自選乳酸菌發酵核桃乳香氣物質研究

薛純 李艷 李佳 牟德華*

1（河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊050018）2（河北省發酵工程技術研究中心，河北石家莊050018）

·基礎研究·

自選乳酸菌發酵核桃乳香氣物質研究

薛純1*李艷1，2李佳1牟德華1**

1（河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊050018）2（河北省發酵工程技術研究中心，河北石家莊050018）

核桃屬堅果類食物，營養價值極高。核桃仁含有豐富的脂肪、蛋白質、礦物質、不飽和脂肪酸和維生素等營養物質，是天然的保健食品。核桃仁具有預防高血脂、高血壓、增強記憶力、延年益壽的功能。乳酸菌是與人類生活密切相關的一類微生物，是人體和動物腸道的優勢菌群，具有調節腸道平衡、降低膽固醇、抑制腸道腐敗菌生長及減少腸道腐敗產物的功能。乳酸菌發酵核桃乳除可保留核桃的營養功能成分外，還可賦予核桃乳特有的乳酸及其他乳酸菌代謝產物，使發酵核桃乳產生清香、醇香和脂香，且乳酸菌發酵產生的多種蛋白水解酶可使蛋白水解為小分子肽和氨基酸，有利于人體的消化吸收。目前國內發酵型核桃乳的研究和產品很少，主要原因是核桃乳內可發酵性糖含量較低，缺少合適的專用菌種，且產品風味存在明顯的缺陷。

本研究采用自選乳酸菌對核桃乳進行發酵，利用頂空固相微萃取和氣相色譜質譜（HP-SPME/ GC-MS）聯用技術分析檢測核桃乳發酵和后熟過程中的香氣物質變化，全面評估發酵核桃乳的香氣成分，為自選乳酸菌的工業化應用和高品質發酵型核桃乳的產品開發奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃仁，河北養元智匯飲品股份有限公司。

乳酸菌，植物乳桿菌亞種（Lactobacillus plantarum subsp.）KDLLL1-1、意大利腸球菌（Enterococcus italicus）KDLLJ3-1，由本研究室分別從羊羔美酒大曲和開菲爾粒中分離篩選得到，經過重復序列聚合酶鏈式反應（repetitive sequence-based polymerase chain reaction，Rep-PCR）技術和16SrDNA序列分析的分子鑒定，并將所得基因序列的測序結果在GenBank數據庫進行登陸，經過BLAST相似性比對確定屬種，登錄號分別為KC454277和KC454280。

氯化鈉，分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

7890A氣相色譜-5975質譜，HP-5色譜柱( 30.0 μm×0.25 μmm，0.25 μm)，美國Agilent公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市英峪予華儀器廠；20 mL頂空萃取瓶，石家莊大晉科技有限公司；手動固相微萃取手柄、磁子及二乙烯基苯-羧乙基-聚二甲基硅氧烷的萃取頭，美國Sigma公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發酵核桃乳的制備

去除核桃仁中的癟仁、壞仁和雜質等，用0.5%NaOH水溶液浸泡，并煮沸5 min，棄去堿液，用高壓水槍沖去核桃仁表面的種皮，再用清水洗滌去除核桃仁表面殘留的堿液，直至洗滌水pH值呈中性。按照料液比1∶7（g∶mL）用50℃溫水磨漿12 min，將磨好的核桃漿液用紗布過濾，棄去濾渣。濾液用均質機在20 MPa下均質2次，85℃滅菌15 min，自然冷卻至室溫。接種經活化和馴化后的乳酸菌，接種量為108cfu/mL，植物乳桿菌亞種和意大利腸球菌的比例為2∶1，控溫40℃，發酵12 h，降溫至4℃后熟21 d，分別檢測發酵前和發酵2 h、6 h、12 h以及后熟1 d、7 d、14 d、21 d的香氣物質。

1.3.2 核桃乳中香氣物質的檢測

1.3.2.1 香氣物質萃取

采用頂空固相微萃取（HP-SPME）法提取核桃乳中的香氣物質。取5 mL試樣，加入2 g干燥的氯化鈉，放于20 mL頂空萃取瓶中，加磁力攪拌轉子，蓋密封墊和鋁蓋，用壓桿鉗密封，用2 cm-50/ 30 μm DVB/Carboxen/PDMS萃取頭針管穿透樣品瓶隔墊，調整插入長度，放入50℃攪拌水浴鍋中，平衡15 min，推手柄使纖維頭伸出針管萃取吸附30 min，取出手柄直接進樣，250℃下解吸3 min。

1.3.2.2 香氣物質的測定

采用氣相色譜質譜（GC-MS）聯用檢測核桃乳中香氣物質。氣相色譜條件：載氣為氦氣（99.999%），流速1.0 mL/min；升溫程序為40℃保持12 min，以3℃/min升至108℃保持2 min，再以5℃/min升至250℃保持5 min，進樣口溫度250℃。質譜條件：離子源溫度230℃；四級桿溫度150℃；電離方式為EI，電子能量70 ev；掃描質量范圍為45 amu～550 amu。

