫大曲中分離高產淀粉酶的菌株，通過透明圈法和淀粉酶活力測定分別進行了初篩和復篩，并通過生理生化性能鑒定確定高產淀粉酶細菌的分類。經篩選得到的高產淀粉酶細菌C3，其淀粉酶活力為63.1U，比原廠濃香型大曲提高了44.4%。經鑒定，C3為革蘭氏陽性芽孢桿菌，其菌落為黃褐色，表面無光澤、不透明且邊緣整齊，有不規則突起。對叢臺酒高產淀粉酶細菌的分離，將為酒廠提高大曲質量和出酒率提供菌種和依據。

大曲；淀粉酶；細菌；分離；鑒定

在釀造過程中加入酒曲是我國白酒釀造的顯著特點[1]。大曲是釀酒微生物和酶的載體，其內部微生物種類十分復雜，主要包括三大類即霉菌、細菌和酵母菌[2]，這些菌起到利用原料產香、產酸、產酒的作用，影響著白酒的產量，賦予了白酒不同的風味和口感，因而有“曲是酒之骨”之說。白酒大曲中的微生物，傳統的方法是從自然界自然接種而來，在近代微生物學發展后，可由人工選育接種。大曲微生物的人工加入能夠增加酒的產量或豐富酒的風味，因此人工選育微生物可以讓白酒生產按照工藝設定目標進行。近年來，有關白酒大曲微生物的研究日益增多，主要集中在對酒曲微生物的種類、數量及其與酒曲理化性質關系的研究[3-4]，以及對酒曲中優良菌株的選育等方面[5-7]。有關叢臺酒中細菌的研究在本文之前未見報道。本研究以叢臺酒中溫大曲作為研究對象，首次對成熟曲中高產淀粉酶的細菌進行分離并初步鑒定，以備為后續大曲液化力、糖化力的提高及發酵力等其他指標的平衡關系的研究提供菌種，為大曲的發酵培養工藝控制提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

河北省邯鄲市叢臺酒業提供的成熟中溫大曲。

1.2 培養基

淀粉培養基：10 g蛋白胨，5 g NaCl，5 g牛肉膏，2 g可溶性淀粉，20 g瓊脂，加水至1 L，121℃滅菌20m in。

種子培養基：10 g蛋白胨，5 g NaCl，3 g牛肉膏，2 g可溶性淀粉，加水定容至1 L，121℃滅菌20m in。

產酶發酵培養基：80 g玉米粉，5 g蛋白胨，40 g豆餅粉，5 g K2HPO4，3 g(NH4)2SO4，5 g Na2HPO4，加水定容至1 L，121℃滅菌20m in。

檸檬酸鈉培養基：2 g檸檬酸鈉，5 g NaCl，0.1 g Mg-SO4·7H2O，1 g(NH4)2HPO4，1 g K2HPO4·3H2O，溴百里酚藍水溶液100m L，20 g瓊脂，121℃滅菌20m in。

肉湯培養基：1 g蛋白胨，0.5 g NaCl，0.3 g牛肉膏，2 g瓊脂，加水定容至100m L，121℃滅菌30m in。

1.3 產淀粉酶細菌的初篩和復篩

無菌環境中，稱取曲皮（距大曲表面1 cm處）、曲心（距曲塊中心1 cm處）各5 g，研磨后加入10m L無菌水中振蕩1m in，經過濾后取濾液1m L加入到9m L無菌水中，振蕩混勻，得到10-1菌懸液。經逐級稀釋后，依次得到10-2、10-3……10-6的梯度稀釋液。

取10-5、10-6稀釋菌懸液各100μL涂布在淀粉培養基上，并置于30℃倒置培養2 d。之后，對每個生長出單菌落的培養皿進行碘熏，并將有明顯透明圈的單菌落挑出，接種到淀粉培養基斜面，30℃培養48 h。觀察菌落形態特征，4℃冰箱保存備用。

從斜面培養基挑取單菌落，接種到液體種子培養基中，在30℃搖床150 r/m in振蕩培養24 h，然后將種子液以10%的接種量接種于產酶發酵培養基上，30℃、150 r/m in振蕩培養24 h。取培養液測定淀粉酶活力，得到其中酶活力最大的菌株為高產淀粉酶菌株。

1.4 產淀粉酶細菌的生理生化性能鑒定

檸檬酸鹽利用實驗：用接種針挑取復篩的高產淀粉酶菌株，穿刺接種在檸檬酸鹽培養基試管斜面上，另取一相同檸檬酸鹽培養基試管斜面不接種，作對照組。將2支試管以30℃培養48 h，觀察菌落形態。

細菌耐熱性：將篩選出來的細菌接種到種子培養基中，30℃培養24 h，再將菌液放入60℃水浴中30m in，最后取1m L菌液涂布在淀粉培養基平板上，30℃培養24 h。另取未經水浴的1m L菌液涂布于同樣的淀粉培養基平板上，作為對照。

過氧化氫酶產生實驗：將復篩的高產淀粉酶菌株接種在肉湯培養基平皿中，30℃培養24 h。將H2O2溶液滴加到平皿上生長出的菌落上，觀察記錄結果。

1.5 淀粉酶活力的測定

取1.3中產酶發酵培養基培養24 h后的5m L培養液，5000 r/m in離心10m in，取上清液作為測定淀粉酶活力的酶液。5m L淀粉溶液以40℃水浴10m in，再加入0.5m L已經稀釋10倍的酶液，反應5m in后，加入5m L H2SO4溶液終止反應。

