豬流行性腹瀉疫苗研究和開發進展

李春華,王榮談,何錫忠,丁衛星,蔣鳳英,倪建平,3,趙本進,3?

(1上海市農業科學院畜牧獸醫研究所,上海201106;2上海瑞豐農業科技有限公司,上海201106;3上海佳牧生物制品有限公司,上海201106)

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的高度接觸性腸道傳染病,PEDV可感染各種年齡的豬,引起水樣腹瀉、嘔吐和脫水等臨床癥狀,哺乳仔豬感染更為嚴重,病死率達80%—100%[1]。該病最早報道于1971年在英格蘭的豬場中暴發,1978年在比利時首先報道分離到PEDV[2],此后,豬流性腹瀉疫情在世界各地養豬業中均有暴發流行。國內最早報道于20世紀70年代,在1984年確定病原為PEDV。從1984年到2010年初,國內豬場中存在PEDV的感染,但并沒有呈現大規模的暴發。從2010年末開始,哺乳仔豬流行性腹瀉在全國出現較大范圍的流行,尤其在華東和華南大部分地區的豬場集中暴發,發病日齡小、涉及面廣,死亡率高,給養豬業帶來巨大經濟損失[3-4]。2013年5月PED首次在美國暴發,疫情蔓延迅速,短短數月已傳播至30多個州的4 000多個養豬場,引起700多萬頭仔豬死亡;之后,PED傳播到北美洲的加拿大、墨西哥等國,出現暴發流行[5-7],從而改變了PED長期以來只出現在亞洲和歐洲國家的歷史,引起了國際社會和科學界的極大關注。

PEDV屬于尼多病毒目冠狀病毒科冠狀病毒屬,病毒粒子呈球形,有囊膜,直徑約95—190 nm。PEDV的基因組為單股正鏈RNA,不同毒株基因組大小不等,全長約為28 kb,包含5’cap結構和3’polyA尾。PEDV全基因組由5’端非編碼區、3’端非編碼區和至少7個開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)組成,編碼3個非結構蛋白(復制酶1a、1b及非結構蛋白ORF3)和4個結構蛋白(纖突蛋白S,囊膜蛋白E,膜蛋白M,核衣殼蛋白N),它們在基因組的順序為5’UTR-P1a∕1b-S-ORF3-E-M-N-3’UTR。PEDV S基因編碼纖突蛋白(S蛋白),是病毒重要的I型跨膜蛋白,也是PEDV主要的免疫原性蛋白,在病毒粒子與細胞表面受體結合后通過膜融合侵入宿主細胞,誘導機體產生中和抗體,因此很多研究將S蛋白被作為疫苗研究的目的蛋白。

與多數病毒病一樣,對PED的防制尚無特效的藥物,主要依賴疫苗預防接種。幾十年來,國內外豬病研究者研究出了PED滅活疫苗、活疫苗、基因工程疫苗等,有的已經商品化生產應用,有的尚處于研發階段,本文就此做一綜述。

1 滅活疫苗

PED滅活疫苗經歷了組織滅活苗和細胞滅活苗兩個階段。在早期的歐洲,曾將發病豬場死亡仔豬的腸道內容物處理后返飼懷孕母豬,誘導母豬產生免疫抗體,從而保護仔豬,控制PED的流行。但該方法不適用于非發病豬場,而且難以控制病毒含量,并容易感染其他病毒,已被禁止使用。

國內最早的PED疫苗也是組織滅活苗,1993年,哈爾濱獸醫研究所王明等[8]將PEDV滬毒株接種仔豬,取發病仔豬的腸內容物和小腸黏膜滅活后加佐劑制備成國內首個PED組織滅活苗。1994—1995年,馬思奇等[9]采用添加胰酶的方法,將CV777適應VERO細胞連續傳代,用第28代細胞毒制備出氫氧化鋁滅活疫苗;之后又用低代次PEDV CV777細胞毒與豬傳染性胃腸炎(TGEV)華毒株制備了TGE-PED二聯滅活疫苗,為國內豬場長期使用的豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯滅活疫苗(華毒株+CV777株)。1999年,上海市農業科學院的錢永清等[10]從上海郊區的發病豬場分離到一株PEDV,命名為S毒株,并能在VERO細胞上傳代,出現病變;鄒勇等[11]采用該毒株制備了PED-TGEV-PoRV(豬輪狀病毒)三聯滅活疫苗,接種肉豬和妊娠母豬后15 d產生較高的抗體水平,免疫有效期6個月以上,臨床試驗顯示仔豬通過被動免疫獲得保護,保護率達93%,母豬保護率為98%。美國爆發PED之后,Zoetis公司制備的PED全病毒滅活疫苗于2014年9月獲得美國農業部的條件性許可,以2頭份劑量免疫分娩前的母豬,從而使仔豬獲得被動免疫[12]。

