豬弓形蟲病實驗室檢測方法研究進展

莊金秋，梅建國，張 穎，楊麗梅，李 峰，沈志強

（山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州 256600）

豬弓形蟲病實驗室檢測方法研究進展

莊金秋，梅建國，張 穎，楊麗梅，李 峰，沈志強

（山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州 256600）

弓形蟲病是一種世界性的人獸共患寄生蟲病，可引起孕婦流產、死胎，兒童生長發育受阻及家畜高熱、繁殖障礙性疾病等，給世界養豬業造成很大危害。豬弓形蟲病目前尚無特效治療藥物和方法，加強養殖環節對該病的預防控制措施，提高豬產品中弓形蟲檢測技術水平，是預防和控制該病的關鍵。文章綜述了豬弓形蟲病最新實驗室檢測方法研究進展，以期為獸醫科研工作者和廣大養豬業主更好地防治該病提供參考。

弓形蟲；豬弓形蟲病；檢測；研究進展

弓形蟲病（Toxoplasmosis）由剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）引起的一種人獸共患原蟲病。人感染該病主要引起孕婦的流產、弱胎、畸胎、死胎和兒童生長發育受阻、死亡等，已成為優生優育的大敵。家畜中，我國以豬的感染較為多見，主要以高熱、呼吸困難、神經癥狀以及繁殖障礙為特征。據了解，我國養豬場中曾大規模暴發弓形蟲病，導致豬群無名高熱，所引起的死亡率高達 60%以上，給畜牧業生產造成了很大的經濟損失。近年弓形蟲病血清學調查顯示，豬弓形蟲病感染率均很高，且呈逐年上升趨勢。患弓形蟲病的豬及其肉制品往往是人類感染弓形蟲病的重要傳染源之一，食用未熟的肉或肉產品對人體存在著感染的危險。弓形蟲的終末宿主是貓及貓科動物，對養貓的家庭要定期進行弓形蟲病檢測，以確保安全。豬弓形蟲病嚴重威脅著動物健康和人類公共衛生安全，因此實時監測豬群弓形蟲感染對正確防控該寄生蟲病尤為重要。由于豬感染弓形蟲后多為隱性感染，它的臨床癥狀和病理變化與豬瘟相似，需要進行實驗室檢測才能確診。本文綜述了豬弓形蟲病近年來實驗室檢測方法研究進展，以期為科研工作者和廣大養豬業主更好地防制該病提供參考。

1 病原學檢測方法

病原學檢測方法包括直接涂片染色或組織切片染色觀察法、動物接種或細胞培養法、卵囊檢查法等。該方法是從病料中查出弓形蟲存在最可靠的方法，缺點是敏感性低、耗時長、容易漏診[1]。

2 血清學檢測方法

2.1 凝集試驗

主要包括直接凝集試驗（DAT）、間接血凝試驗（IHAT）、乳膠凝集試驗（LAT）及改良凝集試驗（MAT）。IHAT 主要用于大規模的流行病學調查。Senet等（1976）[2]證實 IHAT 檢測 IgM 抗體更敏感，且比間接免疫熒光試驗（IFAT）更能檢測低滴度弓形蟲抗體。王 天 奇 等（2006）[3]、王海 燕等（2008）[4]先 后 以 IHAT方法調查河南洛陽地區豬弓形蟲感染情況，表明該地區豬弓形蟲感染有明顯上升趨勢。羅才慶等（2012）[5]應用 酶 聯 免 疫吸 附 試 驗（ELISA）和 IHAT兩種方法，平行檢測來自福建龍巖市某個豬場的32份豬血清中的抗弓形蟲特異性抗體。結果ELISA 和 IHAT 對豬弓形蟲抗體陽性檢出率分別為 62.5%（20/32）、53.13%（17/32）。其中，ELISA 方法的敏感性、檢測效率都在 IHAT 方法之上，但ELISA 方法的特異性略低于 IHAT 方法。王貝貝等（2012）[6]發現 MAT 方法 適 合 于 對 初 篩 樣本以及臨床上疑似弓形蟲感染個體的篩查，但該法費時、費力 ，不宜在 基 層推 廣 使 用 。Lorry 等（2012）[7]認 為MAT可用于畜群血清學檢測，且該法可作為檢測組織液的良好候選法。