另取5m L工作碘液于新試管中，然后取0.5m L上述反應液混合進行顯色反應。用620 nm波長可見光分光光度計測定吸光度值，并計算各試管的酶活力。以0.5m L水代替0.5m L反應液為空白，以不加酶液(加相同的水)的管為對照。

定義酶活力單位：40℃、5 m in內水解1 mg淀粉(0.5%淀粉)的酶量定義為1個活力單位（U）。

酶活力計算公式：

其中，Rt表示對照組吸光度值，R代表反應液的吸光度值，D為酶液的稀釋倍數，實驗過程要調節D值使(Rt-R)/Rt在0.2～0.7。從中篩選出吸光值最小，即酶活力最強的菌株。

2 結果與分析

2.1 大曲中產淀粉酶菌株的初篩結果

按照1.3的方法，叢臺酒中溫大曲樣品經培養得到單菌落，在進行碘熏后對有透明圈的單菌落進行形態觀察，共得到主要7種菌落形態，見圖1和表1。

2.2 大曲中產淀粉酶菌株的復篩結果

按照1.5的方法對初篩的7株產透明圈菌株測淀粉酶活力，所得的結果見表2。可見B3、C1、C3的淀粉酶活力較強，其中B3和C1分別為41.3U和46.6U，與原廠濃香型大曲的淀粉酶活力相近。以C3菌株產淀粉酶活力為最高，為63.1 U，與原廠濃香型大曲的淀粉酶活力（表2中對照）相比，提高了44.4%。

2.3 對高產淀粉酶細菌的生理生化性能鑒定

2.3.1 革蘭氏染色實驗

圖2為C3菌的革蘭氏染色結果，從顯微鏡下可見菌細胞形態為桿狀，染色結果顯示紫色，因此確定C3為革蘭氏陽性桿菌。

2.3.2 檸檬酸鹽利用實驗

圖1 具有透明圈的單菌落

表1 菌落形態特征

表2 淀粉酶活力測定結果

圖2 革蘭氏染色結果

接種了C3菌培養24 h后，檸檬酸鹽實驗培養基的顏色，由對照組的草綠色轉變成藍色，見圖3。這說明C3菌可利用檸檬酸鈉。根據檸檬酸鈉可以被大多數芽孢桿菌利用這一性質，繼續進行如下實驗。

2.3.3 測定過氧化氫酶產生實驗

滴加過氧化氫到培養C3的培養基上，發現培養基表面會不時的產生氣泡，說明C3菌能夠產生分解過氧化氫的酶。由于芽孢桿菌都能產生過氧化氫酶，因此可判斷C3菌可能為芽孢桿菌。

圖3 檸檬酸鹽利用實驗結果

2.3.4 耐熱性實驗

C3菌經60℃水浴30m in后，得到與對照相同的結果：發現涂布的平板上布滿細菌，可見的單菌落在300個以上。因此C3菌是耐熱的芽孢桿菌。

3 結論

經過對叢臺酒成熟中溫大曲中的細菌進行初篩和復篩，篩選出C3菌為高產淀粉酶的細菌，其淀粉酶活力為63.1 U，與原廠濃香型大曲的相比，其淀粉酶活力提高了44.4%。C3為革蘭氏陽性芽孢桿菌，其菌落為黃褐色，表面無光澤、不透明且邊緣整齊，有不規則突起。

[1]侯小歌,杜小波,李學思,等.中溫大曲中乳酸菌的分離鑒定及產酸特性[J].釀酒科技,2010(9)：17-24.

[2]張中義,暢曉霞,鐘其頂.酒曲酶系、菌系特征及釀造過程中微生物動態變化[J].釀酒,2008,35(5)：24-29.

[3]唐玉明,張正英,任道群,等.曲外層和曲心的微生物數量生化性能及釀造效果研究[J].釀酒科技,1995(3)：73-76.

[4]姚萬春,唐玉明,張正英,等.瀘型陳曲貯存期微生物酶類的變化及釀造效果[J].釀酒科技,1996(4)：19-20.

[5]唐玉明,廖建民,姚萬春,等.濃香型曲藥功能菌選育及利用研究[J].釀酒科技,1998(3)：22-24.

[6]廖建民,唐玉明,姚萬春,等.濃香型曲藥微生物的分離與篩選研究簡報[J].釀酒,2000,136(1)：36-38.

[7]廖建民,任道瓊,唐玉明,等.濃香型曲藥中酵母菌的初步分類和選育[J].釀酒,2000,137(2)：47-48.

Isolation and Identification of a Bacteria Strain with High Yield of Amylase from Congtai Daqu

WANG Xinxin,GENG Xiao,WU Zilong and WANG Lei
(Department of Life Science and Engineering,Handan Colleage,Handan,Hebei056000,China)

In this study,transparent circle method and amylase activity measurement were adopted respectively for primary screening and secondary screening of bacteria strains with high yield of amylase from Congtai Daqu.As a result,strain C3 with high yield of amylase was obtained and its amylase activity reached up to 63.1 U,44.4%higher than that of the original Daqu.Through physiological and physiochemical identification,strain C3 was identified as gram-positive Bacillus and its single colony was yellowish-brown with matt surface,neat edge and irregular convex.This study provided reference for obtaining useful bacteria strains in distilleries to improve Daqu quality and liquor yield.

Daqu;amylase;bacteria;isolation;identification

Q93-3；TS261.1；TS262.3；TQ920

A

1001-9286（2017）01-0030-03

10.13746/j.njkj.2016325

邯鄲市科學技術研究與發展計劃項目(1523103064-5)。

2016-11-03

王鑫昕(1982-)，女，河北邯鄲人，講師，主要從事生化和發酵生產研究。

優先數字出版時間：2016-12-02；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20161202.1106.002.html。