黎藥經驗方的致突變試驗研究

周星+高香奇+符欣蕙

【摘 要】 目的：考察黎藥經驗方的遺傳毒性。方法：致突變試驗采用鼠傷寒沙門菌回復突變試驗（ Ames 試驗）、小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗和小鼠精子畸型試驗等三項試驗。Ames 試驗：設受試物5個劑量組（即5.000、1.000、0.200、0.040、0.008mg/皿），另設未處理對照組、溶劑對照組和陽性對照組； 微核試驗：小鼠50只，雌雄各半，設10、5.0、2.5 g/kg·bw 劑量組，另設溶劑對照和陽性對照組； 精子畸型率試驗：昆明種小鼠雄性25只，分組同微核實驗，檢測精子畸形率。結果：Ames 試驗中，加或不加 S9 的情況下，受試物對TA97、TA98、TA100和TA102菌株均未顯示致突變作用。與溶劑對照組比較，高、中、低3個劑量的受試物組雄性、雌性小鼠微核試驗、小鼠精子畸變率差異無統計學意義（P>0.05）。結論：綜合考慮前期試驗結果及相關研究，在本次實驗條件下，在一定劑量范圍內，Ames 試驗、 微核試驗和小鼠精子畸變試驗結果顯示陰性，認為該黎藥經驗方具有遺傳毒性的可能性較小。

【關鍵詞】 驗方；黎族；致突變；遺傳毒性

【中圖分類號】R29 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2016）24-0043-03

Abstract：Objective To study the mutagenesis caused by sproved recipe of the Li.Methods Ames test Test substance groups of 5.000 mg /dish，1.000，0.200，0.040 mg /dish and 0.008 mg /dish and three control groups（untreated，solvent and positive control） to detect the rechanged bacterium colonies.Micronucleus test 50 samples of the Kunming mice were randomly divided into positive control group，solvent control group and group of test substance 10.0g/kg，5.0g/kg，and 2.5g/kg.There were 10 in each group（male and female in half）.The micronucleus rate of bone marrow polychromatic erythrocyte were detected； Sperm malformation rate test 25 samples of the Kunming male mice， designed the groups as micronucleus test， were testing the rate of sperm abnormality.Results Comparing with control group，bone marrow cell micronucleus rate and sperm malformation rate of high，middle and low test substance groups of mice，what had no statistical significance（P>0.05）. Compared with the untreated group，different doses of test substance Ames strains from the back variables did not change significantly （P>0.05）. Conclusion Considering the preliminary test results and related research， under the conditions of this experiment and in the definite dose range，the three test results above show negative results. There is little possibility that test substance of proved recipe from the Li has mutagenesis.

Keywords：Proved Recipe；The Li；Mutagenesis； Genetic Toxicity

本黎藥驗方中所含的主要有雞血藤、補血藤、七葉蓮、牛大力等藥材。該方為黎族民間的經驗方，在黎醫指導下，用于調節婦女產后身體狀態并可促使其恢復體力。通過動物實驗發現該方能顯著延緩小鼠游泳至力竭的時間，發現其具有較強的延緩疲勞的作用，能有效提高運動耐力，具有抗疲勞功效[1]。其中主要藥材雞血藤、牛大力等在南方民間食療療中具有歷史悠久。對牛大力的本草考證上發現其始載于《生草藥性備要》，是《廣西中藥材標準》（1990年版）收載的地方藥材[2]，補腰腎、強筋骨功效顯著[3]。雞血藤是一味活血化瘀中藥，能補血、活血、通絡；主治月經不調、血虛萎黃、麻木癱瘓等[4]，藥理實驗研究表明有顯著的補血作用[5]。近年來，黎族驗方中常見藥材雞蛋花通過高內涵體外微核實驗和Ames實驗發現還具有較強的抗突變活性[6]。但民族藥物來源復雜，部分藥材還未收入地方藥材標準，故對其開展相關毒理學研究具有重要意義。本研究按黎醫采用傳統煎煮工藝得到的湯劑作為受試物，以小鼠為實驗動物觀察該藥的致突變作用，旨在為黎族驗方的使用安全性評價提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試物和試驗菌株 黎藥驗方受試物（以下簡稱“受試物”，藥材由五指山黎族民間醫藥研究協會提供，按其提供方法得水煎液并濃縮到一定濃度）；Ames試驗用鼠傷寒沙門菌組氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102菌株（海南省藥物研究所保存）。

1.1.2 實驗動物 無特定病原體（SPF）級KM小鼠50只（25～30g，雌、雄各半）、性成熟雄性KM小鼠25只（30～35g）[海南省藥物研究所提供，生產許可證號：SCXK（瓊）2015-0007]。動物于屏障系統動物實驗室飼養[使用許可證號SYXK（瓊）2014-0025]，溫度為（24.0±1.5）℃，濕度為（60±10）%，工作照度為200l～300lx，人工照明、黑夜12h交替，噪音<60dB，檢疫3d后進行實驗。飼養環境和飼料標準均遵循國家相關標準[7-8]。