2.2 ELISA

ELISA 是國內外多數學者和實驗室檢測弓形蟲抗體最常用的方法。管剛等（2008）[8]用弓形蟲的重組蛋白 P30 作為抗原建立了 ELISA 方法，對青海省互助縣所收集的 139 份豬血清抗體進行豬弓形蟲病檢測。共檢出陽性血清 8 份，陽性率為 5.76%。同時應用 IHAT 方法檢出的陽性率為 13.67%，ELISA 檢測的陽性率明顯低于 IHAT 檢出的陽性率，但用免疫成色反應（ICT）驗證后，結果跟 ELISA 結果具有很高的相符性。江濤等（2009）[9]應用弓形蟲重組微線體蛋白 3（rMIC3）作為包被抗原建立了間接 ELISA 方法，用于豬弓形蟲抗體的檢測。以 ELISA 與 LAT 平行檢測 471 份豬血清樣本，弓形蟲抗體陽性檢出率分別為 39.49%和 44.16%，兩者總符合率為 92.56%。羅 才 慶等 （2012）[5]對 ELISA 和 IHAT 比較 發 現，ELISA 更適用于豬弓形蟲抗體檢測。楊亞曉等（2014）[10]對臨床上常用的金標法、IHAT、ELISA 對弓形蟲 IgG 抗體的檢測效能進行比較分析發現，ELISA 檢測弓形蟲 IgG 抗體的敏感性和特異性較高，適合于大規模的弓形蟲 IgG 抗體篩查。丁邦勝等（2014）[11]建 立 了 3 種 重 組 抗 原（rSAG1+rHXGPRT+ rAK） 混合的間接 ELISA 方法，檢測弓形蟲 IgM 和IgG。Bartomiej等（2015）[12]使用 5 組弓形蟲重組嵌合抗原建立 ELISA 方法檢測 3 個不同的群體家畜動物（馬、豬、羊）血清中的 IgG，結果得到所有嵌合抗原具有高特異性（100%），其中最有效的弓形蟲病診斷的重組抗原是 SAG2-GRA1-ROP1L。許正茂等（2016）[13]以弓形蟲 TgSAG2 蛋白作為包被抗原對新疆巴州地區 433 份豬血清樣品進行了 ELISA 檢測。結果顯示，平均陽性率為 12.70%（55/433）。其中，散養豬場陽性率為 16.83%（35/208），規模化養殖場為9.94%（16/161），散養豬場陽性檢出率顯著高于規模化養殖場。邵曉冬等（2014）[14]采集河南洛陽地區規模化養殖場和散養戶母豬、肥育豬、保育豬血清樣品 410 份，應用 ELISA 方法檢測抗弓形蟲 IgG 抗體。結果發現豬弓形蟲血清抗體陽性率達 35.4%，母豬、肥育豬 和保育豬 的分別是 50.4%、34.5%、22.2%。規模養殖場母豬及肥育豬陽性率極顯著或顯著低于散養戶，說明豬弓形蟲的感染與飼養管理水平尤其是衛生管理水平有直接關系。豬弓形蟲病目前市場上的各種 ELISA 診斷試劑盒質量參差不齊，進口試劑盒與國產試劑盒的符合率、敏感性和特異性都存在較大差距。何勇等（2011）[15]以人工感染弓形蟲的豬陽性血清 42份及感染前的陰性血清45 份為樣品，比較 3 個國產（A、B、C）和 2 個國外（D、E）ELISA 試劑盒檢測豬弓形蟲病的敏感性。結果表明 5種試劑盒中，1種國產試劑盒的檢測結果與 PCR 結果完全一致，其余 4 種試劑盒的檢測結果都與 PCR 檢測結果差別較大。白昀等（2013）[16]建立的間接 ELISA 試劑盒與商品化試劑盒的符合率達到 95%左右。因此，臨床選用試劑盒時，可從性價比方面考慮，不必完全依賴進口試劑盒，完全可選用質優價廉的國產試劑盒，在確有必要引進國外試劑盒時，也應選用質量穩定可靠的產品。

3 分子生物學檢測方法

3.1 PCR

ELISA 方法雖然操作方便，且較為敏感，但檢測結果并不能準確表明動物體內弓形蟲的存在位置和數量。PCR 方法受檢測樣品中弓形蟲分布及存在數量的影響，其敏感性低于 ELISA，但 PCR 的陽性結果可表明弓形蟲在組織中的存在。目前，根據研究者選擇弓形蟲基因組中拷貝數和保守型的不同，PCR檢測技術的靈敏度、特異性也有所不同，常作為弓形蟲檢測的基因有 200～300 個拷貝的 529 bp 重復序列，基于 35 個拷貝數的 B1 基因、P30 基因、核糖體第一內轉錄間隔區（ITS-1 序列）等。

