人EGFR突變基因檢測試劑注冊申報問題解析

人EGFR突變基因檢測試劑注冊申報問題解析

【作 者】吳傳松1，黃杰2，安娟娟1，鄧剛1

1 國家食品藥品監督管理總局醫療器械技術審評中心，北京市，100044 2 中國食品藥品檢定研究院，北京市，100050

腫瘤個體化治療相關突變基因檢測試劑快速發展，其中，人表皮生長因子受體（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）突變基因檢測作為腫瘤個體化治療的分子靶標受到普遍關注。該文將通過對過往人EGFR突變基因檢測試劑注冊申報過程中存在的常見問題進行解析，闡述該類問題的解決辦法，希望對從事該類產品注冊申報的行業人員提供參考和幫助。

人表皮生長因子受體；突變基因

0 引言

人EGFR突變基因檢測試劑主要是指基于位點特異熒光-核酸聚合酶鏈式反應（ARMS-PCR法）、基因測序方法等技術，以EGFR突變基因序列為檢測目標，體外檢測人體病理組織和/或外周血等樣本。研究表明EGFR突變基因在多種腫瘤細胞中存在，這些突變基因是腫瘤患者是否對TKI敏感的預測因子且被認為是TKI治療的有效預測指標[1]。EGFR突變基因主要發生在胞內酪氨酸激酶（TK）區域的前四個外顯子上（18～21）[2]。隨著一代EGFR-TKIs治療藥物的使用，也發現了一些可能的耐藥突變，如發生在外顯子20上的替代突變T790M[3-4]。針對這些耐藥突變，目前也開發了一些新型藥物，如針對T790M耐藥的新藥物等[5]。此外，還有許多類型的突變臨床意義尚不明確。

1 人EGFR突變基因檢測試劑注冊審評現狀

在我國，依據《體外診斷試劑注冊管理辦法》[6]關于產品分類的要求，該類產品按照第三類產品進行管理。在美國FDA，人EGFR突變基因檢測試劑被歸為體細胞突變基因檢測系統，按照上市前審批（PMA）管理。目前我國該類上市產品已有十幾家。檢測人EGFR突變基因的方法學主要有位點特異PCR熒光探針法、基因測序法、數字PCR法等，不同方法學之間在檢測性能方面也存在明顯差異[7-10]。

2 人EGFR突變基因檢測試劑申報過程中常見問題

2.1 人EGFR突變基因檢測試劑說明書預期用途

目前申報該類產品說明書中存在預期用途指向不明確，表述不清晰等問題。申請人需規范預期用途表述形式，結合該類產品臨床評價數據與個體化診療藥物聯合治療情況客觀描述產品預期用途。依據《體外診斷試劑產品說明書指導原則》要求，預期用途需明確該類型產品樣本類型，生物學標志物，定性或定量等內容。申請人需規范EGFR不同突變基因型別表達形式，明確產品外顯子、突變位點、cosmic代碼等信息。

申請人需針對自身完成的藥物診療個體化伴隨檢測研究工作，明確申報產品是否聯合伴隨藥物進行聯合臨床研究。對于申報試劑伴隨具體治療藥物聯合進行臨床試驗研究，并證明兩者伴隨使用具有顯著的臨床治療意義，需在說明書中明確具體藥物及生產企業，并簡要介紹相關臨床患者受益情況。如靶基因突變與腫瘤疾病及治療方案的相關性描述來自治療指南、書籍、文獻等資料，則在本項下注明參考資料的出處。

產品說明書預期用途中，申請人需對EGFR突變基因檢測進行臨床背景介紹，包括檢測相關適用人群特征、腫瘤組織樣本類型、EGFR突變基因序列相關信息，EGFR突變基因及其表達蛋白在非小細胞肺癌發生、發展過程中可能起到作用，相關藥物或其他治療技術及其作用機理、與待測突變位點可能存在關系等[11]。

