番茄花粉發育時期與花蕾大小關系的研究

高 慧， 李 昂， 陳雙越， 齊海軍， 楊 陽， 金東淳*

(1.延邊大學農學院，吉林 延吉 133002;2.吉林省中玉農業有限公司，吉林 長春 130000)

番茄花粉發育時期與花蕾大小關系的研究

高 慧1， 李 昂1， 陳雙越1， 齊海軍1， 楊 陽2， 金東淳1*

(1.延邊大學農學院，吉林 延吉 133002;2.吉林省中玉農業有限公司，吉林 長春 130000)

以“賊不偷”番茄品種為材料，采用DAPI染色方法研究了番茄花粉發育時期與花蕾長度的關系。結果表明：同一朵花的不同花藥中花粉粒的發育時期基本一致,并且番茄花的長度與花粉粒的發育時期也有著較嚴格的對應關系。當花蕾長度小于0.4 cm時，花粉基本處于小孢子母細胞時期；長度為0.4～0.6 cm時，為花粉發育的二分體時期；長度為0.6～0.7 cm時,為四分體時期；長度為0.7～0.8 cm時，為單核居中期；長度為0.8～0.9 cm時，為單核靠邊期；長度為0.9～1.1 cm時，為二核花粉期；長度大于1.1 cm時，基本為成熟的小孢子。

番茄；花蕾長度；花粉粒；發育時期

植物花藥培養中，花粉的發育時期是影響花藥(花粉)培養效果的重要因子之一[1-11]。很多花藥培養研究結果表明，不同發育時期的花粉粒對花粉培養的效果有很大差異，選擇適宜發育時期的花粉粒是決定花粉培養成敗的關鍵，一般認為單核中期或單核靠邊期是花粉培養的最佳時期。而花粉培養需從許多花或花藥當中取花粉粒，對每一朵花或花藥進行鏡檢并確定其花粉發育時期既費時費力，又會對小孢子活力造成一定的損傷。所以針對某一植物進行花粉培養時接到一些能夠準確判斷其花粉發育時期形態等標記是非常有必要的。植物中有許多關于花(或花蕾)長度與花粉發育時期關系的相關研究，表明花(或花蕾)的長度與花粉發育階段存在密切關系[12-13]。關于番茄曾有過花粉發育時期與花藥培養效應的研究[14]，但尚無花粉發育時期與花粉培養的相關研究。本試驗篩選出對花粉培養響應較好的、適合番茄花粉培養的“賊不偷”番茄品種為試驗材料，著重研究小孢子各發育時期的細胞學特征以及不同發育時期與花蕾大小的相關性，以便直接從花(或花蕾)的長度來推斷小孢子的發育時期，為番茄花藥或小孢子培養提供簡單易行的小孢子發育時期鑒定方法。對進一步優化花粉培養條件及提高胚狀體的誘導效率、以及建立番茄花粉培養體系等諸方面也具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

從市場購買“賊不偷”番茄品種的種子，育苗后移栽至溫室大棚栽培，在盛花期采集新鮮的、不同長度的花蕾為材料。

1.2 方法

采摘生長健壯的第1花序中的花,從花蕾基部到頂部測量長度,并根據花的大小分為7種不同長度:A(0～4 mm)，B(4～6 mm),C(6～7 mm),D(7～8 mm),E(8～9 mm),F(9～11 mm ),G(11 mm以上)(圖1)。取不同長度的花蕾(各5個)，分離花藥(一朵花蕾中通常有5～6個花藥)，于卡諾固定液(乙醇∶冰乙酸=3∶1)中固定24 h。取出后,用檸檬酸/磷酸緩沖液(pH值為4)中和固定2 h。用鑷子取出花藥并用解剖刀切開,輕輕壓片。先在載玻片上滴1滴2 mg/L(2 mgDAPI溶于1 L蒸餾水)的DAPI染色液,置花藥于此液體中進行簡易壓片,置于黑暗中10 min。用Olympus落射式熒光顯微鏡，分別在10×10、10×20、10×40(目鏡×物鏡)倍鏡下，每片觀察3個視野確定花藥小孢子的發育時期并照相。其中，熒光激發光λ=358 nm[15]。

注：A(0～4 mm)、B(4～6 mm)、C(6～7 mm)、D(7～8 mm)、E(8～9 mm)、F(9～11 mm)、G(11 mm 以上)

圖1 “賊不偷”番茄品種不同發育時期花蕾的外觀形態

Fig.1 The exterior forms in different development periods of buds in “zeibutou” tomato