滅活疫苗安全、穩定,免疫效果不受母源抗體的影響,通過免疫妊娠母豬使其所產仔豬獲得被動免疫保護。但是,滅活疫苗也存在缺點,接種劑量大,一次免疫無法產生足夠高的抗體水平,通常需要加強免疫;而且經后海穴注射接種PED滅活苗,需要2周時間才能產生完全免疫力,不適合緊急預防接種[13]。另外,滅活疫苗只能通過注射免疫,誘導產生的主要是循環抗體IgG,可抵御全身感染,而不能有效誘導黏膜免疫,仔豬無法獲得分泌性抗體SIgA,因而不能全面保護豬腸道黏膜感染。

2 活疫苗

1998—1999年,佟有恩等[14]成功培育了PEDV CV777克隆弱毒株,制備出PED弱毒活疫苗;并將TGE及PED克隆弱毒株以1∶1配比制成TGE-PED二聯弱毒疫苗,毒價為107.0—7.5TCID50∕0.3 mL,主動免疫和被動免疫的保護率分別為97.7%和98%,豬場田間試驗達到95%以上的保護率,可用于緊急預防接種。2000年,李樹根等[15]應用制備的PED-TGE二聯弱毒疫苗(PEDV-G1P83株+TGEV-AG1株)進行區域試驗,免疫后可使初生仔豬、斷奶仔豬和肥育豬抵抗TGEV和PEDV強毒的攻擊,明顯降低發病率和死亡率。2002年,周仲芳等[16]驗證了該二聯弱毒疫苗在誘導抗體產生方面無干擾,與兩個疫苗單獨免疫產生的抗體變化趨勢相似,在7日齡時仔豬獲得較高的被動免疫抗體效價。

國外對PED活疫苗的研究早期集中在亞洲國家。1997年,應用在Vero細胞上傳代適應的100代毒PEDV 83P-5株制備的弱毒疫苗在日本獲得許可,應用于母豬[17]。1999年,韓國Kweon等[18]將分離的KPEDV-9野毒株在適應VERO細胞,用93代毒接種妊娠母豬,可使其免疫力增強,新生仔豬可以抵抗PEDV野毒的感染;免疫母豬的安全性試驗顯示分娩母豬產仔數達到平均水平,此弱毒株可以作為疫苗株用于保護哺乳仔豬免受PEDV的感染。2007年,韓國的Song等[19]將PEDV在VERO細胞上適應傳代,獲得了DR13弱毒株,采取口服和肌肉注射途徑免疫妊娠后期的母豬,用PEDV強毒攻擊檢測疫苗保護性。結果顯示,口服免疫組的強毒攻擊致死率為13%,明顯低于肌肉注射組(60%),而且口服免疫組母豬所產仔豬的抗PEDV IgA濃度較高;此DR13弱毒株經過3次動物回歸試驗,仍然安全,可以作為口服疫苗株,誘導妊娠后期的母豬獲得高水平的免疫反應,抵抗PEDV的感染,該疫苗已經在韓國、菲律賓獲得許可和應用。針對2014—2015年韓國出現的PEDV疫情,應用 G2a型新 PEDV毒株制備的疫苗即將獲得許可[20]。

弱毒疫苗無需佐劑,單次免疫即可獲得持久的免疫力,還可誘導較強的細胞免疫反應,保護效果好。但其存在散毒和返強的風險,安全性有時難以確保,有的免疫功能低下者接種后可能導致發病。

