實質性派生品種鑒定方法研究進展

褚云霞,陳海榮,鄧 姍,黃志城,李壽國

(上海市農業科學院農產品質量標準與檢測技術研究所,上海201403;農業部植物新品種DUS測試(上海)分中心,上海201415)

《種子法》自2000年頒布實施以來,在推動種子市場化、規范化方面起到了巨大的作用。為了推進改革、轉變政府職能、充分發揮市場作用,完善知識產權保護、品種審定制度,全國人大主導了《種子法》修訂。按現有制度,通過體細胞克隆、系統選育、基因導入、人工誘發基因突變或采用連續回交等簡單方式取得的派生系品種同樣可以申請植物新品種權,這損害了原始品種權人的利益,降低了原始育種創新者的積極性。政協十二屆全國委員會第三次會議第4514號(農業水利類389號)提案提出在《種子法》修訂中強化“實質性派生品種和收獲物的保護”。但是由于全國人大常委會對此條的爭議較大,因此最終通過的修正案并未采納這一提案。實質性派生品種(Essentially derived varieties,EDV)保護規則是UPOV1991文本與1978文本的重要區別之一,也是UPOV強化保護植物新品種權人的合法權益、應對生物育種剽竊的一項有力措施[1]。隨著國際上越來越多的UPOV成員國開始執行1991年文本,UPOV、其他國家以及我國的眾多育種家都希望中國盡早加入UPOV 1991文本。目前我國實質性派生品種很多,如無性繁殖的觀賞植物或果樹主要依靠突變和遺傳修飾等方法培育新品種,很多新品種為EDV;水稻(Oryza sativaL)、小麥(Triticum aestivumL)等新育成品種遺傳背景同質化嚴重、模仿重復多,從第56期《農業植物新品種保護公報》中可以看出,在不到2個月時間內,初審合格的24個水稻申請品種中可能一半為實質性派生品種[2]。為了保護原始育種,提高育種水平,盡快滿足加入UPOV1991文本的要求,我國實行EDV保護是新品種保護發展的必然趨勢。

目前已有包括荷蘭、美國、韓國、日本、澳大利亞、歐盟在內的56個國家及組織實施EDV保護規則[3],UPOV與各相關國家限于技術原因,沒有就如何判斷EDV制定詳細的標準。總結不同國家或國際組織對EDV的判定經驗,可為中國建立EDV保護制度提供技術支撐。

1 EDV概念

UPOV 1991第14條第5款提出了EDV這一概念,將由原始品種實質性派生,或者從實質性派生品種產生,保留了原始品種基因型或基因型組合產生的基本特性,與原始品種有明顯區別,即存在表型上的差異的品種稱為EDV[4]。EDV產生方式有多種,如天然或人工誘變、體細胞變異和基因工程等,對于實質性派生品種的判斷,主要取決于品種間遺傳組成的相似程度,而不論產生新品種的育成方式。如香石竹(Dianthus caryophyllusL.)突變產生的品種與原始品種可存在多個性狀的差異。作為EDV,具有以下特征[3]:第一,來源于一個原始品種或派生品種,并且不是原始品種與另一個品種通過雜交獲得。換句話說,就是EDV必須是一個品種內進行培育的結果。第二,EDV與原始品種的基因型非常相似,除了實質性派生所具有的區別性差異外,幾乎完全相同。第三,具有特異性,如果不能與原始品種進行區別,就不能成為一個新品種。第四,原始品種應該是受保護的品種,如果原始品種不是受保護品種,則EDV的判定沒有任何意義。

2 EDV鑒定方法

盡管UPOV分別從法律和技術角度對EDV進行了界定,但在實踐中歐盟各成員國對于EDV的舉證有不同的做法[3]。通常情況下,由原始品種的育種者證明被指控的品種是從他的品種實質性派生而來,而歐盟的一些國家法院有時會認為由被告證明品種間不存在派生行為顯得更為容易。也就是說由原始品種權人還是EDV權人舉證證明EDV的問題,還沒有達成共識。

判斷一個品種是否為實質性派生品種,主要決定于品種間遺傳組成的相似程度,需要通過植物的表型特征和基因型特征來評價。多種方法都可驗證兩個品種間是否存在派生關系,如評估品種間的雜種優勢情況或利用形態標記、分子標記等計算遺傳相似系數甚至可以通過分析品種系譜圖進行推斷。

