青蒿琥酯白蛋白納米粒的制備及抗腫瘤活性初步研究

程瑤+孟巖+鄭巖+金迪+趙亮

【摘 要】 目的：探討青蒿琥酯白蛋白納米粒的最優制備條件及對腫瘤細胞的體外抑制情況。方法：以青蒿琥酯包封率為定量指標成分，確定牛血清白蛋白質量，青蒿琥酯濃度，旋蒸轉速等影響因素，并以L9（33）正交實驗安排實驗；根據結果篩選出最優處方后，考察納米粒的體外釋放情況；MTT法考察納米粒對人肺癌細胞A549的體外抑制率，并與青蒿琥酯原料藥比較。結果：最佳制備條件為：取500μL濃度為35mg/mL的牛血清白蛋白水溶液，在渦旋的情況下滴加濃度為500μg/mL的青蒿琥酯無水乙醇溶液，待溶液變成乳白色后，停止滴加，置于旋蒸儀上設置轉速為1000r/min，時間為30min。根據此條件制得的納米粒平均包封率82%；體外釋放試驗前期有明顯突釋現象，前4h累積釋放度為46%，其后釋放均勻，24h累積釋放度達92%，具有緩釋作用；其在24h對細胞抑制率高于青蒿琥酯組，有較強抑制作用。結論：在最優制備條件下，可增加原料藥的包封率，所制青蒿琥酯納米粒在體外具有較好的緩釋性，對腫瘤細胞有較強的抑制作用。

【關鍵詞】 青蒿琥酯；白蛋白納米粒；正交試驗；MTT試驗

【中圖分類號】R285.5 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2016）24-0033-04

青蒿琥酯（Artesunate，AS）化學名為二氫青蒿素-1，2-α-琥珀酸單酯，分子式為 C19O8H28，分子量384，是具有倍半萜結構的抗瘧藥青蒿素的衍生物。研究發現[1-2]，青蒿琥酯除抗瘧外，尚有治療其它寄生蟲病、抗腫瘤等作用。目前，臨床使用的主要有青蒿琥酯片劑、青蒿琥酯的粉針劑。但是青蒿琥酯的口服片劑不能克服肝臟的首過效應，吸收程度較差；粉針劑吸收快、消除也快、生物利用度小。研究通過納米給藥系統對青蒿琥酯的現有劑型進行改進，可以克服 AS 現有劑型存在的缺陷，提高其生物利用度，增加藥物療效。并且對其抗腫瘤活性進行初步研究。牛血清白蛋白（BSA）來源于血漿，溶解度高而且安全穩定又無毒。筆者以青蒿琥酯為原料藥，以BSA作為載藥材料，采用去溶劑化-交聯法并通過正交試驗選取最優處方，制備出青蒿琥酯BSA納米粒，現報道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器 KQ-300E型超聲機（昆山市超聲儀器有限公司）；旋轉蒸發器 （Sigma-aldrich）；WH-2微型渦旋混合儀（上海滬西分析儀器廠）；UV-2450紫外可見分光光度計（日本島津公司）；萬分之一電子天平（日本島津公司）；恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠）；透析袋（MV：1000-3000，美國spectrum 公司）；XD-101型倒置顯微鏡（日本 OLYMPUS公司）；全自動酶標儀（美國Bio-Rad公司）；Haier生物安全柜（青島海爾特種電器有限公司）；Thermo CO2培養箱（賽默飛世爾科技有限公司）；TDL-4型低速離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.2 試藥 牛血清白蛋白（BSA，FractionV SIGMA公司）；無水乙醇（分析純，天津永晟精細化工有限公司）；戊二醛50%水溶液（分析純，沈陽市華東試劑廠）；氫氧化鈉溶液（分析純，沈陽市華東試劑廠）；青蒿琥酯（AS，中國藥品生物制品檢定所）；A549細胞（遼寧醫學院科學實驗中心）；胎牛血清（沈陽鼎國生物技術有限公司）；DMEM（高糖培養基，沈陽鼎國生物技術有限公司）；胰蛋白酶（沈陽鼎國生物技術有限公司）；PBS（沈陽鼎國生物技術有限公司）；MTT（沈陽鼎國生物技術有限公司）；細胞培養瓶（美國康寧公司）；96孔板（美國康寧公司）；所用水為去離子水。