3 基因工程疫苗

隨著生物技術的發展,利用基因工程方法研究的豬流行性腹瀉疫苗有以下幾種:轉基因植物疫苗、乳酸桿菌口服疫苗、核酸疫苗和亞單位疫苗等。

3.1 轉基因植物疫苗

2003年,韓國Bae等[21]將PEDV中和表位區域COE基因轉入煙草中,構建了表達PEDV抗原的轉基因煙草,利用表達的抗原口服免疫小鼠,盡管PEDV抗原的表達水平不高,但仍能誘導小鼠產生體液免疫和黏膜免疫應答,保護宿主細胞免受PEDV感染。2005年,Kang等[22]將PEDV中和表位基因在無尼古丁的煙草中表達,可將外源病毒抗原的表達量提高到占全部可溶性植物蛋白的2.1%。目前,用在無煙堿煙草中成功表達的含中和表位的PEDV S蛋白免疫接種仔豬,顯示出良好的保護作用[23]。但是,由于煙草中大量的生物堿對人畜有害,大規模的提取和純化方法,較低表達量的外源抗原在口服時會被消化,合適的飼喂量、抗原的穩定性及有效劑量尚需深入研究,所以轉基因植物疫苗離臨床應用還有很多需要解決的問題。

3.2 乳酸桿菌口服疫苗

微生態制劑可以調節腸道菌群,維持機體健康,乳酸桿菌是制備微生態制劑常用的益生菌。近年來,將病原微生物的抗原基因應用乳酸桿菌系統進行表達,制備口服微生態制劑疫苗也多有研究。口服疫苗可以刺激黏膜免疫,產生IgA抗體,抵抗病原入侵,有效預防病毒性腹瀉,所以PEDV的乳酸桿菌口服疫苗研究較多。

2007年,Hou等[24]報道用乳酸菌表達的PEDV N蛋白能夠刺激機體產生針對PEDV N蛋白的黏膜抗體IgA和循環抗體IgG。2008年,董麗娜等[25]擴增出501 bp的PEDV COE基因片段,成功構建了PEDV部分S蛋白乳酸乳球菌表達載體系統,經乳鏈菌肽(Nisin)誘導后在菌體細胞表面成功表達了具有反應原性的PEDV部分S蛋白。2009年,胡桂學等[26]將董麗娜構建的含有PEDV S蛋白COE的重組菌大量培養,誘導表達后進行動物實驗,分別口服免疫妊娠母豬和斷奶仔豬,檢測結果顯示,與對照組相比,免疫妊娠母豬乳汁中sIgA顯著升高;免疫仔豬血清中IgG和sIgA明顯增加,淋巴細胞增殖試驗刺激指數差異顯著。

2009—2010年,葛俊偉等[27-29]報道用干酪乳桿菌表達系統分別表達了PEDV N蛋白、S1蛋白和中和抗原位點(COE),用重組干酪乳桿菌分別口服免疫小鼠,測定了免疫后不同時間血清中特異性IgG、糞便中特異性的sIgA水平以及血清的中和活性,并測定免疫小鼠脾淋巴細胞增殖情況和細胞因子水平。結果顯示免疫組小鼠血清、糞便中檢測到較高水平的特異性IgG、sIgA(P＜0.01),脾淋巴細胞增殖指數明顯高于對照組,IL-4和IFN-γ水平顯著提高(P＜0.01),含有pPG-1-COE的重組干酪乳桿菌誘導的血清具有中和活性(1∶12),該重組干酪乳桿菌表達系統可誘導小鼠產生對豬流行性腹瀉病毒特異的黏膜免疫應答和系統免疫應答。2012年,Liu等[30]構建了分別表達PEDV N蛋白和S1蛋白的重組乳酸菌,通過口服免疫,證明乳酸菌表達的PEDV S1蛋白和N蛋白的聯合應用可以誘導高水平的黏膜免疫和全身免疫反應。

3.3 核酸疫苗

核酸疫苗是將外源抗原基因直接導入機體細胞內,利用宿主細胞的表達系統合成抗原蛋白,誘導宿主產生特異性免疫應答,又稱為基因疫苗或DNA疫苗,具有免疫保護力更強、更持久的優點,但多數疫苗仍處于試驗研究階段。

