高山紅景天雌株特異性SRAP標記發掘及其關聯基因功能分析

王延禹， 周雅卓， 鄭大浩， 劉福鵬， 吳委林， 李美善

(延邊大學農學院，吉林 延吉 133002)

高山紅景天雌株特異性SRAP標記發掘及其關聯基因功能分析

王延禹， 周雅卓， 鄭大浩， 劉福鵬， 吳委林*， 李美善

(延邊大學農學院，吉林 延吉 133002)

以長白山高山紅景天雌株、雄株和兩性株構建的不同性別植株的DNA集團混池(BSA池)，利用相關序列多態性(SRAP)標記技術，發掘雌雄植株特異性SRAP標記，并通過生物信息學分析，闡明與其相關聯基因的功能。結果表明：用228個SRAP引物組合在7個BSA池中所檢出的1 044條SRAP條帶中，僅Me03-Em02 SRAP引物組合在雌株BSA池中獲得1條DNA序列長度為678 bp的雌株特異性Me03-Em02 SRAP-DNA片段；該片段屬于葉綠體基因組的核骨架scaffold-ZJUL-2062946。Me03-Em02,SRAP-DNA片段作為高山紅景天雌株特異性Me03-Em02 SRAP標記與葉綠體基因組上光合代謝途徑中的psbE基因相關聯；該基因編碼的蛋白為細胞色素b559蛋白的α亞基，是一種葉綠體跨膜蛋白。

高山紅景天;不同性別植株;SRAP;BSA;基因功能

高山紅景天，又名庫頁紅景天(RhodiolasachalinensisA. Bor)，為景天科(Crassulaceae)紅景天屬(RhodiolaL.)多年生草本植物，與林蛙和不老草并稱東北新三寶，為東北地區珍稀藥用植物之一。高山紅景天在其干燥根及根莖中含有紅景天苷等18種有效成分[1]，具有抗疲勞、抗缺氧、抗衰老、抗輻射、抗病毒、抗腫瘤、提高腦力和體力等多種功效[2]。

據研究，高山紅景天不同性別植株的藥用成份紅景天甙含量存在顯著差異，雄性植株顯著高于兩性植株及雌性植株[3]；若能在早期區分雌雄植株，選擇富含有效成分的雄性植株，將有利于提高高山紅景天的開發利用率。目前，關于高山紅景天早期性別鑒定方面的研究非常有限。吳委林等(2005)和李美善等(2009)曾對不同高山紅景天性別植株形態和過氧化物酶進行了比較分析，認為雖然不同性別植株的葉長和葉寬在成株期存在極顯著差異，但依然不足以有效區分雄株和雌株；而且，不同性別植株在花芽分化、開花期過氧化物酶酶帶數及酶量上存在的一定差異，也難以用于早期區分雌雄植株[4-5]。卜媛媛等(2011)利用RAPD與AFLP分子標記在高山紅景天不同性別BSA池之間進行擴增，不僅只有1對RAPD引物組合在雄株和兩性株上分別擴增出1條約1 200 bp的特異性條，而且重復性不足，穩定性較差；而AFLP引物擴增出的差異條帶雖然較多，64對AFLP引物組合共擴增出18條差異條帶[6]，但依然未能檢出雌雄特異的條帶。總體上，形態標記與同工酶標記受環境因素影響較大，RAPD標記穩定性較差，而AFLP標記操作繁鎖、耗時費力且費用昂貴，故都未能在高山紅景天性別早期鑒定中普及應用。

SRAP(Sequence-related amplified polymorphism)標記是一種基于相關序列擴增多態性的新型標記，具有操作簡便、重復性好、分離的目標片段便于測序和克隆、共顯性標記等優點。該標記技術自2001年開發以來，廣泛應用于遺傳圖譜構建[7-11]、遺傳多樣性研究[12-18]、功能基因的標記及其克隆等方面[19-25]。由于自然界不同物種、不同個體、控制不同性狀的不同基因的內含子變異大、啟動子與ORF的間隔區間的長度變化大而存在廣泛的多態性，SRAP標記通過獨特的雙引物設計對基因的ORF(Open Reading Frames，開放閱讀框)的特定區域進行擴增，即上游引物位于結構基因的外顯子區域，而下游引物位于結構基因的內含子區域和/或啟動子區域，故SRAP標記錨定區段與相應的功能基因相關聯，屬于特定的功能性標記。