2.1 品種系譜分析法

理論上講可以通過計算品種間的親緣系數(f系數)來評價派生關系[5]。f系數是法國數學家Gustave Malecot提出的一種間接測量兩個個體的遺傳相似性的系數,指兩個個體一個位點上的等位基因來源于相同祖先的概率,f系數可以通過檢查詳細的家譜記錄計算。對于已知系譜信息的作物如小麥、水稻等,f系數分析是一種簡便的研究派生關系的方法,但這個過程需要品種的詳細系譜信息,而原始品種所有人通常并不知道這些信息,并且由于計算f系數是在假定父母本貢獻相同,所有祖先種、親本及其后代品種都是純合的,不存在選擇、突變和基因漂移等的基礎上的,所以計算并不能精確,因此該方法已很少應用。

2.2 雜交

通過評估假定的派生品種與原始品種間的雜種優勢情況也可證明品種間的派生關系。雜種優勢是指雜種一代在個體大小、生長勢、繁殖力、環境適應性以及品質、抗性等方面超過親本的一種遺傳學現象[6]。眾多研究發現,通常具有較遠的親緣關系的雙親雜交產生的子代具有較強雜種優勢,盡管對于遺傳距離與雜種優勢之間的相關性還沒有統一的結論,但在一定范圍內,親緣關系的遠近與雜種優勢強弱呈現出正相關,因此如果兩個品種間不存在派生關系,則雜種優勢應該非常明顯[7]。

2.3 形態方法

雖然基因型的研究是判斷實質性派生品種的有效工具,但是根據EDV的概念,一個EDV應該僅有一個或少數特征與原始品種有差異,而且這些差異性狀是由基因引起,在多數情況下,原始品種與派生品種間的差異與基因差異一致。因此,形態性狀可以作為判定派生品種的有效工具。遺傳學家和統計學家一致認為,使用形態學標記計算距離系數在技術上是可行的,然而這些距離并不總是反映遺傳距離或血統關系。此外,使用形態特征由于環境因素影響可能會更加困難,而且耗時長、成本高,不能真實的、準確的反應其后代的遺傳變異。如表型可以判斷,則不需再進行DNA檢測。如海牙地區法院于2005年審結的Astee Flowers v.Danziger案,這是各國法院第一個解釋 EDV的案例[8]。在本案中,法院檢驗了Blancanieves和Dangypmini的形態性狀,21個性狀有17個不同,依據外形上的差異,判定兩品種間不存在派生關系。審理過程中,法院沒有采用DNA指紋技術提供的證據,因為對這一案件來說,形態方法已經提供了充分證據,但很多情況下形態性狀的觀察并不能充分判斷一個品種是否為派生品種。

2.4 分子標記

分子標記技術的發展始于20世紀80年代,是直接在DNA水平檢測生物間的差異,是遺傳變異的直接反映,不受任何環境因素的影響,技術簡單、快速、易于自動化,因此近年來應該十分廣泛。由于實質性派生品種的鑒別更多的是從基因型角度進行鑒別,相比形態性狀,以基因組相似程度來判定較為可靠,也比較容易進行。分子標記可直接反映基因組相似程度,因此分子標記在鑒別實質性派生品種方面具有獨到的優勢,可以通過大量的標記篩選,指紋圖譜的比較,鑒別出兩者之間的細微差別并評價相互間遺傳關系。眾多的分子標記中,應用較多的是擴增片段長度多態性(Amplified fragment length polymorphism,AFLP)、簡單重復序列(Simple sequence repeat,SSR)以及單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphism,SNP)。