2013年,Meng等[31]應用真核表達載體構建了表達PEDV S基因的DNA疫苗,該疫苗不僅能夠有效地激活細胞免疫,還能誘導高水平抗體的產生。向敏等[32]構建了PEDV S蛋白的COE基因真核表達載體,在VERO細胞中瞬時表達,用重組質粒COE核酸疫苗免疫小鼠,在小鼠體內可誘導產生相應的抗體。2014年,梁恩濤等[33]應用真核表達載體構建了表達PEDV S1的重組減毒鼠傷寒沙門菌SL7207(pVAXDS1),并以每只1×109CFU口服免疫BALB/c小鼠具有良好的安全性,攜帶的S1基因能在小鼠回腸末端組織內正常轉錄及表達,為深入開展減毒沙門菌疫苗菌株SL7207(pVAXD-S1)的免疫評價及構建PEDV與其他抗原基因聯合免疫DNA疫苗奠定了基礎。2014年6月,美國Harrisvaccine公司應用其擁有的獨一無二的SirraVax(SM)RNA顆粒技術研制的PED RNA疫苗成為美國農業部的條件性許可的首個PED疫苗[12]。

3.4 亞單位疫苗

亞單位疫苗是采用基因工程的方法將病毒的特定基因重組到合適的質粒或病毒載體中,然后導入原核或真核表達系統進行高效表達,提取所表達的特定多肽,加入佐劑制備而成的一種新型疫苗。表達系統主要有細菌、酵母或動物細胞等,目前國內已有少量商品化的亞單位疫苗,如豬圓環病毒2型基因工程亞單位疫苗,羊衣原體病基因工程亞單位疫苗。

2008年,韋顯凱等[34]成功構建獲得了穩定表達PEDV S蛋白基因片段的3個重組腺病毒rAd-S498—638,rAd-S1—638,rAd-S198—1384,免疫小鼠后可誘導產生較強的PEDV特異性免疫應答。2009年,姜艷平等[35]將應用原核表達系統成功表達了S1、Ps420、S2、S3蛋白,并制備了相應的抗血清,檢測結果表明這4種蛋白均有很好的抗原性,4種抗血清都能識別細胞培養的PEDV,其中S1、Ps420抗血清能識別天然的PEDV病毒粒子。2014年,譚博敏等[36]成功構建獲得了共表達S1和M蛋白的重組桿狀病毒rBacmid-S1-M,試驗結果顯示,共表達的重組S1和M蛋白產物能夠與PEDV多克隆抗體發生特異性反應,具有良好的反應原性。同年,畢玉敏等[37]在pGEX-6P-1載體中表達了4個具有免疫原性的PEDV S蛋白基因片段(Sa,Sb,Sc和Sd),為后期亞單位疫苗的研制奠定了基礎。

2016年,加拿大的Makadiya等[38]應用酵母、昆蟲細胞和哺乳動物細胞三種真核表達系統成功表達了分泌型的N端糖基化的PEDV USA∕Colorado∕2013株的 S1蛋白,與Triadj佐劑混合后一起免疫分娩前的懷孕母豬,能夠誘導產生S1特異性的IgG和IgA,可以傳遞給新生仔豬。免疫母豬及其所產仔豬血清中存在較高的中和抗體滴度。給仔豬口服PEDV強毒攻擊,與對照組相比,免疫母豬所產的仔豬臨床癥狀輕微,死亡率顯著降低。但是,免疫組仔豬和對照組在腹瀉、體重和排毒量方面無顯著差異,因此S1的亞單位疫苗還不能給暴露于強毒的哺乳仔豬提供完全的保護,尚需進一步改進亞單位疫苗以全面抵抗PEDV的感染。2016年,陳瑾等[39]為了提高PEDV亞單位疫苗的免疫原性,進行了免疫增強劑的篩選研究。選取免疫增強劑 CVC1302、CVC1303與可溶性表達 PEDV S蛋白核心表位 COE的重組蛋白(pQZCOE-LTB)混合乳化制成疫苗,免疫小鼠,檢測結果表明,重組蛋白與CVC1303配合使用免疫小鼠能產生顯著高于滅活苗(CV777)陽性對照組的IgG和sIgA抗體水平,說明CVC1303免疫增強劑能有效增強該重組蛋白的免疫原性,提高亞單位疫苗免疫效果。