2 結果與分析

通過對不同大小番茄花蕾花粉發育的顯微觀察，發現番茄花蕾的大小與小孢子發育時期有一定的關系。根據不同時期花粉的形態特征，番茄花粉粒的發育可分為小孢子母細胞時期、二分體時期、四分體時期、單核居中期和單核靠邊期、二核花粉期、成熟小孢子等7個階段。

該試驗主要采用DAPI熒光染色劑對番茄不同發育時期的細胞進行觀察，而沒有選用植物花粉研究中最常用的醋酸洋紅染色劑，主要是因其特異性差，在清晰觀察花粉細胞核的動態變化中存在局限性。DAPI是能夠與核物質(DNA)特異性結合的熒光染料，是觀察、研究細胞核動態變化的理想染色劑，已廣泛地應用于細胞分子生物學等各個領域, 其中較多地應用于動物癌細胞、胚胎細胞以及植物染色體帶型、異染色質等研究[16-17]。但它在檢測花粉粒發育時期的應用報道較少, 有關檢測番茄花粉粒發育的文獻就更少，這主要是由于厚而堅硬的花粉壁阻礙染色劑的滲透。該試驗通過有效的固定以及中和固定等前處理, 在保證維持花粉粒正常形態的同時,有效地軟化花粉壁,使 DAPI 能夠滲透進入到花粉粒中, 并準確、清晰地觀察到了花粉母細胞、四分體、單核花粉粒和二核花粉粒等不同發育時期細胞核的動態變化。這一染色方法也為番茄游離小孢子培養以及胚狀體發育過程的動態變化研究奠定了堅實的基礎。

2.1 番茄花粉發育特性

番茄小孢子的形成和花粉粒的發育與黃瓜[18]、辣椒[19]花粉粒的發育相似。在小孢子母細胞時期，細胞核大，無明顯的液泡，表現為細胞著色較深，在小孢子母細胞的四周沉積1層胼胝質物質。小孢子母細胞第1次減數分裂后產生分隔壁，將母細胞分為2個子細胞，即二分體，2個核同步進行第2次分裂，分裂后在4個核之間產生細胞壁形成四面體型的四分體和兩側對稱型四分體。制片觀察到四分體四周的胼胝質壁并非完全規則地包裹著四分體。包裹在四分體四周的胼胝質被分解后，小孢子從中游離出來彼此分開，小孢子釋放出來,此時在花粉壁上可觀察到3個呈凸透鏡形狀的萌發孔。剛游離出來的小孢子細胞質濃厚，細胞核位居中央，此期為單核中期，細胞質內液泡不明顯，細胞壁呈收縮狀態為小孢子收縮期。隨著小孢子從四周汲取養料，細胞體積逐漸增大，液泡逐漸發育為大液泡，并將細胞核擠到邊上，此期為單核靠邊期。而后細胞質逐漸充滿整個細胞，細胞核進行1次不均等有絲分裂，形成雙核，靠花粉壁的為生殖細胞，占據細胞中央的為營養細胞。番茄成熟的花粉粒為二細胞花粉粒，在花粉壁上可觀察到明顯的3個呈凹透鏡形狀的萌發孔,這與朱麗萍[20]的結果基本相似。

2.2 番茄花粉發育時期與花蕾大小的關系

按花蕾大小觀察每個等級番茄花蕾的花粉粒發育特性，結果表明：花蕾小于0.4 cm時，花粉粒處在花粉母細胞減數分裂期(圖2-A)，此期可觀察到番茄(2n=2x=24)有12對染色體(圖2-B)。花蕾大小為0.4～0.6 cm 時，花粉母細胞均等的分裂成2個子細胞，此期為花粉粒二分體時期(圖2-C,D)?；ɡ俅笮?.6～0.7 cm時，花粉粒處在四分體時期(圖2-E,F)。這一時期的花蕾中可以觀察到被胼胝質包圍的單核的四分體?；ɡ俅笮?.7～0.9 cm時，花粉粒處在單核花粉期。熒光顯微鏡下可觀察到從四分體四周胼胝質分解后游離出來的核位居中央的小孢子，此期為花粉粒單核居中期(圖2-G,H)。隨著花粉粒的不斷發育膨大，可觀察到小孢子中的大液泡把細胞核擠到一邊，此期為花粉粒單核靠邊期(圖2-I)。花蕾大小為0.9～1.1 cm時，熒光顯微鏡下可觀察到2個大小不一、亮度不同的細胞核。由于有絲不均等分裂，形成的細胞核一個大一個小。體積大的為營養細胞核(V)，核大，顏色較淺；體積小的為生殖細胞核(G)，核小，顏色較亮；此時期為花粉粒二核花粉期(圖2-J)。花蕾大小為1.1 cm以上時，番茄花粉粒趨于成熟，屬發育后期。此時期用油鏡(10×100)能明顯觀察到3個呈凹透鏡形狀的萌發孔(圖2-K,L)。