AFLP技術是1993年由位于荷蘭瓦赫寧根的Keygene公司創建的基于PCR的DNA技術[9]。AFLP技術是限制性片段長度多態性(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)和PCR相結合的一種技術,既具備了RFLP的穩定性、可靠性又具備了PCR反應的快速高效性,AFLP屬于第一代DNA技術,不需事先知道DNA序列信息,擴增的條帶多,多態性豐富,實驗重復性高,因此這種技術非常靈活,幾乎適用于所有作物。同時AFLP具有信息量大,速度快、成本低的優點,廣泛應用于遺傳多樣性分析、品種鑒定、圖譜的構建、親緣關系分析等,也較早用于鑒定EDV[10-11]。盡管AFLP技術比較陳舊,在育種強度高或遺傳基礎狹窄的作物上效果不好,生成大部分的DNA片段是單型的,沒有區分力,但它在基因組信息未知的作物中能很好地鑒定EDV。2004年Vosman等[11]用AFLP技術進行了月季(Rosa chinensis)EDV鑒定研究,結果表明所有的突變EDV相似系數在0.95—1,而非派生品種間的相似系數＜0.80,其中75%的品種對間相似系數＜0.50。Eeuwijk等[12]以46份大麥(Hordeum vulgareL.)品種為試材,用AFLP標記評價了回交親本與子代間的遺傳距離,認為應該將第二次回交子代與親本間的遺傳距離設為派生性評價的閾值。荷蘭海牙法庭2009的一個案件則采用了AFLP來進行派生關系的鑒定[13]。

經過比較,國際種子聯合會(International seed federation,ISF)認為SSR在派生關系鑒定方面更有效[14]。SSR標記或SNP標記是目前常用的檢測實質性派生關系的方法之一,通過特異性引物擴增待測品種的SSR區域,再通過電泳技術或測序檢測獲得片段的基因型,根據基因型,判斷待測品種間的關系。利用SSR標記鑒定派生的研究報道相對較多[15-17]。SSR得到的是片段的長度信息,具有高多態性、共顯性、可識別純合子和雜合子的優點,由于在染色體上的位置已知,因此可以選擇覆蓋整個基因組且均勻分布的標記。但也存在一些問題,如成本高、片段長度相差過小,可能檢測不到,即使是相同長度的片段,其內部的堿基組成也可能不一樣,但SSR同樣檢測不到。

近年來,大量投資和研究獲取了許多作物的序列信息,使簡單、低成本地系統地篩選特定位置的DNA成為可能。在此基礎上發展的SNP技術稱為第3代DNA分子標記,SNP具有操作簡單、快速、自動化等特點,可以區分兩個個體遺傳物質的差異。作物特有的SNP檢測芯片可同時揭示成千上萬的數據,使遺傳關系的評價更準確。而采用一代測序檢測SNP,更能獲得更精確的基因信息。

2.5 高通量測序

基因相似性的進一步研究是直接比較基因組序列。比較每品種的完整基因組序列或部分序列的方法叫做基于DNA序列的基因型分型。最近的一些論文表明在植物中該方法是可行的[18-19]。1977年Sanger法為代表的第一代測序技術推動了基因序列研究的發展,但其通量低,成本高、速度慢的缺點極大地限制了人類揭示基因奧秘的研究。經過不斷的技術開發和改進,2005年,Roche公司推出了454 FLX焦磷酸測序平臺開創了高通量測序(Next generation sequencing,NGS)技術的先河,隨后Illumina公司的Solexa,Hiseq技術和ABI公司的Solid技術相繼出現,標志著NGS的誕生[20]。雖然高通量測序技術建立的時間不長,但發展非常快,以其高輸出量與高準確性的特性,不僅提供了豐富的DNA序列信息,而且使得測序的費用降低和時間大大縮短。高通量測序不僅可以進行大規模基因組測序,還可用于基因表達分析、鑒定突變基因、轉錄組分析、非編碼小分子 RNA的鑒定、轉錄因子靶基因的篩選、DNA甲基化和鑒定實質性派生品種等相關研究。2015年方治偉等[21]申請了一項關于測試油菜品種實質性派生關系的發明專利,通過高通量測序和多位點擴增,實現了待測油菜品種內測試區域的大樣本抽樣,保證了實質性派生關系檢測的準確性。可以檢測測試區域所有SNP,還可以發現測試區域內SNP之外的變異,如重復數、缺失與插入等,這些都是單個SNP檢測無法發現的。