亞單位疫苗無致病性,無需滅活,安全性高,是目前的研究熱點,如何使PED亞單位疫苗能夠提供完全保護是目前亟待解決的難點。

4 國內近年來審批的PED新疫苗及中試產品

三十多年來,TGE-PED二聯滅活疫苗和弱毒疫苗在防制TGEV和PEDV引起的病毒性腹瀉中發揮了重要作用。自2010年以來,國內豬病毒性腹瀉的大暴發導致了新的疫苗需求,應用新毒株研發的PED聯苗應運而生。據農業部獸藥注冊數據庫查詢[40],馮力等研制了豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉、豬輪狀病毒(G5型)(弱毒華毒株+弱毒CV777株+NX株)三價活疫苗,于2014年12月獲得新獸藥證書。經過八年的潛心研究,北京大北農科技集團股份有限公司等6家單位聯合研發申報的豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯活疫苗(HB08株+ZJ08株)于2015年11月獲得新獸藥證書。華中農業大學等5家單位應用新毒株研發申報的豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯滅活疫苗(WH-1株+AJ1102株)于2016年10月獲得新獸藥證書。

目前尚處于臨床試驗階段的中試疫苗產品有:華中農業大學等研發的豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯活疫苗(WH-1R株+AJ1102-R株)、四川省華派生物制藥有限公司等研發的豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯滅活疫苗(HY株+HZ株)、天康生物股份有限公司研發的豬流行性腹瀉滅活疫苗(XJ-DB2株)和廣東海大畜牧獸醫研究院有限公司等研發的豬流行性腹瀉活疫苗(CHYJ株)。

5 國外的PED新疫苗及研發新技術

在日本和韓國,隨著PEDV變異毒株的出現,各研究單位和疫苗生產企業正在實施應用新的疫苗株替代之前的毒株制備新型PED疫苗的計劃。在美國爆發PED之后,有兩種疫苗獲得農業部的條件性許可,分別是美國Harrisvaccine公司的PED RNA疫苗和Zoetis公司的PED全病毒滅活疫苗。

目前,在動物疫苗研發領域有兩種新技術逐漸被應用[41]。一種是病毒樣顆粒(Virus-like particle,VLP)疫苗技術,VLP疫苗的抗原結構類似于天然抗原的構象,模擬野生病毒的結構但不含核酸,不具備感染性,能夠誘導長期的免疫和細胞免疫,已被應用于豬圓環病毒2型疫苗和O型口蹄疫疫苗的生產[42-43];另一種是RNA顆粒疫苗,是應用致弱的委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuela equine encephalitis,VEE)作為載體,插入靶基因片段,生產出重組疫苗[44]。美國的PED RNA疫苗就是應用PEDV的S蛋白基因替換VEE病毒的部分基因,使得在短期內應對突發疫情進行緊急接種成為可能。綜上所述,國內外PED疫苗的研究已取得了較大進步,從最早的滅活疫苗免疫,僅監測IgG抗體,到重視黏膜免疫中sIgA抗體的作用,提供更加全面的保護。尤其是近三年來,應用新毒株制備的商品化疫苗逐步投放市場,為我國防制PED和病毒性腹瀉提供了多種選擇。目前,雖然大多數PED口服疫苗、DNA疫苗和亞單位疫苗仍處于研究階段,但美國PEDV RNA疫苗獲得條件性許可應用,為PED的疫苗研發提供了廣闊的前景,對未來研制高效、安全的PED新疫苗奠定了基礎。

[1]馮力,佟有恩,李偉杰,等.我國主要豬病毒性腹瀉疾病的現狀和對策[J].養豬,2001(4):37-39.

[2]PENSAERT M B,DE BOUCK P.A new coronavirus-like particle associated with diarrhea in swine[J].Arch Virol,1978,58(3):243-247.

[3]鄭逢梅,霍金耀,趙軍,等.2010—2012年華中地區豬流行性腹瀉病毒分子特征和遺傳進化分析[J].病毒學報,2013,29(2):197-205.

[4]施標,董世娟,朱玉敏,等.中國豬流行性腹瀉病毒分子流行病學研究進展[J].中國農業科學,2013,46(20):4362-4369.

[5]CIMA G.Fighting a deadly pig disease:industry,veterinarians trying to contain PED virus,new to the US[J].J Am Vet Med Assoc,2013,243:469-470.