迄今為止， SRAP標記在植物性別鑒定方面的應用還比較少，尤其是SRAP標記用于高山紅景天雌雄植株鑒定方面的研究未見報道。本研究采用SRAP分子標記技術，在高山紅景天不同性別植株中分別進行PCR擴增，并通過目標DNA序列的生物信息學分析，發掘高山紅景天雌、雄株相關聯的特異性SRAP標記，為高山紅景天性別的早期鑒定、性別分化、克隆性別決定基因及單性栽培與育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

2015年6月，在吉林省和龍市福洞鎮高山紅景天栽培基地(42°30′29.1″N、129°03′19.7″E，海拔811 m)，通過花器觀察，選取30株高山紅景天雌性(Female，縮寫為F)植株、30株雄性(Male，縮寫為M)和10株兩性(Bisex，縮寫為BS)植株，以單株為單位分別截取等量干凈嫩葉；每10株等量混合，構建雄性和雌性植株各3個BSA池、兩性植株1個BSA池，共7個BSA池。

1.1.2 克隆菌株與載體及主要試劑

克隆用菌株為E. coli DH5α；pMD19-T simple vector(T/A克隆載體)；所用PCR產物回收試劑盒、質粒回收試劑盒等試劑均購自Omega公司，其它主要試劑均為進口試劑。

1.2 基因組DNA的提取與檢測

所取池材料，以BSA池為單位，在液氮中迅速研磨，分裝于2 mL離心管中；樣品DNA的提取采用Zheng等(2008)的改良尿素法[26]。所提取的DNA，溶解于pH值為8.0的TE緩沖液中，經1%瓊脂糖凝膠上檢測DNA質量后，利用Quawell Q500檢測DNA濃度，然后用TE緩沖液稀釋成濃度100 ng/L。

1.3 SRAP引物及PCR擴增

SRAP引物序列選自Li和Quiros(2001)[19]、Ferriol等(2003)[20]和Li等(2003)[21]開發的SRAP引物庫(表1)，包括12條正向引物和19條反向引物，共組成228對引物組合；所選SRAP引物由Invitrogen公司合成。

表1 SRAP引物列表及其序列

SRAP-PCR擴增，采用體積為20 μL的反應體系，包含200 ng BSA池DNA、10 μL天根2×PCR Mix、正反向引物各0.5 μM。PCR反應循環為94 ℃預變性3 min，接著94 ℃變性30 s、35 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min、5個循環，之后是94 ℃變性30 s、50 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min、35個循環，最后72 ℃延伸10 min。PCR反應在Eppendorf基因擴增儀上進行。PCR擴增產物在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳分離，用ZF-258全自動凝膠成像系統進行分析。

1.4 目標DNA片段的回收、克隆與測序分析

經瓊脂糖凝膠分離和鑒定后，在凝膠成像儀上從凝膠中分離性別特異的目標DNA片段(PCR產物電泳譜帶)，按PCR產物回收試劑盒說明書進行操作和回收，然后連接到pMD19-T上獲得重組質粒，采用熱激法導入到E. coli DH5α感受態細胞中，再經過藍白斑選擇，挑選含有重組質粒的陽性克隆子，送至上海英駿生物工程技術服務有限公司進行測序，用DNAStar7.1和GeneDoc3.2軟件進行序列分析。

1.5 特異性片段的測序與生物信息學分析

測序所得DNA序列，利用在線工具BLAST for 1 000 plants (https://www. bioinfodata.org/Blast4OneKP/home)中的mega blast模塊進行分析；通過序列比對，搜索同源序列。利用NCBI網站上的在線工具ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/ gorf.html)以及CCD(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)和EMBL-EBI網站的在線工具InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search;jsessionid =C340FBABA89429E901946DBF61C31CBF)對所獲得同源序列進行開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)及相關基因及由其編碼的蛋白質氨基酸序列分析。目的蛋白的理化特性利用在線工具ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)分析；目的蛋白信號肽利用在線工具SignalP 4.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行預測；蛋白質親疏水、跨膜屬性等利用TMHMM-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)進行分析。

2 結果與分析

2.1 SRAP擴增分析

利用228對SRAP引物組合，對7個BSA池進行PCR擴增，共擴增出1 044條帶，DNA片段大小為100～1 000 bp；其中，在3個雄株BSA池中擴增出943條帶，兩性株BSA池中擴增出944條帶，雌株BSA池中擴增出907條帶。由不同的SRAP引物組合擴增出的條帶數為0～13條，平均每對引物擴增出4.58條帶。其中，引物組合Me09-Em08擴增出的條帶最多，共擴增出13條帶；而Me03-Em01、Me03-Em19和Me06-Em17組合未能擴增出清晰條帶。