2.2 人EGFR突變基因檢測試劑臨床研究

研究表明[12]，EGFR突變基因被檢測人群之間存在種族差異。亞裔人群中非小細胞癌患者EGFR突變基因陽性率明顯高于高加索人群EGFR突變基因陽性率。但目前我國人群腫瘤突變基因數據庫相對缺乏，無論是境外申請人還是境內申請人進行人EGFR突變基因檢測試劑注冊申報前均需完成我國境內臨床研究資料，滿足《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》要求，且每種基因型需完成一定病例數的陽性樣本。盡管人EGFR常見敏感突變基因在肺腺癌中是EGFR-TKIs的陽性預測標志物，但罕見EGFR突變基因流行病學以及對預后和TKIs療效的影響是未知的[13]。在臨床試驗過程中，如申報產品中部分突變基因類型未在非小細胞肺癌人群中檢出，可能與該部分突變基因在我國人群突變頻率較低或總樣本人群選擇存在偏倚有關。針對該類問題，建議申請人擴大臨床樣本人群或根據不同突變基因突變頻率特點，增加不同地域的臨床研究機構，提高這部分突變基因陽性檢出率。

2.3 人EGFR突變基因檢測試劑檢測人外周血樣本

目前申報產品中最為常見的樣本類型以中性福爾馬林固定石蠟包埋病理組織(FFPF)為主，且FFPF是獲取腫瘤突變基因信息的主要方式，但大部分晚期非小細胞肺癌患者已失去手術機會或因其他原因不能獲取腫瘤FFPF樣本。研究結果表明，隨著腫瘤細胞的凋亡，腫瘤游離DNA（ctDNA）片段釋放到人體血液循環中，通過對外周血腫瘤游離DNA的檢測解讀，可以更好地了解腫瘤病情的發展情況以及尋找適合的治療方案，尤其對于那些無法通過手術取得腫瘤組織或希望在治療后對病情進行跟蹤隨訪的人群，是一種理想和有效的檢測手段。病理組織和外周血樣本相比，主要相同點在于臨床肺癌晚期病人中采集同源性病理組織樣本和外周血樣本均能檢測EGFR突變基因。但由于血液游離DNA含量及變異情況會隨著腫瘤病情的發展、轉移性腫瘤的發生、以及用藥治療情況發生實時的變化，外周血檢測EGFR突變基因檢測結果存在一定的不確定性。兩種樣本在用于人肺癌的分子靶向治療（EGFR-TKI）治療效果也存在差異。

鑒于上述原因，人EGFR突變基因檢測試劑如適用于外周血樣本檢測人群，預期用途需限定為晚期非小細胞肺癌（NSCLC）樣本患者，且作為不能獲取NSCLC樣本時的補充手段。鑒于病理組織樣本和外周血樣本中EGFR突變基因比例不同，申報產品需分別滿足檢測外周血樣本和病例組織樣本最低檢出限要求。

2.4 人EGFR突變基因檢測試劑適用樣本采集儲存

病理組織樣本需詳細介紹組織學樣本類型，包括樣本來源及取材要求、組織標本采集厚度、樣本處理方式（如組織樣本的固定及包埋方式）、腫瘤細胞比例等。在進行核酸序列檢測前，需對用于腫瘤組織突變基因檢測的標本進行確認，并富集可能存在突變基因的腫瘤細胞。腫瘤細胞所占比例需達到所用擴增檢測方法的要求。

外周血樣本采集后，需規定外周血樣本存放條件以及對存放時限及溫度設置等進行驗證，包括采用加入抗核酸降解的采血管要求。樣本采集管保存管中所用的防腐劑、抗凝劑、保護劑等輔助成分不應對基因序列擴增產生干擾。血液通常需要先進行抗凝保存，抗凝劑的選擇很重要。申請人需對抗凝劑、防腐劑、保護劑等成分進行驗證。