Homan 等（2000）[17]從弓形蟲基因組中鑒定出一個可作為遺傳標記用于弓形蟲與其他寄生蟲的種間鑒定的 200～300 個拷貝的 529 bp DNA 片段。宋慧群等（2007）[18]對中國來源于不同宿主、不同地域的 9個弓形蟲蟲株及國際標準強毒株（RH 株）之間在529 bp 重復序列的變異進行研究，進一步證實了該DNA片段可用于種間鑒定，但不適合用于弓形蟲種內遺傳變異及毒力相關的研究。Edvinsson 等（2006）[19]針對 529 bp 重復序列 181～274 bp 位設計引物，擴增產物 94 bp，擴增效率為 1.95，檢測下限約為 1 個弓形蟲速殖子。Opsteegh 等（2010）[20]針對 529 bp 重復序列 243～405 bp 位設計引物，擴增產物 163 bp，擴增效率大于 1.85，檢測下限約 0.14 個速殖子。趙東岳等（2013）[21]針 對 529 bp 重 復 序 列 178～376 bp位設計引物，擴增產物為 199 bp，擴增效率為96.724%，最低檢出限僅為 173 個拷貝。候照峰等（2015）[22]針對 529 bp 重復序列 268～359 bp 位設計引物，擴增產物大小 92 bp，擴增效率高達 1.999，檢測下限 10 個拷貝，約 0.03～0.05 個速殖子。B1 基因是從弓形蟲RH株基因組文庫中克隆篩選的一個2.2 kb 的片段，它是在整個基因組中有 35 個拷貝的串聯重復片段，Hoyen 等（1992）[23]應用 B1 基因設計合成一對擴增片段長度為 194 bp 的引物，成功建立了一種巢式 PCR 方法，用于檢測病人血液樣品中的弓形蟲。王海燕等（2008）[4]以 B1 基因作為弓形蟲種特異的遺傳標記，建立診斷弓形蟲病特異性的 PCR方法，最低能檢測到 10 個弓形蟲速殖子 DNA。P30基因為編碼弓形蟲速殖子表膜蛋白，Sawa 等（1990）[24]首先應用 P30 基因設計引物進行 PCR 檢測，發現對所檢測的7株弓形蟲株都能擴增，且對任何其他寄生蟲與微生物都未見擴增。崔平等（2009）[25]以 P30基因設計引物建立的 PCR 方法，最低能檢測到 5 個弓形蟲速殖子的 DNA。孔得翔等（2009）[26]以 P30 基因設計了 3 條特異性引物，建立了半巢式 PCR 方法，最低檢測的 DNA 含量為 18 fg。ITS 序列是各物種間相對較為保守的序列，已成為在序列水平上探討科內屬間及種間遺傳關系的有效手段。Homan 等（1997）[27]已證實 ITS-1 可作為分子標記物用于弓形蟲與其他原蟲的種間鑒定。Jauregui等（2001）[28]根據弓形蟲 ITS-1 序列設計引物，建立了豬弓形蟲病的PCR 檢測方法，敏感性最少可檢 100 fg DNA，相當于一個蟲體 DNA 的含量，且與其他 8 種原蟲均無交叉現象，而且蟲體發育的任何階段都能檢出，提示可用于臨床診斷和豬肉產品的檢驗。國內謝德華等（2005）[29]以 ITS-1 序列作為弓形蟲種特異性的遺傳標記建立了 PCR 方法。廖申權等（2006）[30]應用該法對2例豬弓形蟲病進行了特異診斷。邵國青等（2008）[31]以弓形蟲 ITS-1 序列為遺傳標記并與雞柔嫩艾美耳球蟲在同一擴增體系中擴增，表明 PCR 方法最低可以檢測 1 pg弓形蟲速殖子 DNA（相當于10 個速殖子的 DNA），僅出現弓形蟲特異性條帶。黃翠琴等（2012）[32]分別以弓形蟲 ITS-1 序列和 529 bp重復序列為目的片段，擴增2例疑似豬弓形蟲病的病料肺門淋巴結 DNA，對疑似豬弓形蟲病的病料進行 PCR 診斷。弓形蟲微線體蛋白 MIC 是分布于蟲體前端棒狀體周圍的微線體所分泌的黏附因子，與蟲體對宿主細胞的識別和結合有關，在蟲體入侵宿主細胞早期階段發揮重要作用。MIC3 是其中非常重要的微線體蛋白，由于 MIC3 在弓形蟲的速殖子、緩殖子和子孢子期都能表達，這在弓形蟲病的早期診斷中具有重要價值。任科研等（2011）[33]以微線粒體MIC3 基因作為弓形蟲特異的遺傳標記，建立了豬弓形蟲特異 PCR 檢測方法。最低能檢測到 10 個弓形蟲速殖子的 DNA，為今后的弓形蟲基因重組疫苗奠定了基礎。