在228對SRAP引物組合中，僅Me03-Em02引物組合在3個雌株BSA池中都擴增出1條雄株和兩性株中所缺乏的條帶(圖1)；而Me06-Em02等107個相組合在不同的BSA池中擴增出不同的條帶，但在同性別的不同BSA池之間存在差異，缺乏性別特異性(圖1)。由于Me03-Em02引物組合在雄株BSA池和兩性BSA池中都未能擴增出相應的條帶，該引物組合在雌株BSA池中擴增出的條帶(即SRAP-DNA片段)可作為高山紅景天雌株特異性SRAP標記。

M1～M3分別表示不同雄株BSA池，BS表示兩性株BSA池，F1～F3分別表示不同雌株BSA池。箭頭表示雌株BSA池中擴增出的特異性DNA條帶

圖1 Me03-Em02和Me06-Em02引物組合在不同BSA池中的PCR擴增產物

Fig.1 PCR products amplified in different BSA pools with Me03-Em02 and Me06-Em02 primer pairs

2.2 目標DNA序列的同源物種搜索

在3個雌株BSA池中擴增出的雌株特異性Me03-Em02 SRAP標記的PCR產物(圖1)，測序結果表明，目標DNA序列長度為678 bp，其SRAP引物區間的DNA序列長度為643 bp。針對Me03-Em02 SRAP-DNA片段，利用在線搜索工具BLAST for 1000 plants上的mega blast模塊進行物種搜索(表2)，表明從高山紅景天雌株中分離的目標DNA序列與共享生物信息數據庫(Bioinfodata)上的紅景天(Rhodiola rosea)的核骨架scaffold-ZJUL-2062946具有極高的序列一致性，同源一致性得分最高(1 115分)，顯著性水平為0。說明從高山紅景天雌株基因組DNA中分離的目標DNA序列包含于已知紅景天核骨架scaffold-ZJUL-2062946中。

表2 目標DNA片段的顯著一致的核骨架

2.3 雌株特異性Me03-Em02 SRAP標記關聯基因搜索

為確定與高山紅景天雌株特異性Me03-Em02 SRAP標記關聯的目的基因，利用包含引物的Me03-Em02 SRAP-DNA序列與所下載的長度為1 626 bp的Scaffold-ZJUL-2062946序列進行比對搜索(圖2)。結果表明，目標DNA序列的反向互補序列與Scaffold-ZJUL-2062946上第731個堿基到第1 380個堿基之間的DNA序列相重疊(圖2)；Me03-Em02 SRAP-DNA序列橫跨Scaffold-ZJUL-2062946上重疊區內存在的1個ORF(位于第589～840堿基)及其上游區序列；高山紅景天雌株特異性Me03-Em02 SRAP標記的上游引物位于該ORF的DNA序列中，即位于反向互補序列的下游；而下游引物位于該ORF的上游區段，即位于反向互補序列的上游。與Scaffold-ZJUL-2062946序列相比，Me03-Em02 SRAP標記的正向引物序列中存在9個堿基替換突變，而反向引物中存在1個堿基的插入突變和6個堿基的缺失突變；而且在Scaffold-ZJUL-2062946重疊區ORF的上游區，在該標記上下游引物區間內還存在1個堿基缺失。由于1個ORF對應1個功能基因，本研究中發掘的高山紅景天雌株特異性Me03-Em02 SRAP標記是由與其相關聯基因的突變所形成的雌株特異性標記。

注：帶下劃線的淺黑色背景部分表示與Me03-Em02 SRAP-DNA重疊區中存在的開放閱讀框(ORF)；Me03-Em02 SRAP片段前后兩端下劃線部分為引物序列

圖2 雌株特異性Me03-Em02 SRAP標記與Scaffold-ZJUL-2062946中所含基因的關聯性

Fig.2 Association of the female plant specific Me03-Em02 SRAP marker with the gene involved in Scaffold-ZJUL-2062946

2.4 雌株特異性Me03-Em02 SRAP標記關聯基因分析

2.4.1 雌株特異性Me03-Em02 SRAP標記關聯基因的基因組學定位

為確定高山紅景天雌株特異性Me03-Em02 SRAP標記相關聯的基因在物種基因組上存在的位置，在NCBI上對核骨架Scaffold-ZJUL-2062946的DNA序列進行基因組學搜索(表3)，結果表明Scaffold-ZJUL-2062946屬于葉綠體基因組；Scaffold-ZJUL-2062946在葉綠體全基因組上覆蓋率為15%。該核骨架與與竹島景天(Sedum takesimense)葉綠體基因組上同源區的序列一致性高達100%，與其他植物的葉綠體基因組上同源區的序列一致性，也都為98%～99%。在NCBI共享數據庫上，并未找到Scaffold-ZJUL-2062946與核基因組相關聯的任何信息；說明在Scaffold-ZJUL-2062946上存在的與高山紅景天雌株特異性Me03-Em02 SRAP標記相關聯的基因屬于葉綠體基因。