[6]STEVENSON G W,HOANG H,SCHWARTZ K J,et al.Emergence of Porcine epidemic diarrhea virus in the United States:clinical signs,lesions,and viral genomic sequences[J].J Vet Diagn Invest,2013,25:649-654.

[7]CIMA G.PED virus reinfecting U.S.herds.Virus estimated to have killed 7 million-plus pigs[J].J Am Vet Med Assoc,2014,245(2):166-167.

[8]王明,馬思奇.豬流行性腹瀉滅活疫苗的研究[J].中國畜禽傳染病,1993(5):17-19.

[9]馬思奇,王明,馮力,等.豬傳染性胃腸炎與豬流行性腹瀉二聯氫氧化鋁細胞滅活疫苗的研究[J].中國畜禽傳染病,1995(6):23-27.

[10]錢永清,聞人楚,唐永蘭,等.豬流行性腹瀉病毒的分離培養與鑒定[J].上海農業學報,1999,15(2):41-44.

[11]鄒勇,許寶華,錢永清,等.豬流行性腹瀉、豬傳染性胃腸炎和豬輪狀病毒三聯苗免疫試驗[J].江西農業大學學報,2005,27(1):107-109.

[12]CRAWFORD K,LAGER K M,KULSHRESHTHA V,et al.Status of vaccines for porcine epidemic diarrhea virus in the United States and Canada[J].Virus Res,2016,226:108-116.

[13]程杰,欒慧,吳家強,等.豬流行性腹瀉新型疫苗的研究進展[J].養豬,2015(4):97-101.

[14]佟有恩,馮力,李偉杰,等.豬傳染性胃腸炎與豬流行性腹瀉二聯弱毒疫苗的研究[J].中國預防獸醫學報,1999,21(6):406-410.

[15]李樹根,周仲芳,李力復,等.豬流行性腹瀉和豬傳染性胃腸炎弱毒二聯疫苗研究[J].中國獸醫雜志,2000,26(8):5-8.

[16]周仲芳,李樹根,李力復,等.豬流行性腹瀉和傳染性胃腸炎弱毒二聯疫苗免疫抗體應答的研究[J].中國獸醫科技,2002,32(2):3-6.

[17]SATO T,TAKEYAMA N,KATSUMATA A,et al.Mutations in the spike gene of porcine epidemic diarrhea virus associated with growth adaptation in vitro and attenuation of virulence in vivo[J].Virus Genes,2011,43:72-78.

[18]KWEON C H,KWON B J,LEE J G,et al.Derivation of attenuated porcine epidemic diarrhea virus(PEDV)as vaccine candidate[J].Vaccine,1999,17(20-21):2546-2 553.

[19]SONG D S,OH J S,KANG B K,et al.Oral efficacy of Vero cell attenuated porcine epidemic diarrhea virus DR13 strain[J].Res Vet Sci,2007,82(1):134-140.

[20]CHUNG H C,LEE J H,NGUYEN V G,et al.New emergence pattern with variant porcine epidemic diarrhea viruses,South Korea,2012-2015[J].Virus Res,2016,226:14-19.

[21]BAE J L,LEE J G,KANG T J,et al.Induction of antigen-specific systemic and mucosal immune responses by feeding animals transgenic plants expressing the antigen[J].Vaccine,2003,21(25-26):4052-4058.

[22]KANG T J,KIM Y S,JANG Y S,et al.Expression of the synthetic neutralizing epitope gene of porcine epidemic diarrhea virus in tobacco plants without nicotine[J].Vaccine,2005,23(17-18):2294-2297.

[23]KANG T J,KANG K H,KIM J A,et al.High-level expression of the neutralizing epitope of porcine epidemic diarrhea virus by a tobacco mosaic virus-based vector[J].Protein Expr Purif,2004,38(1):129-135.

[24]HOU XL,YU LY,LIU J,et al.Surface-displayed porcine epidemic diarrhea viral(PEDV)antigens on lactic acid bacteria[J].Vaccine,2007,26(1):24-31.

[25]董麗娜,高鳳山,許崇波,等.表達豬流行性腹瀉病毒COE基因的重組乳酸菌的構建與鑒定[J],2008,39(12):1743-1747.