1.2 方法

1.2.1 鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗（Ames試驗） 采用平板滲入法對樣品進行測試，分別在加與不加大鼠肝S9系統的條件下進行試驗。鼠傷寒沙門菌突變菌株TA97、TA98、TA100和TA102經鑒定符合要求。設5個劑量：5.000、1.000、0.200、0.040、0.008mg/皿，使用蒸餾水稀釋。同時設未處理對照組、溶劑對照和陽性對照組。在頂層培養基中加入0.1mL試驗菌株增菌液、0.1mL試驗用受試物溶液和0.5mL肝臟混合功能氧化酶（S9混合液），混勻后倒入底層培養基平板上，每個劑量6個平皿；（37±1）℃培養48h，計數每皿回變菌落數[9]。

1.2.2 小鼠骨髓細胞微核試驗 體重25～30gKM小鼠50只，隨機分為5個組，每組10只，雌雄各半，以受試物對小鼠的急性經口毒性試驗最大給藥量結果（10g/kg，以流浸膏計）為依據，試驗設受試物3個劑量組（即10、5.0、2.5g/kg·bw）、陽性對照組（灌胃40mg/kg環磷酰胺）、溶劑對照組（滅菌水），間隔24h，2次灌胃，給藥體積為0.2mL/10g，末次給予受試物6h后，取胸骨骨髓制片，每只動物觀察1000個嗜多染紅細胞（PCE），計數含帶微核的細胞數，計算微核率（‰）。同時計數200個細胞中嗜多染紅細胞和正染紅細胞（NCE）比例[10]。

1.2.3 小鼠精子畸形試驗 體重30～35g雄性KM小鼠25只，隨機分為5個組，每組5只，分別為受試物3個劑量組（即10、5.0、2.5g/kg·bw）、陽性對照組（灌胃40mg/kg環磷酰胺）、溶劑對照組（蒸餾水），每日灌胃1次，連續5d，末次灌胃30d后處死小鼠，取附睪制片，每只動物觀察計數1000個結構完整的精子，計數畸形精子數，計算精子畸形率（%）[11]。

1.3 統計學處理 數據采用SPSS 11.5軟件進行統計分析，計量數據采用（x[TX-*3]±s）表示，采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 受試物致突變作用 各菌株不同陽性對照回復突變菌落數均遠超溶劑對照和未處理對照突變菌落數，表明試驗體系可靠。在檢測劑量范圍內，加或者不加S9的情況下，受試物對4個菌株均未顯示誘變作用。見表1。

2.2 受試物對小鼠骨髓PCE微核率影響 與溶劑對照組比較，各劑量受試物組小鼠骨髓PCE微核細胞率差異無統計學意義（P>0.05）；與溶劑對照組比較，陽性對照組小鼠骨髓PCE微核細胞率明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）；各組小鼠PCE/NCE比值差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

2.3 受試物對小鼠精子畸形率影響 溶劑對照組、受試物3個劑量組（即10、5、2.5g/kg）、陽性對照組小鼠精子畸形率分別為（0.95±0.35）%、（1.02±0.38）%、（1.19±0.27）%、（1.11±0.48）%、（2.96±0.97）%；與溶劑對照組比較，陽性對照組小鼠精子畸形率明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05），受試物各劑量組小鼠精子畸型率比較差異均無統計學意義（P>0.05）。

3 討論

Ames試驗、小鼠精子畸形試驗和小鼠骨髓微核試驗作為遺傳毒性檢測試驗常用經典組合。Ames試驗檢測終點為基因突變，是由美國生化學家BruceN.Ames在1975年建立的鼠傷寒沙門菌回復突變試驗，是一種已被公認并廣泛開展的致突變鑒定方法。此方法能夠在短期內檢測藥物、食品、化學品、醫療器械等受試物有無致突變性。小鼠精子畸形試驗檢查受試物能否對破壞哺乳動物精子正常形態。體內微核試驗能夠檢測斷裂劑和部分非整倍體誘變劑。

有些中草藥具有延緩并消除疲勞、改善激素分泌、提高免疫能力等多種作用，又與運動關系密切。所以，開發中草藥運動補劑對提高運動能力、對改善人體功能有重要意義。前期已有研究表明該黎族驗方具有抗疲勞作用的效果，且該方在海南黎族地區應用較多，故進行遺傳毒性的相關考察具有重要意義。

研究結果表明，與溶劑對照組比較，受試物各劑量組小鼠骨髓微核細胞率和精子畸型率均無明顯變化，提示其對小鼠體細胞和生殖細胞均無誘變作用。Ames試驗結果顯示，受試物各劑量組受試菌株（TA97、TA98、TA100、TA102）在加S9與不加S9時回變菌落數均未超過未處理對照菌落數的2倍，提示該受試物無間接和直接的致突變作用。

綜上所述，在一定劑量范圍內，該黎藥驗方無致突變和致畸作用。感謝五指山黎族民間醫藥研究協會及楊麗娜女士提供該黎族驗方。考慮到本研究所用動物種類局限性，還應擴大實驗動物種屬，增加其他實驗項目進一步探討其遺傳毒性，以確保人體服用的安全性。

參考文獻

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（編輯：陶希睿）