2 方法

2.1 青蒿琥酯標準試液配制 精密稱取干燥至恒重的青蒿琥酯250.0mg置50mL容量瓶中，加0.02%NaOH至刻度，搖勻，制得5mg/mL的青蒿琥酯貯備液。

2.2 測定波長的選擇[3] 準確移取青蒿琥酯標準試液0.2mL置于10mL容量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻。將制得溶液在50℃水浴加熱30min后，以無水乙醇為空白對照，變化波長在200～600nm，測定吸光度A。結果表明在238nm時，具有最大A值，所以確定238nm為最大吸收。

2.3 青蒿琥酯標準曲線的繪制[4] 精密吸取青蒿琥酯標準試液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mr分別置于10mL容量瓶中，加0.02%NaOH至刻度，搖勻制得溶液，50℃水浴加熱30min。以無水乙醇為空白對照，在238nm波長處測定吸收度，以吸收度A、濃度C繪制標準曲線。并求出回歸方程為：A=0.0431C+0.00067（r2=0.9999），青蒿琥酯溶液在0.5～3.0mg范圍呈線性關系。

2.4 青蒿琥酯白蛋白納米粒的制備 將一定質量的BSA溶于500μL水中，在渦旋的情況下，緩慢滴加含有青蒿琥酯的無水乙醇溶液，至出現乳光后，滴加 0.2%戊二醛，繼續渦旋至混勻，一定時間后旋轉蒸發除去乙醇，真空干燥處理即得青蒿琥酯白蛋白納米粒。

2.5 正交試驗設計 在青蒿琥酯白蛋白納米粒制備中的過程中，影響青蒿琥酯包封率的主要因素為BSA質量（A）、青蒿琥酯濃度（B）和旋蒸轉速（C），見表1。采用三因素三水平的正交試驗表L9（33）設計試驗方案。

2.6 青蒿琥酯白蛋白納米粒包封率測定 按正交試驗表L9（33）安排實驗，9種不同方式制備的青蒿琥酯白蛋白納米粒，將各BSA納米粒溶液于4 ℃超速離心（20000r/min）0.5h，收集超速離心后的上清，沉淀即為納米粒，將沉淀透析24h以與游離青蒿琥酯分離，隨后真空冷凍干燥即可得到青蒿琥酯BSA納米粒。空白BSA納米粒除不加藥物外，其余同法制備。均以水為空白對照在238nm波長處測定吸收度，將測得的吸光度代入回歸方程A=0.0431C+0.00067（r2=0.9999），根據公式分別計算每種青蒿琥酯BSA納米粒包封率（EE%）。

包封率%=W投藥總量-W上清液中藥物含量W投藥總量×100%

2.7 正交試驗數據分析 根據直觀分析和方差分析，找到青蒿琥酯白蛋白納米粒制備的最優條件。

2.8 青蒿琥酯白蛋白納米粒釋放度測定 在最優制備條件下制得青蒿琥酯白蛋白納米粒，然后分別精密稱取載藥白蛋白納米粒凍干粉和原料藥適量，置于分子量1000～3000的透析袋中系好，置于加有 50 mLPBS（pH7.4）的具塞錐形瓶中，以100 r/min 的振蕩頻率于 37℃下水浴振搖，在不同時間點（0.5、1、2、4、6、10、12、18、24 h）取透析液 5mL，超速離心取上清液，同時補加等量新鮮PBS。通過紫外吸收進行含量分析，計算出不同時間點的累計釋放量。取3份樣品平行實驗，所得結果繪制累積釋放率時間曲線，比較青蒿琥酯白蛋白納米粒與原料藥體外釋放行為。

2.9 穩定性試驗 將制備好的BSA納米粒在4℃冰箱中進行長期放置，并于3、6、9個月進行觀察。

2.10 青蒿琥酯白蛋白納米粒體外抗腫瘤活性初步研究

2.10.1 納米粒的細胞活性檢測（MTT） 根據活細胞可以還原 MTT 降解成具有紫色的甲瓚結晶，而凋亡細胞無法還原 MTT 就會造成兩種細胞在 490nm 處光密度值有差異。

2.10.2 細胞培養 取對數生長期的人肺癌細胞 A549 細胞，先棄去原有培養液，加入2～3mL的PBS清洗，加入2mL的胰蛋白酶，待細胞變圓后，立即加入0.2mL的血清和2mL DMEM 終止消化，吹打混勻移至 10mL圓底離心管，1200r/min離心3min，棄上清液，加 PBS 清洗一次，加入培養液重懸。按每5×103個/孔的密度將細胞懸液接種到 96 孔板中，過夜培養。