1.3.2.3 香氣物質的定性與定量

核桃乳中的香氣物質定性采用NIST質譜數據庫，并通過檢索和查閱相關文獻作為參考。香氣物質的定量采用總香氣物質峰面積歸一化法進行各種香氣物質相對含量的計算。

1.4 數據分析

每個樣品均經過6次測定，結果取平均值，并使用SPSSStatistical 17.0軟件對所得數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 核桃乳中香氣物質分析

采用HP-SPME/GC-MS聯用技術檢測發酵前核桃乳，以及發酵和后熟過程中香氣物質的含量，結果見下頁表1。

由表1可知，核桃乳發酵前，共檢測到47種香氣物質，占總揮發性物質的56.12%，以醇類和醛類物質為主，特別是正己醇和正己醛相對含量較高，分別占香氣物質含量的14.52%和13.92%，這也是導致核桃乳中呈現生味和油脂味的主要原因。Kobayashi等人研究了這些生的油脂味是在打漿過程中核桃中的亞麻酸、亞油酸等在脂氧合酶及氧氣的共同作用下催化生成的，主要是醛、醇類物質。劉志強等人在研究去除大豆生味中表示，在加工過程中脂肪氧合酶的活性增強，會形成較多的生油脂味物質，即使加熱也不能夠去除。

發酵12 h和后熟21 d的核桃乳中，香氣物質含量提高了28.56%，香氣物質的種類和含量也有很大區別，醇類、酸類和酮類含量明顯增加，分別提高110.95%、158.41%和178.47%。發酵前核桃乳中的主體香氣物質正己醇在發酵結束時含量最高，達到總香氣物質的52.59%，而正己醛含量卻明顯降低，由13.92%減少到0.35%，可能的原因是在乳酸菌脂肪代謝過程中，正己醛在乙醇脫氫酶的作用下生成己醇。經過乳酸菌的發酵后，醛類物質含量以及種類降低，這與Achouri的研究結果一致，己醛只要存在就會產生令人不愉快的氣味，對核桃乳口感影響很大，說明乳酸菌發酵在一定程度可以改善核桃乳的生味和油脂味。

發酵核桃乳在4℃下后熟，物質含量變化最大的是酮類，其中乙偶姻（3-羥基-2-丁酮）最為顯著，其含量由0.10%增長到18.24%，它主要是在發酵后期以及后熟過程中產生的揮發性物質。在乳酸菌的代謝作用下，檸檬酸通過檸檬酸裂解酶分解為乙酸和草酰乙酸，草酰乙酸進一步轉化為二氧化碳和丙酮酸。從丙酮酸到雙乙酰可能存在以下2種途徑：①丙酮酸與焦磷硫胺素生成活性乙醛，活性乙醛與乙酰輔酶-A縮合后經酶的裂解生成雙乙酰；②活性乙醛與其他丙酮酸鹽分子縮合，經酶作用形成α-乙酰乳酸，在高氧化-還原條件下，α-乙酰乳酸被氧化形成雙乙酰，而在缺氧條件下形成3-羥基丁酮，3-羥基丁酮在氧氣充足條件下又進一步氧化為雙乙酰。雙乙酰是乙偶姻的還原形式，丁酮類、2-庚酮的閾值較低，主要表現出清香、脂香和甜香，很可能是其發酵產生的特征香氣成分。發酵核桃乳中正己醇和乙偶姻成為主體香氣物質，分別占總香氣物質的49.08%和25.28%，使發酵核桃乳具有了芳香和奶油香氣。

2.2 核桃乳發酵前后香氣的比較

核桃乳在發酵前醇類、醛類的含量相對較高，經過乳酸菌發酵后，香氣物質種類發生明顯變化，結果見圖1。由圖1可以看出，醇類、酸類、酮類的含量相對較高，分別為41.81%、8.14%、18.47%，醇類中的正己醇和酮類中的乙偶姻，是乳制品發酵后的特征香氣物質。醛類物質含量明顯下降，由19.13%降到1.12%，這也是發酵后油脂味減少的主要原因。酯類物質含量也減少，由5.99%降到1.61%，烯類物質在發酵后消失。

圖1 核桃乳發酵前后香氣物質變化

2.3 數據因子分析

根據因子分析的有關信息，在因子分析前，需要對數據是否適合做因子分析進行可行性檢驗，利用SPSS軟件處理，KMO和Bartlett的檢驗結果見表2。

表2 KMO和Bartlett的檢驗

KMO測度的值越高（接近1.0時），表明變量間的共同因子越多，研究數據適合采用因子分析。通過檢驗得知，KMO值為0.795，大于限定的0.500，表明研究數據適合做因子分析。Bartlett球形度檢驗的伴隨概率值為0.000＜0.010，達到了顯著性水平，說明發酵核桃乳香氣的變化適合做因子分析。