3 EDV鑒定標準

技術進步并不能自動解決EDV鑒定問題。為了區分EDV和非EDV,需要研究多深,遺傳相似性達到多少可以認為它可能為原始品種的實質性派生品種,這些問題始終存在。不論是形態標記還是DNA標記進行派生品種鑒定都需要確定實質性派生品種與原始品種間的最小相似系數和不具派生關系的品種間的最大相似系數。只要技術已經被證明是準確的,任何技術都可以用于鑒定派生品種。為了驗證技術的準確性,應考慮下列幾點[22]:

i.區分能力∕信息量:這取決于研究的廣泛性,包括參考品種的代表性。標記是否可能從非EDV中鑒定出EDV?可計算多樣性統計參數如PIC值、He、EMR、MI和Rp等來研究標記的信息量。隨機選擇的標記分析不應該導致不同的結論。

ii.樣本的代表性:不管用于遺傳相似性研究的DNA標記數量是多少,標記應均勻分布在基因組中并能代表品種的DNA含量,標記最好不要連鎖。

iii.重復性:所選的特定技術或DNA標記,具有相同DNA成分的品種基因圖譜應該相同。

iv.錯誤率:每一種技術或儀器或平臺都有其缺陷和不足,關鍵是能從實際遺傳多樣性中分辯出技術引起的誤差。這可通過重復樣品分析來獲取。EDV研究首先需要一個能評價作物遺傳多樣性的參考群體,其次需要EDV群體用于調查EDV和非EDV的遺傳相似性,同時需要選擇適當的標記方法。最后,需要確定計算遺傳相似性的方法。

到目前為止,已有使用不同的技術研究基因相似性的報道[15,23-28]。ISF公布了處理實質性派生品種糾紛的指南(見 http:∕∕www.worldseed.org∕isf∕edv.html)。另外ISF依據研究結果確立了部分作物[黑麥草(Lolium perenne)、玉米(Zea mays)、油菜(Brassica campestris)、棉花(Gossypium)和生菜(Lactuca sativa)]的EDV閾值。正如ISF所述,應該認識到,標記系統和特定的標記組合將隨著時間的推移和技術的發展而改變。作物的遺傳多樣性并不是一成不變的,而是隨著新品種的培育而不斷發展變化。因此,指南中所述閾值和測定技術應該定期檢查,必要時進行調整[22]。

3.1 實質性派生品種鑒定標準建立步驟

3.1.1 建立合適的研究群體

在建立鑒定標準前首先需要有一個好的研究群體用于評估作物遺傳多樣性。其次需要有EDV品種,用于比對EDV∕非EDV間的差別。

3.1.2 選擇標記方法

理論上講,所有研究遺傳相似性的方法都可用于派生品種鑒定,但選擇標記方法時應該考慮是否可以自由使用并解決ISF文件“技術專家提出的解決ISF EDV糾紛閾值設置的分子標記方法”中列出的幾個問題[29],如品種樣本量大小、標記的區分能力評價、哪種類型的標記可以使用,如果多種標記可用時還應給出優先順序,標記可用的最小標準等。

3.1.3 確定計算方法

計算遺傳相似系數的方法有很多,有Nei、Rogerst和Hedrick等[30],擴增條帶可以1∕0形式記錄也可以分子量大小來記錄,如果用樣品池作為研究對象時將出現一個位點多于2條帶的情況又該如何處理?選擇不同遺傳相似系數導致分析結果存在很大差異[31]。因此選擇恰當的計算方法對于準確鑒定派生關系尤為重要。

3.1.4 確定閾值

在所有ISF研究中使用了系譜清晰的品種對為研究對象。當調查遺傳多樣性時比對近似品種對是很重要的。閾值最好由作物育種者來決定,對遺傳多樣性和育種方法的更好理解有助于閾值的正確設置。育種方法本身不足以宣布一個品種就是EDV,但EDV判斷標準必須根據不同品種進行確定,無法對所有品種適用統一的EDV判定標準。

3.2 實質性派生品種鑒定標準

根據UPOV規定,滿足授權條件的品種可以被授予品種權,而不需判定新品種是否是EDV。而法院審理EDV案件時一般會結合特定植物品種確定EDV的判定方法和相應的證據提供責任。一般原始品種權利人需提供證據證明侵權品種可能是EDV,而一旦按鑒定標準進行鑒定發現親緣關系大于閾值時,則被告需證明自己的品種并非由原始品種派生而來。美國、德國、荷蘭、ISF和國際無性繁殖觀賞植物與果樹育種家協會(International Community of Breeders of Asexually Reproduced Ornamental and Fruit Varieties,CIOPORA)等國家和組織在實質性派生品種鑒定方面進行了大量探索性研究,ISF和CIOPORA還提供了在自愿基礎上用于解決有關EDV的爭端的解決方案,對各國育種產業產生了重要影響。

