蝴蝶蘭叢生芽組織培養研究進展

黃 丹，陳和明，呂復兵

（廣東省農業科學院環境園藝研究所/廣東省園林花卉種質創新綜合利用重點實驗室，廣東 廣州 510640）

蝴蝶蘭（Phalaenopsis）為蘭科蝴蝶蘭屬植物，原產于亞熱帶雨林地區，本性喜暖畏寒，為附生性蘭花。其花型似蝶、色彩多樣、鮮艷多姿，花序好、花期長，廣受花卉愛好者的喜愛，素有“蘭花皇后”的美稱，在全世界廣泛栽培［1］。蝴蝶蘭是單莖性氣生蘭，幾乎沒有側芽萌發，不能通過分株方式進行繁殖；同時蝴蝶蘭種子不含胚乳，自然條件下萌發率非常低，不能通過播種方式進行繁殖［2］。因此，以上兩種繁殖方式均不能滿足市場對蝴蝶蘭的廣泛需求。

目前，蝴蝶蘭的繁殖方法主要為無菌播種［3-4］和組織培養無性繁殖［5］，無菌播種主要進行雜交或自交獲得種子，經過無菌播種得到實生苗，但實生苗分離大且變異多，不能保持親本的遺傳穩定性，花色、花期多變等；利用莖、根、葉等外植體誘導原球莖進行增殖并分化成苗，雖然性狀相對一致，但仍有較高的變異率，如花色不純等［6］。利用叢生芽進行蝴蝶蘭繁殖是一種從芽到芽的增殖途徑，其優點是通過芽長芽的方式使親本的遺傳穩定，減少變異的發生，是最有效的快速繁殖方法［7-9］。因此，本文主要針對蝴蝶蘭叢生芽組織培養研究進展進行綜述，旨在為蝴蝶蘭種苗規模化生產提供依據。

1 外植體

1.1 外植體的選取

譚鵬鵬等［10］及尚楊娟等［11］以花梗為外植體，對花梗腋芽進行了試驗研究，結果表明：第2節、第3節花梗有較高的萌發率，以第3節萌發率最高；并得出花梗基部的第1～3節誘導營養芽成功率較高，第4和第5節靠近頂端部分成為花芽的幾率大，這可能與芽的分化部位有關，花梗基部的芽主要是休眠芽，在生長激素的誘導刺激下容易發育成營養芽，但花序頂端的芽含有未完全分化的花原基，在培養基中比較容易誘導萌發為花芽［12］。劉亮等［8］在蝴蝶蘭叢生芽誘導試驗中也采用花梗腋芽作為外植體，將第一代誘導出來的新花梗芽作為叢生芽增殖的材料，增殖倍數可達5.5。

1.2 外植體的消毒滅菌

馬曉娟等［13］在蝴蝶蘭V31品種的花梗組培快繁中發現，消毒時間對花梗腋芽的誘導率、褐化死亡率和污染率都有明顯影響，在0.1%氯化汞的條件下，消毒8 min的誘導率比消毒10 min的誘導率高出6.62%，且褐化率明顯偏低。付鎮芳等［14］在蝴蝶蘭大辣椒花梗組織快繁研究中發現，消毒劑、消毒時間對外植體無菌處理至關重要，既要消毒干凈外植體，又不能損傷外植體的組織。其中花梗在次氯酸鈉消毒過程中，有大量細菌性、真菌性污染出現，當消毒20 min時污染減少，但用升汞消毒時，隨著滅菌時間的增加，細菌性、真菌性污染逐漸減少，其中消毒10 min和15 min時最徹底，但消毒10 min的成活率高于15 min。然而，曾德華等［15］在滿天紅蝴蝶蘭花梗組培快繁中，用升汞消毒9～11 min時，細菌性污染出現較多，當消毒13～15 min時，隨時間的增加，細菌性污染減少，成功率高達85%以上。

2 叢生芽的誘導

2.1 基本培養基對叢生芽誘導的影響

馬曉娟等［13］在蝴蝶蘭叢生芽快速繁殖體系中，在1/2MS和MS培養基中，1/2MS的誘導率比MS高出24.94%、褐化率也明顯比MS低，而MS培養基褐化嚴重且發生早，表明1/2MS培養基更有利于外植體的誘導。田甜［16］將蝴蝶蘭外植體分別接種在MS、KYOTO、1/2MS 3種培養基中發現，1/2MS培養基萌發率最高。但武愛龍等［17］在蝴蝶蘭大辣椒組織培養與快速繁殖的研究中，以花寶一號為基本培養基，誘導叢生芽的最佳配方為：花寶一號+NAA 0.3 mg/L+6-BA 5.0 mg/L。