[26]胡桂學,刁鵬祥,陳中秋,等.PEDV COE基因重組乳酸菌仔豬和妊娠母豬免疫研究[A].第十三次學術研討會會議文集(下冊),2009:815-818.

[27]葛俊偉,姜艷平,汪淼,等.表面表達豬流行性腹瀉病毒核蛋白蛋白的重組干酪乳桿菌誘導產生的免疫應答[J].生物工程學報,2009,25(6):813-818.

[28]葛俊偉,姜艷平,汪淼,等.豬流行性腹瀉病毒S1蛋白在干酪乳桿菌中的分泌表達及免疫原性分析[J].中國預防獸醫學報,2009,31(4):256-260.

[29]葛俊偉,姜艷平,汪淼,等.表達豬流行性腹瀉病毒中和抗原位點的重組干酪乳桿菌免疫小鼠誘導的免疫應答[J].中國獸醫科學,2010,40(7):708-712.

[30]LIU D Q,GE J W,QIAO X Y,et al.High-level mucosal and systemic immune responses induced by oral administration with Lactobacillusexpressed porcine epidemic diarrhea virus(PEDV)S1 region combined with Lactobacillus-expressed N protein[J].Appl Microbiol Biotechnol,2012,93(6):2437-2446.

[31]MENG F,REN Y,SUO S,et al.Evaluation on the efficacy and immunogenicity of recombinant DNA plasmids expressing spike genes from porcine transmissible gastroenteritis virus and porcine epidemic diarrhea virus[J].PLoS One,2013,8(3):e57 468.doi:10.1371∕journal.pone.0057 468.

[32]向敏,張沽,高其雙,等.豬流行性腹瀉病毒COE核酸疫苗的構建及免疫原性[J].中國獸醫學報,2013,33(11):1627-1630.

[33]梁恩濤,廖曉丹,黃小波,等.攜帶豬流行性腹瀉病毒S基因的減毒鼠傷寒沙門菌的構建與鑒定[J].中國獸醫科學,2014,44(3):264-270.

[34]韋顯凱,侯繼波,姜平.表達豬流行性腹瀉病毒S基因片段重組腺病毒的構建與免疫特性[J].中國獸醫學報,2008,28(10):1128-1132.

[35]姜艷平,葛俊偉,汪淼,等.豬流行性腹瀉病毒S基因片段的原核表達及其表達產物的反應原性[J].中國獸醫科學,2009,39(7):602-607.

[36]譚博敏,蔣志瓊,余希堯,等.豬流行性腹瀉病毒主要結構蛋白在桿狀病毒中的表達及免疫原性分析[J].畜牧與獸醫,2014,46(11):14-18.

[37]畢玉敏,陳欣,李昌靜,等.豬流行性腹瀉病毒S蛋白部分抗原表位基因的原核表達及表達產物的免疫原性分析[J].中國獸醫科學,2014,44(7):752-757.

[38]MAKADIYA N,BROWNLIE R,VAN DEN HURK J,et al.S1 domain of the porcine epidemic diarrhea virus spike protein as a vaccine antigen[J].Virol J,2016,13:57.doi:10.1186∕s12985-016-0512-8.

[39]陳瑾,黃春娟,于曉明,等.PEDV亞單位疫苗免疫增強劑的篩選[J].華北農學報,2016,31(2):205-210.

[40]中國獸醫藥品監察所.國家獸醫基礎信息查詢系統[EB∕OL].[2017-02-04].http:∕∕sysjk.ivdc.org.cn:8081∕cx.

[41]KIM H,LEE Y K,KANG S C,et al.Recent vaccine technology in industrial animals[J].Clin Exp Vaccine Res,2016,5:12-18.

[42]LIU LJ,SUZUKI T,TSUNEMITSU H,et al.Efficient production of type 2 porcine circovirus-like particles by a recombinant baculovirus[J].Arch Virol,2008,153(12):2291-2295.

[43]MOHANA SUBRAMANIAN B,MADHANMOHAN M,SRIRAMAN R,et al.Development of foot-and-mouth disease virus(FMDV)serotype O virus-like-particles(VLPs)vaccine and evaluation of its potency[J].Antiviral Res,2012,96(3):288-295.

[44]LUNDSTROM K.Alphavirus-Based Vaccines[J].Methods Mol Biol,2016,1404:313-328.