2.10.3 青蒿琥酯BSA納米粒的體外細胞活力 待96孔板內的細胞貼壁伸展后，將稀釋好的藥物以每孔100μL的體積加入孔中。其中，青蒿琥酯原料藥和青蒿琥酯BSA納米粒中青蒿琥酯的濃度分別為5、10、20、30、40ug/mL，并設5個平行孔。加入藥物后放于培養箱。在24h時在每孔中加入20μL的MTT溶液和80μL的DMEM繼續培養4h，隨后棄去孔中液體，加入100μL二甲基亞砜，置于搖床上15min，使紫色結晶物充分溶解，用酶標儀在 490nm 處進行光密度值的檢測。為了排除BSA納米粒載體材料對細胞活力的干擾，筆者使用與青蒿琥酯BSA納米粒同等量的空白BSA納米粒進行MTT實驗。

3 結果

3.1 正交試驗結果 根據表1進行正交實驗結果。見表2。

3.2 正交試驗結果分析 為了確定顯著性因子，對表2進行方差分析和顯著性檢驗。結果見表3。

直觀分析和方差分析結果表明，三種因素對青蒿琥酯白蛋白納米粒的包封率影響大小依次為A>C>B。A、B和C因素對青蒿琥酯白蛋白納米粒的制備均有統計學意義（P<0.05），由此得出制備青蒿琥酯白蛋白納米粒的最佳條件為A2B1C3，即取500μL濃度為35mg/mL的牛血清白蛋白水溶液，在渦旋的情況下滴加濃度為500μg/mL的青蒿琥酯無水乙醇溶液，待溶液變成乳白色后，停止滴加，置于旋蒸儀上設置轉速為1000r/min，時間為30min。

3.3 青蒿琥酯BSA納米粒的體外釋放 由圖1可知，青蒿琥酯原料藥在4h，累計釋放率為（91.0±2.1）%，基本釋放完全。而青蒿琥酯BSA納米粒的體外釋放體現出兩相形式，前 4 h藥物累積釋放率為（46.5±3.7）%，屬于快速釋放；4 h 后釋藥平緩，24 h 累積釋放率為（92.3±6.6）%，為緩慢低速釋放，說明納米粒具有明顯的緩釋作用。

3.4 青蒿琥酯BSA納米粒穩定性實驗 青蒿琥酯BSA納米粒在第3、6個月時納米粒沉降，手搖即可分散；9個月時納米粒沉降，渦旋即可分散。綜上所述白蛋白納米粒穩定性尚可。

3.5 BSA納米粒的體外抗腫瘤活性 載體材料為牛血清白蛋白，通過MTT實驗證明24h內BSA納米粒對A549細胞幾乎無影響，充分證明了其具有無毒性的特點。由圖2可知，青蒿琥酯BSA納米粒對腫瘤細胞的抑制率明顯高于青蒿琥酯原料藥。

4 討論

研究主要考察了牛血清白蛋白質量，青蒿琥酯濃度，旋蒸轉速及時間這3個因素對納米粒包封率的影響，采用正交試驗和方差分析篩選出了制備青蒿琥酯白蛋白納米粒的最佳工藝條件。 隨后對青蒿琥酯白蛋白納米粒的釋放性能進行了檢測，從整個釋放過程可以看出，白蛋白納米粒能夠使藥物長時間維持在穩態濃度，能夠起到控制藥物緩慢釋放作用，使藥物在體內作用時間更長。隨后又通過穩定性實驗得出納米粒穩定性較好，通過檢測其在體外對腫瘤細胞的抑制實驗發現，空白白蛋白納米粒對細胞無任何毒性，因為青蒿琥酯白蛋白納米粒比青蒿琥酯原料藥的攝取效果好，藥物被納米粒載體包裹后由于內吞作用容易透過細胞膜，開始時青蒿琥酯濃度較高，對細胞有顯著作用，但隨著時間的增加，青蒿琥酯逐漸被代謝消失，而青蒿琥酯經白蛋白包裹成納米粒后，則始終保持一定的濃度釋放，可以防止藥物被迅速代謝，延長作用時間。所以青蒿琥酯納米粒組在24h時細胞抑制率大于青蒿琥酯原料藥。由于納米粒本身具有被腫瘤細胞吞噬的作用，所以載藥納米粒對細胞的殺傷力要大于原藥。說明青蒿琥酯白蛋白納米粒有更明顯的抗腫瘤活性。

參考文獻

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[3]黃君麗，詹利之，林燕芳，等.UV法測定青蒿琥酯軟膠囊中青蒿琥酯的含量[J].中藥材，2002，35（10）：1693.

[4]侯海霞，周莉玲，李銳.青蒿琥酯紫外分析法的研究[J].中國新藥與臨床藥理，2000，11（2）：113-115.

（編輯：陶希睿）