表3 包含雌株特異性Me03-Em02 SRAP標記關聯基因的核骨架Scaffold-ZJUL-2062946的基因組學定位

Table 3 Genomic location of Scaffold-ZJUL-2062946 involving the gene associated with the female plant specific Me03-Em02 SRAP marker

登錄號全基因組定位物種來源極值總值覆蓋率/%顯著水平一致性/%KF954541.1葉綠體全基因組竹島景天Sedumtakesimense171171152e-38100KP006497.1葉綠體全基因組風鈴草Campanulatakesimana165165151e-3699KJ477692.1葉綠體全基因組山茱萸Hanabusayaasiatica165165151e-3699JX427551.1葉綠體全基因組垂盆草Sedumsarmentosum165165151e-3699KF746351.1葉綠體全基因組向日葵Helianthusgrosseserratus165165151e-3699EU090187.1葉綠體全基因組藍鐘花Tracheliumcaeruleum165165151e-3699KX154571.1葉綠體全基因組薇甘菊Mikaniamicrantha159159155e-3598KX499525.1葉綠體全基因組蒲公英Taraxacumamplum159159155e-3598

2.4.2 雌株特異性Me03-Em02 SRAP標記關聯基因的生物信息分析

利用NCBI網站上在線工具ORF Finder和專用分析軟件DNAStar7.1搜索的結果(圖2)，在Scaffold-ZJUL-2062946 DNA序列的負鏈第589～840堿基存在的、與高山紅景天雌株特異性Me03-Em02 SRAP標記相關聯的開放閱讀框(ORF)編碼1條由83個氨基酸組成的蛋白質(圖3)。

注：淺黑色背景區表示開放閱讀框(ORF)；實線箭頭表示閱讀方向

經ProtParam(http://web.expasy.org/)理化特性分析表明(圖4-A)，該蛋白分子量為9.4 k Da，理論等電點(pI)為4.83，無信號肽；其不穩定系數Instability index (II)為49.93，>40.0，屬于不穩定蛋白，無法以自由態存在。亞細胞定位分析表明，該蛋白存在于葉綠體膜上，是一種跨膜蛋白(圖4-B)；其N-末端第1～19氨基酸位于膜內側(N-末端位于葉綠體膜的內側)，第20～42個氨基酸為跨膜區，第43～80個氨基酸位于膜的外側(C-末端位于葉綠體膜外側)，延伸至細胞質中。

圖4 與雌株特異性Me03-Em02 SRAP標記關聯基因編碼的蛋白質亞細胞定位(A)及其跨膜屬性(B)

2.4.3 雌株特異性Me03-Em02 SRAP標記關聯基因功能

與高山紅景天雌株特異性Me03-Em02 SRAP標記相關聯基因編碼的蛋白，利用NCBI在線分析工具Conserved Domain Search Service (CD Search)模塊進行分析(圖5)，結果表明，高山紅景天雌株特異性Me03-Em02 SRAP標記相關聯的基因為psbE；它編碼細胞色素b559(Cytochrome b559)蛋白的α亞基，該亞基具有Cytochrom_B559超級家族功能結構域和Cytochrom_B559a超級家族功能結構域等2個結構域。從結構域的一致性來講，其功能與Cytochrom_B559a更加一致。細胞色素b559是光合作用途徑中重要的一種蛋白，它通過與血紅素和金屬離子結合參與光合系統II光反應中的電子傳遞。

圖5 高山紅景天雌株特異性Me03-Em02 SRAP標記相關聯的基因編碼的蛋白的功能

3 討論與結論

一直以來，由于高山紅景天雄性植株的有效成分含量明顯高于雌性植株，人們對如何在植株幼苗生長的早期鑒別和區分雌雄植株、選擇種植雄性植株進行了諸多嘗試，包括通過植株形態學觀察、同工酶檢測，甚至采用RAPD、AFLP等分子標記技術，進行早期鑒定，但效果均不佳[3-6]。尤其是未能發掘出可直接用于早期鑒定和選擇雄性植株的雄株特異性的形態學標記和分子標記。SRAP是一種新型的功能性分子標記；近年來，人們利用該標記技術進行快速定位質量性狀單基因與數量性狀主效基因，并獲得成功；如，Lu等(2014)利用F2群體通過構建2個極端表型的BSA池(每池10株)并進行目標DNA測序，在黃瓜1號染色體Ef1.1區段中鑒定出1個早花候選基因Csa1G651710[25]。