3.2 熒光定量 PCR

王頻佳等（2005）[34]、Lin 等（2012）[35]先后建立了以弓形蟲 529 bp 重復序列作為檢測的靶基因的熒光定量 PCR。候照峰等 （2015）[22]也以高度保守的529 bp 重復序列作為靶基因，建立了熒光定量 PCR檢測方法，應用該法檢測獸醫院門診送檢的 24 頭病死豬，發現弓形蟲陽性率為 70.8%，略高于常規 PCR方法的檢出率（66.7%），但檢測的 69 個組織樣品中，熒光定量 PCR 方法的檢出率（50.7%）明顯高于常規PCR 方法的檢出率（34.8%）。朱祥明等（2007）[36]建立了以 B1 基因作為檢測的靶基因的弓形蟲 SYBR Green Ⅰ 熒 光 定 量 PCR 檢 測 方 法 。 Edvinsson 等（2006）[19]分別以 529 bp 重復序列和 B1 基因為靶基因建立熒光定量 PCR 方法，研究發現 529 bp（80 fg，DNA）靈敏性是 B1（800 fg，DNA）基因的 10 倍，80 fg的 DNA 相當于 1 個弓形蟲的基因組 DNA。Yang 等（2009）[37]也以 B1 基因和 529 bp 重復序列為目的基因設計引物建立熒光定量 PCR，檢測水樣本中的弓形蟲卵囊。Menotti等（2010）[38]根據 529 bp 序列設計Taq Man-AF-PCR 檢測方法，同時與建立的 B1-PCR-ELISA 檢測方法相比，144 份臨床樣本 B1-PCR-ELISA 檢 測 出 的 72 份 陰 性 樣 本 經 過 Taq Man-AF-PCR 可檢測出 15 份（20.8%）為陽性；同時Taq Man-AF-PCR 比 B1-PCR-ELISA 提前 4～10 d檢測到病原。Rahumatullah 等（2012）[39]利用 529 bp、ITS-1 和 B1 建立了三重 PCR 檢測人體液中的弓形蟲，同時發現三重 PCR 最低可檢測到 10 pg 的弓形蟲 DNA。趙東岳等（2013）[40]也以 529 bp 重復序列、ITS-1 序列和 B1 基因作為檢測的靶基因，建立檢測弓形蟲的三重 SYBR GreenⅠ實時熒光定量 PCR 的檢測方法并且與 ELISA 檢測方法進行比較。ELISA檢測豬弓形蟲 IgG 抗體的陽性率為 41.72%，ELISA與熒光定量 PCR 檢測核酸陽性符合率為 53.44%（P＜0.01）。表明建立的弓形蟲三重 SYBR GreenⅠ熒光定量 PCR 檢測技術具有高特異性和敏感性，可為臨床弓形蟲的診斷提供科學依據。通過以上文獻報道，529 bp、ITS-1 和 B1 基因為靶基因建立熒光定量 PCR 已經顯現出高敏感性。

3.3 聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）

謝德華等（2005）[41]通過對國內來源于不同宿主的 ZS 人株、sH 人株、cN 豬株、QH 綿羊株 4 個弓形蟲蟲株，以及國際標準強毒株RH株的致密顆粒抗原（GRA6）基因進行 PCR-RFLP 分析，結果證明中國人源弓形蟲包含了Ⅰ、Ⅱ兩種基因型，而動物源性弓形蟲則因宿主和來源地不同亦有Ⅰ、Ⅱ兩個基因型。Su 等（2009）[42]利用 10 個基因標記物建立了多重多位點巢式 PCR-RFLP 進行基因分型。Zhou 等（2010）[43]從來自湖北、河 南的 434 頭病豬中分離出16 個弓形蟲蟲株，用 PCR-RFLP 方法鑒定出兩個基因型。

3.4 原位 PCR（In Situ PCR，IS-PCR）

盧慎（2008）[44]應用免疫組化、原位雜交及間接原位 PCR 技術檢測組織細胞中的弓形蟲，結果表明弓形蟲檢測結果陽性率從高到低依次為間接原位PCR、原位雜交及免疫組化。

3.5 免疫-PCR（I-PCR）

李輝等（2006）[45]建立免疫-PCR 檢測弓形蟲抗原最低濃度為 0.1 ng/mL，I-PCR 檢測弓形蟲抗原靈敏度高于傳統 ELISA 檢測 6 000 倍，高于 ABCELISA 750 倍。