2.2 6-BA及NAA對叢生芽誘導的影響

李金雨等［18］研究發現，6-BA濃度在0.0～3.0 mg/L之間，隨著6-BA濃度的增加，蝴蝶蘭叢生芽的誘導率上升，且誘導時間縮短；但6-BA濃度在3.0～7.0 mg/L之間，隨著6-BA濃度的上升，其誘導時間逐漸縮短，但誘導率沒有明顯變化，說明當6-BA濃度在3.0 mg/L以上時，增加6-BA濃度對蝴蝶蘭叢生芽誘導率作用不大。因此，3.0 mg/L的6-BA對誘導蝴蝶蘭叢生芽是最適宜的。劉亮等［8］認為在不添加NAA的條件下，隨著6-BA濃度的增加，誘導率上升且誘導時間縮短，當6-BA 3.0mg/L時，添加少量NAA誘導率達100%，因此6-BA和NAA組合使用效果較好。華海霞［19］也認為NAA對芽的誘導影響不大，而6-BA的影響顯著，隨著6-BA濃度的上升，增殖系數變大，在6-BA 2.0 mg/L、NAA 0.5 mg/L下效果最好。但張偉等［20］的試驗認為，在相同培養基的條件下，同時使用6-BA、NAA時誘導率比單獨使用6-BA時低，且培養時間長；當6-BA的濃度達到5.0 mg/L時，誘導率略有下降且生長較弱，表明高濃度的6-BA不適合蝴蝶蘭花梗側芽的誘導，當單獨使用6-BA且濃度在3.0 mg/L時，誘導率最高。

3 叢生芽的增殖

3.1 切割與擺放方式對叢生芽增殖的影響

鐘海豐等［21］設置了6種不同的芽體物理切分與擺放方式，研究結果表明：芽體不同切分與擺放方式對蝴蝶蘭叢生芽增殖具有顯著影響。芽體切除生長點后橫插，其單芽平均增殖率顯著高于其他處理，其中PSP-3（單芽切除生長點后橫插）和PSP-6（雙芽切除生長點后橫插）的單芽平均誘導芽數分別為6個和5.9個，而常規單芽切除2/3葉片后豎插，其單芽平均誘導芽數僅為3.5個。但芽體損傷和芽體大小方面，不同處理的死亡率有所不同，單芽切除2/3葉片后縱切橫插的死亡率最高、達33.3%，單芽切除生長點后橫插的死亡率次之、為23.3%。

3.2 基本培養基對叢生芽增殖的影響

付鎮芳等［14］利用蝴蝶蘭大辣椒對基本培養基的增殖情況進行試驗，結果表明：不同基本培養基對蝴蝶蘭大辣椒的增殖有明顯不同的作用，其中MS培養基比1/2MS更有利于不定芽的增殖，增殖系數達2.35。但武愛龍等［17］在蝴蝶蘭大辣椒組織培養與快速繁殖的研究中得出，利用花寶一號為基本培養基，叢生芽增殖和分化的最佳培養基為：花寶一號+NAA 0.2 mg/L +6-BA 6.0mg/L，增殖系數為5.53倍。同時，在規模化種苗生產中，普遍利用花寶一號作為誘導和增殖的培養基。