表1 核桃乳及發酵和后熟過程中香氣物質測定結果

表1 核桃乳及發酵和后熟過程中香氣物質測定結果（續）

核桃乳發酵前后香氣物質因子方差分析結果如下頁圖2所示。從圖2可以看出，發酵前核桃乳中香氣成分和發酵2 h的香氣成分具有很高的相似性，說明在發酵2 h內，香氣物質的變化程度不明顯；在發酵6 h后，與未發酵核桃乳相差甚遠，香氣物質發生了很大的改變；6 h以后的基本的香氣都比較接近，尤其是在后熟階段，香氣物質的成分基本不變。核桃乳中的香氣風味物質的種類比較少，蛋白質、脂肪以及糖類在發酵過程中的降解或每一類物質的衍生物相互作用產生了新的物質，因此，發酵后核桃乳中的香氣物質與發酵前核桃乳中的香氣物質有很大的差異性。

圖2 發酵核桃乳香氣成分因子方差分析

3 結論

本研究采用自選的2株乳酸菌對核桃乳進行發酵，以HS-SPME/GC-MS聯用技術檢測核桃乳發酵前后香氣物質的變化，試驗結果表明發酵后香氣物質種類雖然減少，但含量增加28.56%；具有水果芳香的正己醇是發酵前核桃乳的主體香氣物質之一，發酵后含量明顯增加，由25.87%增加到49.08%，而另一主體香氣物質發生了重大改變，發酵前具有生乳味的正己醛，被發酵核桃乳中具有油脂香味的乙偶姻取代，兩者含量接近，分別為24.8%和25.28%，因此發酵核桃乳具有成熟的水果芳香和奶油酯香。本研究同時證明了自選乳酸菌具有工業應用價值，可以用于高品質發酵型核桃乳產品的開發。

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Study on the aroma com ponents of walnut m ilk by fermentation of lactic acid bacteria

XUE Chun1*LI Yan1，2LI Jia1MOUDehua1**

1（College ofbioscience and bioengineering，Hebei university ofscience and technology，Hebei Shijiazhuang 050018，China）2（Hebei R&D center for fermentation engineering，Hebei Shijiazhuang 050018，China）

采用自選植物乳桿菌亞種KDLLL1-1、意大利腸球菌KDLLJ3-1對核桃乳進行發酵，并在發酵和成熟過程中取樣，采用頂空固相微萃取和氣相色譜質譜（HP-SPME/GC-MS）聯用技術對香氣成分進行測定，研究發酵核桃乳在生產和儲藏環節香氣物質的變化。試驗結果表明，發酵核桃乳中香氣物質含量提高28.56%，其中醇、酸、酮類物質分別提高110.95%、158.41%、178.47%，而酯類、醛類物質含量下降，烯類物質消失。發酵前的核桃乳中正己醇和正己醛含量最高，分別占總香氣物質含量的25.87%和24.8%，而發酵核桃乳中主體香氣物質為正己醇和乙偶姻，分別占總香氣物質含量的49.08%和25.28%，使產品具有芳香氣味和強烈的奶油及油脂香氣。研究結果可為自選乳酸菌的應用和發酵核桃乳的開發提供理論參考。

自選乳酸菌；發酵核桃乳；頂空固相微萃取與氣相色譜質譜聯用；香氣物質

Walnut milk fermentation by Lactobacillus plantarum subsp KDLLL1-1、Enterococcus italicus KDLLJ3-1,and in the fermentation and maturation process sampling.The aroma components were determined by headspace solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry(HP-SPME/GC-MS)to study the changes of aroma substances in the production and storage of fermented walnut milk.The results show:The contents of aroma components in fermented walnut milk increased by 28.56%,alcohols,acids and ketones were increased by 110.95%,158.41%and 178.47%;while the content ofesters and aldehydes decreased,and the alkenes disappeared.The content ofn-hexanol and n-hexylaldehyde in walnut milk before fermentation was the highest,the total aroma content of 49.08%and 25.28%respectively,while the main aroma substances in fermented walnut milk were n-hexanol and acetoin,accounting for 49.08%and 25.28%respectively,so that the product has a fragrant smell and a strong aroma of butter and grease.The results of this study can provide theoretical reference for the application of lactic acid bacteria and the development of fermented walnut milk.

optional lactic acid bacteria；fermented walnut milk；headspace solid phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry；aroma substances

TS252.54

A

1673-6044（2016）04-0011-06

10.3969/j.issn.1673-6044.2016.04.005

*薛純，女，1993年出生，河北科技大學在讀本科。

**牟德華，通訊作者，E-mail：dh_mou@163.com.

2016-10-06