3 討論與結論

很多相關植物游離小孢子的研究結果一致認為，很多因素影響單倍體的誘導效果，如基因型、花粉發育時期、脅迫處理、激素、培養基及培養條件等。其中，選擇適當的花粉發育時期是能否成功誘導單倍體的前提與關鍵，普遍認為單核靠邊期是花粉培養的最佳時期。而對每一朵花粉粒都鑒定其發育時期，不僅耗時耗力，又損傷花粉粒。為此本文探討了“賊不偷”番茄品種花蕾大小與花粉發育時期間的關系。以期能夠直接從花(或花蕾)的長度來推斷小孢子的發育時期，為番茄花藥或小孢子培養提供簡單易行的小孢子發育時期鑒定方法，從而提高花粉或花藥培養的誘導率。

“賊不偷”番茄品種是我實驗室篩選出的、對花粉培養響應較好的、適合番茄花粉培養相關研究的好材料，在預備試驗中曾誘導出較高頻率的胚狀體(相關結果將在后續論文中發表)。結果表明，“賊不偷”番茄品種的花蕾長度小于0.4 cm時，花粉基本處于小孢子母細胞時期；長度為0.4～0.6 cm時，為二分體時期；長度為0.6～0.7 cm時,為四分體時期；長度為0.7～0.8 cm時，為單核居中期；長度為0.8～0.9 cm時，為單核靠邊期；長度為0.9～1.1 cm時，為二核花粉期；當長度大于1.1 cm時，基本為成熟的小孢子?；ɡ俅笮∨c花粉發育時期間存在高度相關性。這一結果為本實驗室正在進行的番茄花粉離體培養研究提供了重要的參考。

目前，在擬南芥、水稻、油菜等模式植物中已建立了成熟的花粉培養體系。而番茄的單倍體誘導研究多集中在花藥培養，吳志蘋[21]曾通過番茄小孢子離體培養獲得胚狀體，但至今尚無相關通過游離小孢子培養獲得番茄單倍體植株的報道，這有待我們進一步的研究。植物單倍體的誘導主要采用花藥和花粉培養方法，而通過游離小孢子培養誘導單倍體的方法有著可排除單倍體誘導過程中其他體細胞的干擾、可獲得大量的單倍體等很多優勢。通過植物花粉培養可在短時間內獲得大量的純合的雙單倍體(HD)來加快育種進程，同時也在構建遺傳圖譜群體以及植物細胞全能性研究等很多理論性研究中有著廣泛的應用前景。

A,B為小孢子母細胞時期；C,D為花粉粒二分體時期；E,F為花粉粒四分體時期；G,H為花粉粒單核居中期；I為花粉粒單核靠邊期；J為花粉粒二核期；K,L為成熟的小孢子。A～J倍率為10×40(Bar=15 μm);K,L倍率為10×100(Bar=18 μm)。

圖2 番茄“賊不偷”不同發育時期細胞學觀察結果

Fig.2 The results of cytology observation in different development periods of “zeibutou” of tomato

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Studies on the relationship between bud size and pollen development stage in tomato

GAO Hui1, LI Ang1, CHEN Shuangyue1, QI Haijun1, YANG Yang2, JIN Dongchun1*

(1.AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China;2.ZhongyuagricultureCo.,Ltd.ofJilin,ChangchunJilin130000,China)

In present study, the buds with different sizes of tomato variety of “zeibutou” as material, the relationship between bud length and pollen development stage were investigated using DAPI staining method. The results showed that the pollens in different anthers of the same flower were at the identical pollen development stage and, the bud length was strictly corresponding to the pollen development stage. When the bud was shorter than 0.4 cm, most of the pollens were at the microsporocyte stage; the buds were from 0.4 to 0.6 cm, the pollens were at the dispore stage; the buds were 0.6 to 0.7 cm, the pollens were at the trispore stage. When the buds were 0.7 to 0.8 cm, the pollens were at the early uninuclear stage; the buds were 0.8 to 0.9 cm, the pollens were at the late uninuclear stage; the buds were 0.9 to 1.1 cm, the pollens were at the binuclear stage. When the bud was greater than 1.1 cm, the pollens were at the mature microspore stage.

tomato; bud length; pollen; development stage

2016-10-21 基金項目：國際合作研究項目(延邊大學—韓國農村振興廳國立園藝特作研究院)

高慧(1992—),女，山西大同人，在讀碩士，研究方向為植物花粉發育機理研究。金東淳為通信作者，

E-mail:jdc1200@ybu.edu.cn

1004-7999(2016)04-0346-05

10.13478/j.cnki.jasyu.2016.04.012

S641.2

A