植物品種保護國際育種者協會(ASSINSEL,ISF的前身)飼料植物部在1997年開始進行多年生黑麥草EDV評價工具和標準研究,并于1999年提出評價標準初稿。該標準以AFLP為鑒定方法,確立了歐氏平方距離為7作為的臨時界限,數據來源于每品種的60個單株和5個引物組合[32]。2009年ISF重新形成了黑麥草實質性派生品種糾紛處理的指南(Guidelines for handling a dispute on essential derivation in ryegrass),改用SSR數據來計算相似系數,并將0.6設為EDV的閾值。

ISF作物部對不同作物進行了研究,分別設置了不同種類EDV的遺傳相似系數。如2004年、2007年和2014年分別發布了有關生菜、棉花和油菜、玉米的《實質性派生品種糾紛處理準則》,分別確定生菜Jaccard系數≥96%、棉花親緣系數≥87.5%、油菜Dice距離≥0.85、玉米Rogers’距離≥91%作為EDV判定的閾值[33]。在無性繁殖觀賞植物和果樹品種育種領域,所有的變異體、轉化子和單性繁殖植物,以及模仿品種都是EDV。找到一個可行的方法證明一個品種是另一個品種的EDV,是對觀賞植物育種者的挑戰。在EDV案件中,證明被指控品種是否為“實質性派生于”原始品種是極端困難的。CIOPORA認為被控品種與原始品種之間的Jaccard相似系數在0.90和1.00之間,那么其就完成了一個表面上證據確鑿的關于被控是EDV的證明。

4 討論

育種技術的發展,使得定向育種成為可能,也造成了大量EDV的出現。針對原始品種的缺陷對原始品種進行微修飾可以提高市場占有率,延長原始品種的壽命。另外,派生品種還能促進創新增長及品種多元化推廣,提高原始親本的遺傳貢獻,有利于提高農民福利。如我國大面積推廣的水稻品種中,推廣面積前10位的兩系雜交稻品種,大多是實質性派生品種[34]。但同時由于我國未實行派生品種保護,損害了原始品種權人的利益,降低了原始育種創新者的積極性,也造成修飾性育種的泛濫,不利于農業生產特性的真正改良。另外由于EDV與原始品種的高遺傳相似性,大量EDV的存在使遺傳基礎變窄,不利于進一步的遺傳改良,也可能對國家糧食安全構成嚴重威脅。派生品種泛濫的結果,必然會導致突破性品種越來越匱乏,育種創新減少的惡性循環。派生品種是我國需要解決的重要問題之一。適當的EDV鑒定方法是實行派生品種保護的技術支撐。建立EDV的鑒定方法時需考慮作物種類、本國農業發展水平、經濟水平特別是育種技術的水平以及遺傳基礎、鑒定技術水平等。對于系譜清楚的種如水稻、小麥系譜分析法可以快速、低成本地鑒定EDV,而我國多數農作物育種系譜較為混亂,形態鑒定方法在尚未建立成熟的分子鑒定標準的情況下可發揮重要作用,但形態方法受環境等因素影響,很難區分實質性派生品種而且耗時長,不適于快速鑒定。分子鑒定標準盡管不能包括所有特異性位點,但具有技術簡單、快速、易于自動化等特點,成為目前主要的EDV鑒定方法。

為了應對國際發展及保護原始品種育種人的權利,促進創新育種,我國應加大研究力度,鼓勵相關育種協會、育種人等組織和參與有關品種EDV判定標準的研制,依據我國育種創新水平和種業發展的實際情況,甚至針對每類作物,建立適合中國國情的以SSR或SNP為主的EDV鑒定技術標準。當然,特定品種的EDV鑒定標準只是用于轉移EDV證明責任的工具,而不是EDV的最終判定標準,育種者仍可以通過提供育種系譜或材料來源等方法證明被控品種并非EDV。為了防止育成的品種成為其他品種的EDV,ASSINSEL建議育種者在育種計劃前,應慎選育種親本,在采用較易產生派生品種的方式如誘變等方式進行育種時需格外小心,同時充分掌握品種基因組信息,防止他人侵權或被控侵權,在育種過程中妥善記錄,以維護自身合法權益[3]。

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