因晚期肺癌患者外周血樣本中EGFR突變基因含量相對較少，建議增加外周血樣本提取總量和采取相應富集的方式進行核酸提取純化。從而保證外周血樣本中EGFR基因片段被提取的機率增大。同時，需保證核酸提取工藝，減少核酸損耗和降解。申請人需對外周血全血保存時間及溫度，離心參數設置等進行驗證。因ctDNA含量低，為提高EGFR突變基因檢出率，在患者身體條件允許的情況下，推薦增加血漿采集量。抽血后需盡快分離血漿，延遲血漿分離將導致血液中血細胞的裂解，釋放出大量人基因組DNA（gDNA）至血漿中；增加的gDNA會稀釋腫瘤細胞來源的ctDNA，使得突變基因難以檢出。因此，在外周血標本收集、運輸及貯存過程中，需有效避免游離DNA降解；同時，還需防止血液中白細胞裂解，避免因野生型游離DNA增加導致ctDNA中EGFR突變基因比例變小，可能導致EGFR突變基因檢測結果假陰性[14]。

2.5 人EGFR突變基因試劑注冊申報中其他常見問題

2.5.1 人EGFR突變基因檢測試劑產品技術要求

申請人在設置企業內部參考品時，因考慮不同樣本類型之間存在的差異情況，根據不同樣本類型及突變基因型分別設置企業內部參考品。申請人在制定產品技術要求時，也需考慮不同樣本類型及不同突變基因型的性能評價要求和檢驗方法。

2.5.2 申請樣本類型許可事項變更事項

如申請人在人EGFR注冊產品原有病理組織樣本檢測基礎上增加外周血樣本類型，申請人需考慮外周血樣本類型與病理組織樣本類型中人EGFR突變基因片段長度，樣本中EGFR突變基因比例等差異。申請人需依據法規要求提交適用樣本變更申報資料，同時還需提交申報試劑擴增反應體系性能研究、適用于外周血樣本的人EGFR突變基因檢測試劑分析性能評價、外周血樣本保存及處理等研究資料。

3 結論

人EGFR突變基因檢測目前是EGFR-TKIs治療的重要檢測靶點，隨著核酸檢測技術的發展，如：BEAMing技術、數字PCR、高通量測序技術運用于腫瘤個體化治療相關突變基因檢測越來越受到臨床專家和行業研究人員的關注。面對目前臨床常規成熟且推薦的檢測技術，新的檢測技術如何定位。臨床個體化應用與臨床個體化研究兩者存在差異，臨床轉化醫學研究如何有效轉化為臨床應用，都將是今后注冊審評關注重點。產品使用過程中也不能忽視操作人員對檢測結果影響。從樣本采集及預處理、檢測過程中防污染措施、檢測結果多因素分析等，都需要有經驗的專業人員操作。因此，對操作人員的相關培訓不能忽視。希望通過本文對人EGFR突變基因檢測試劑申報過程中常見問題的梳理，幫助申請人減少注冊申報資料中的問題，提升該類產品注冊申報資料質量。

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Resolved Problems of EGFR Mutation Detection Reagent Registration Application

【 Writers 】WU Chuansong1, HUANG Jie2, AN Juanjuan1, DENG Gang1
1 Center for Medical Devices Evaluation of CFDA, Beijing, 100044 2 National Institute for Food and Drug Control, Beijing, 100050

human epidermal growth factor receptor, gene mutation

widespread attention. In this paper, through analyzing the common problems of human EGFR gene mutation detection reagent present during the past registration application. This paper describes a solution of such problems. We hope to provide information and help for relevant personnel engaged in such products registration application.

1671-7104(2017)04-0289-03

2016-11-25

吳傳松，E-mail: cswu2010@126.com

F203；R362

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2017.04.015

【 Abstract 】Cancer treatment-related gene mutation detection reagent develops rapidly especially, human Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) gene mutation as a molecular target for cancer therapy has