3.3 6-BA對叢生芽增殖的影響

在蝴蝶蘭叢生芽的增殖過程中，不同濃度的6-BA具有明顯影響。馬曉娟等［13］在試驗研究中發現，6-BA濃度為5.0 mg/L時，叢生芽生長健壯，且增殖率最高；當6-BA處于1.0 mg/L低濃度時叢生芽增殖減少，當濃度升高至5.0 mg/L增殖率逐漸上升，但6-BA濃度大于5.0 mg/L時增殖率隨濃度的上升而下降。李金雨等［18］認為隨著6-BA濃度的上升，叢生芽的芽數增多，增殖率上升，各處理間差異達到極顯著，表明6-BA對蝴蝶蘭叢生芽的增殖具有決定性影響，其中濃度為6-BA 8.0 mg/L時增殖率最高、可達304%，且叢生芽生長健壯，便于下一步的增殖及壯苗生根。當6-BA濃度高于10.0 mg/L時增殖率逐漸上升，但叢生芽生長較弱且有畸形芽出現，不利于增殖。譚鵬鵬等［10］也認為增加6-BA的濃度，增殖率隨之上升，當6-BA濃度從5.0 mg/L上升到7.0 mg/L時增殖率達到最高，當增加到10.0 mg/L時增殖率有所下降，表明高濃度的生長激素抑制了芽的分化。

3.4 6-BA及NAA對叢生芽增殖的影響

譚鵬鵬等［10］認為，在6-BA濃度相同、NAA濃度不同的條件下，其增殖系數有所不同，隨著NAA濃度的上升，增殖系數也相應地增大，表明NAA對叢生芽的分化有促進作用。華海霞［18］在試驗中發現，1.5～2.0 mg/L的6-BA有利于芽的增殖，濃度在2.0 mg/L時增殖效果最好；NAA對增殖作用不明顯，但低濃度的NAA具有協同作用［22］，所以最佳增殖培養基為1/2MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L。但楊海蕓等［23］和譚巍等［24］在NAA和IAA生長素對蝴蝶蘭增殖的試驗中發現，NAA要優于IAA且濃度在0.5 mg/L時，增殖率最高，在6-BA和KT兩種細胞分裂素中，6-BA優于KT，在6-BA濃度為7.0 mg/L時增殖率最高。張偉等［20］也認為NAA濃度在0.5 mg/L、6-BA濃度在1.0～7.0 mg/L時，叢生芽增殖率逐漸提高，當6-BA濃度為5.0 mg/L時增殖芽數較多且生長強壯；但6-BA濃度達7.0 mg/L時增殖芽數最多，但有畸形芽出現。曾德華等［15］研究發現，6-BA和NAA的最佳濃度為3.0 mg/L和0.5 mg/L或3.0 mg/L和1.0 mg/L時，增殖效果最好。侯義龍等［25］在迷你蝴蝶蘭花梗側芽組織培養技術的研究中發現，6-BA 8.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L最適宜叢生芽的增殖。可見，6-BA濃度過高并不能達到最好的效果，唯有6-BA、NAA在配合使用且適宜濃度下，增殖效果最為理想。

3.5 6-BA及其他激素對叢生芽增殖的影響

楊錄軍等［26］在蝴蝶蘭新品種鄭農火鳳凰的組培快繁研究中發現，影響叢生芽增殖最大的因素是6-BA，其次是腺嘌呤，然后為CM，叢生芽在1/3MS + 6-BA 2.0 mg/L +腺嘌呤3.0 mg/L+ NAA 0.2 mg/L + CM 100 mL/L的培養基上增殖效果最好。漆子鈺等［27］在蝴蝶蘭小麻雀的組培快繁研究中發現，6-BA 8.0 mg/L + 蛋白胨0.5 mg/L增殖率最高，表明低濃度的蛋白胨有促進增殖的作用。然而，周全等［28］研究發現，6-BA和TDZ兩種激素在蝴蝶蘭叢生芽增殖過程中，TDZ的增殖效果優于6-BA，適于叢生芽增殖的培養基為1/3MS + TDZ 2.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L+ 蔗糖20 g/L + 瓊脂8.0 g/L + 活性炭2.0 g/L +CM 200 mL/L。