本研究利用高山紅景天不同性別植株構成的7個BSA池，從228個SRAP引物組合中發掘到1個雌株特異性Me03-Em02 SRAP標記；該標記與葉綠體基因組上psbE基因相關聯。葉綠體psbE基因編碼的蛋白是細胞色素b559(Cytochrome b559)蛋白的α亞基，通過與血紅素和金屬離子結合參與光合系統II光反應中的電子傳遞，是植物光合作用中必不可少的一種蛋白。

迄今為止，人們從性別決定的基因角度去尋找與雌雄植株相關的特異性分子標記，但并沒有任何證據說明雌雄植株間有效成分含量的差異與其性別決定基因直接有關。實際上，高山紅景天雄株，不僅有效成分含量高于雌株，而且形態上也與雌株存在差異。在成株期，雄株比雌株葉片狹長且薄，莖稈比雌株細，分枝數多于雌株，地下根莖粗，莖長和莖數等均大于雌株；與之相比，雌株株高比雄株高些，且比雄株健壯，莖稈更加粗壯，葉片更大更厚[4-5]。所以，高山紅景天不同性別植株間有效成分含量和外觀形態上的差異，根本原因很可能并不在于性別差異本身。本研究中，利用Me03-Em02 SRAP標記在高山紅景天雌株池中擴增出的雌株特異的DNA片段，包含psbE基因的部分外顯子DNA序列和該基因的上游序列。與包含psbE基因的葉綠體核骨架Scaffold-ZJUL-2062946的DNA序列相比，Me03-Em02 SRAP標記的上游和下游引物序列中均存在堿基替換和/或堿基缺失突變，尤其是上游引物序列中存在1個堿基的插入和連續6個堿基的缺失。這意味著本研究中發掘的高山紅景天雌株特異性Me03-Em02 SRAP標記源于其雌株葉綠體基因組中psbE基因的突變。

目前，高山紅景天雌株中與其特異性Me03-Em02 SRAP標記相關聯的psbE基因序列中存在的突變是否導致高山紅景天雌性植株失去psbE基因功能，造成雌株與雄株間的差異，以及psbE基因是否與高山紅景天花器的發育有關，這些都還不清楚，待于進一步研究。但由于psbE基因是光合代謝途徑中具有重要作用1個基因，高山紅景天雌株葉綠體基因組psbE基因的突變很可能會造成雌株和雄株在光合代謝上的差異，進而影響雌株下游次生代謝，并造成高山紅景天雌株的有效成分含量低于雄株。

總之，在本研究中發掘出1個高山紅景天雌株特異性Me03-Em02 SRAP標記；雖然未能發掘出可直接用于雄株早期鑒定和選擇的雄株特異性SRAP標記，但可以借助雌株特異性Me03-Em02 SRAP標記，通過早期鑒定和淘汰雌株，進而對雄株進行間接選擇。

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Functional analysis of the gene associated with the SRAP marker specific to female plants of Rhodiola sachalinensis A. Bor

WANG Yanyu, ZHOU Yazhuo, ZHENG Dahao, LIU Fupeng, WU Weilin*， LI Meishan

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China)

BSA pools constructed using female, male and bisexual plants ofRhodiolasachalinensisA. Bor collected from Changbai Mountains as materials, a female plant specific SRAP marker was explored, subsequently the function of the gene associated with the SRAP marker was clarified. The results revealed that, among the 1044 fragments amplified from 7 BSA pools, only one 678 bp SRAP-fragment produced from female plant BSA pools with Me03-Em02 SRAP primer pair was specific to female plants ofRhodiolasachalinensis. The Me03-Em02 SRAP fragment was involved in scaffold-ZJUL-2062946 belonging to chloroplast genome, and the Me03-Em02 SRAP marker was associated with the gene psbE of the chloroplast genome. The polypetides encoded by the gene psbE was α-subunit of Cytochrome b559 was a trasmembrane protein, which was involved in photosynthesis metabolism.

RhodiolasachalinensisA. Bor; different sexual plants; SRAP; BSA; gene function

2016-11-10

吉林省教育廳項目(吉教科合字[2015]第29號)；延邊大學科研課題(延大科合字[2014]第26號)；延邊大學博士科研啟動基金資助。

王延禹(1991—)，男，吉林乾安人，在讀碩士，研究方向為玉米分子育種，吳委林為通信作者。

E-mail: wlwu@ybu.edu.cn

1004-7999(2016)04-0283-09

10.13478/j.cnki.jasyu.2016.04.002

S567.239

A