3.6 環介導等溫擴增法（LAMP）

鄒杰等（2008）[46]建立的弓形蟲 LAMP 法能夠檢測出 10 個拷貝的目的基因，與新孢子蟲等近緣原蟲DNA 無交叉反應，且極大地縮短了時間。余傳信等（2008）[47]依 據 弓 形 蟲 的 B1 基 因 設 計 引 物 ，通 過LAMP 方法進行擴增，結果表明 LAMP 方法的敏感性是常規 PCR 的 10 倍。Sotiriadou 等（2008）[48]分別以 LAMP 和套式 PCR 方法對 26 個弓形蟲的陽性水樣進行檢測分析，結果顯示 LAMP 的檢出率為100%，而套式 PCR 的檢出率為 53.8%。Zhang 等（2009）[49]根據弓形蟲 529 bp 重復序列進行 LAMP方法的建立，對疑似弓形蟲感染的豬分別以常規PCR 方法和已建立的 LAMP 方法檢測其淋巴結樣本，結果顯示 LAMP 檢測的陽性率為 85.7%，而常規PCR 檢測的陽性率為 76.9%，表明 LAMP 方法能夠作為判斷家畜是否感染弓形蟲病的分子檢測工具。王玉嬌等（2014）[50]在建立豬弓形蟲病 LAMP 檢測方法的基礎上，對采自延邊地區的 264 份豬血液樣本進行了豬弓形蟲病的檢測。結果顯示延邊地區是豬弓形蟲病的流行地區，尤其家養散戶型感染率高，而且仔豬的感染率高于肥育豬。曹利利等（2015）[51]在建立弓形蟲 LAMP 檢測方法的基礎上，對采自吉林省部分地區的 423 份豬血液樣本進行了豬弓形蟲 病檢測。結 果 LAMP 檢測陽性 率 為 7.8%（33/ 423），說明吉林省部分地區仍是豬弓形蟲病的流行地區。

3.7 核度探針技術

李華文（2004）采用隨機引物法應用地高辛（DIG-11-dUTP） 標記探針并同基因組 DNA 進行Southern 雜交，表明 a-Tubulin 和 P-Tubulin 基因在弓形蟲中高度保守。

4 小結

豬弓形蟲感染途徑多、傳播方式廣，且目前尚無特效治療藥物和方法。因此，加強養殖環節對該病的預防控制措施，提高豬產品中弓形蟲檢測技術水平，對減少其對養豬業的危害、降低其通過豬產品而致人感染的風險性，具有極其重要的意義。目前已應用于豬弓形蟲病檢測的方法很多，病原學方法結果最為可靠，但敏感性低且費時費力。常規的免疫學方法雖具有簡易、快速等優點，但對于陽性結果的分析要慎重。以 PCR 為代表的分子生物學方法具有敏感、特異、檢測迅速等優點，能直接反映現癥感染，但存在假陽性、操作繁瑣、需專用儀器等缺點。因此，只有結合各種方法的優缺點，豬弓形蟲病檢測方法才會得到更快、更好的發展。

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（編輯：郭玉翠）

Research Progress on the Detection M ethods of the Porcine Toxop lasmosis

ZHUANG Jinqiu,MEIJianguo,ZHANG Ying,YANG Limei,LIFeng,SHEN Zhiqiang
(Shandong Binzhou Animal Science&Veterinary Medicine Academy,Binzhou 256600,China)

Toxoplasmosis is a worldwide zoonotic parasitic diseases.It can cause miscarriage,stillbirth,child growth retardation and livestock fever,reproductive disorders,and cause great harm to the pig industry.There is no specific treatment drugs and methods for the porcine toxoplasmosis.It is the key of prevention and control of the disease by strengthening the breeding areas for the prevention of the disease controlmeasures,improving the level of detection of Toxoplasma gondii in pig products.It was reviewed the research progress on detection methods of porcine toxoplasmosis new laboratory in this paper,in order to provide reference for the veterinary scientific research workers and themajority of pig owners better of preventing and treatmenting this disease.

Toxoplasma gondii;Porcine toxoplasmosis;detection;research advance

S858.28

A

1002-1957(2017)03-0108-05

2017-03-14

山東省重點研發計劃項目（2015GSF121027）；山東省現代農業產業技術體系生豬產業創新團隊項目（SDAIT-08-17）

莊金秋（1978-），女，山東濰坊人，副研究員，碩士，主要從事細胞培養和動物用病毒疫苗研制.E-mail：zhuangjinqiu2003@163.com