4 壯苗生根

在壯苗生根培養過程中，不同培養基的生根情況不同，其中NAA是關鍵。李金雨等［18］研究結果表明，MS + NAA 0.5 mg/L + 10%香蕉汁與MS + IBA 0.5 mg/L + 10%香蕉汁對生根的影響沒有差異，其它處理均達極顯著差異，其中以NAA 0.5 mg/L + 10%椰子汁的培養基對生根的效果最好，平均生根數達3.6條。同時，試驗結果還表明，椰子汁或香蕉汁等對生根有良好的促進作用。劉亮等［8］將增殖芽轉入1/2MS + NAA 1.0 mg/L和1/2MS + IBA 0.3 mg/L培養基中進行壯苗生根試驗，結果表明兩種培養基均能誘導生根，但后者生根快，平均根數可達3.3條且生長健壯。譚鵬鵬等［10］研究發現，在生根階段，添加香蕉泥和活性炭對生根及壯苗有明顯促進作用，香蕉泥對pH值有緩沖作用，并且含有天然的腺嘌呤等植物激素，有利于植物根系的生長。馬曉娟等［13］發現，椰汁、香蕉泥和土豆泥能明顯影響叢生芽增殖和分化，椰汁有利于增殖并促進生根，且顯著優于其他兩種處理，土豆泥能促進根數和葉片數的增加。張啟香等［29］認為，當6-BA與NAA的配比適當時，蝴蝶蘭的生根較多，植株長勢旺盛且健壯，其中6-BA具有細胞分裂與分化的作用，細胞分裂可以打破頂端優勢的影響。鄭玉忠等［30］認為壯苗生根對植株的移栽成活具有重要作用，因此應篩選激素種類并找到適宜濃度。

5 褐化防治

張和等［31］認為在蝴蝶蘭的組織培養過程中出現的褐變不利于根的形成與生長，褐變是離體培養的無性系植物或進行組織培養時，從植物上切取時傷口所分泌出的酚類物質，在多酚氧化酶的作用下轉變成醌類物質所引起，且褐變率會隨著培養時間的延長而增加，并生成棕褐色的醌類物質，在培養基中逐漸擴散，同時抑制酶的活性，毒害外植體。其中活性炭具有強大的吸附能力，能吸附非極性分子和色素等大分子，減少有害物質的形成。王立婭等［32］發現，1%活性炭能促進生根，并能防止植物自身的酚類物質排泌和變褐，對繁殖材料的形態發生和器官形成具有良好作用。除了活性炭能抑制Ca+的吸收和防止褐變外，檸檬酸、Vc等物質對緩解褐化也有一定作用，而當pH值在5.4～5.5時，排的褐變物質也相應減少［31］。張偉等［20］發現添加30 mg/L檸檬酸能減少褐化且效果顯著，表明檸檬酸能有效降低褐化率、提高誘導率。但段文武等［33］在蝴蝶蘭組培的研究中發現，顯著抑制褐化且對褐化影響最大的是活性炭，轉接周期對褐化的影響次之，對褐化影響從大到小分別為活性炭、轉接周期、溫度、椰子汁，其中活性炭1.0 g/L、轉接周期10 d、溫度25℃、椰子汁濃度150 mL/L，為抑制褐化的最優組合。

6 結論與展望

對蝴蝶蘭叢生芽組織培養研究進展進行綜述，有利于更系統、更完整地了解當前取得的水平和進展情況，能夠更好、更快地為種苗生產提供借鑒和服務。綜合以上的分析，以花梗為外植體，通過花梗腋芽誘導營養芽成功率較高，其中第2節和第3節最好；外植體消毒滅菌時，0.1%氯化汞消毒8～15 min比次氯酸鈉效果好，但不同品種的消毒時間略有差異。在叢生芽誘導中，以1/2MS或花寶一號為基本培養基，6-BA濃度在3.0～7.0 mg/L之間，或6-BA和NAA搭配可誘導出叢生芽；在增殖培養中，6-BA或TDZ對叢生芽增殖有明顯影響，NAA在適宜濃度下配合使用，增殖效果更佳，并以MS或花寶一號為基本培養基；在壯苗生根中，主要以低濃度的NAA或IBA，并配以椰子汁或香蕉汁、土豆汁等有機物對壯苗生根促進作用明顯。在眾多防褐化因子中，活性炭能顯著抑制褐化且對褐化的影響最大，轉接周期對褐化的影響次之，對褐化影響從大到小分別為活性炭、轉接周期、溫度、椰子汁，其中活性炭1.0 g/L、轉接周期10 d、溫度25℃、椰子汁濃度150 mL/L為抑制褐化的最優組合。

雖然蝴蝶蘭組織培養的研究目前已經取得了相當大的研究成果，但仍然存在一些問題，特別是不同品種其消毒時間、誘導率、增殖率、轉接周期等均有差異，因此，需要更深入、細致地對不同類型的蝴蝶蘭進行研究，找出適合自身的最佳消毒時間、培養基配方及轉接周期等，才能在生產中推廣應用。

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