TNFα誘導NF-κB轉錄調控SLC2A3基因

周 飛，彭仲特，王 微，孫延杰，王茂先

（韓山師范學院食品工程與生物科技學院，廣東潮州 521041）

葡萄糖轉運蛋白3編碼基因SLC2A3是SLC2A基因家族的一員，定位于染色體12p13.31，起初被認為神經(jīng)元特異表達[1-2]．后來證明SLC2A3在CD45-陽性的白細胞中也表達[3]．除此之外，SLC2A3在其他很多正常器官和組織中低表達或不表達[1]．但是SLC2A3在多種類型癌癥細胞中均高表達，如間充質狀態(tài)的非小細胞肺癌和膠質細胞瘤[1]、喉鱗狀癌[4]、低分化的子宮內膜癌和乳腺癌中[5]等．高表達的SLC2A3可能促進癌細胞的生長增殖等過程[1]．但是至今癌細胞中SLC2A3高表達的分子機制不清楚．

NF-κB是1986年發(fā)現(xiàn)的DNA結合型轉錄因子，其家族包含NF-κB1（p50）、NF-κB2（p52）、p65/RelA、c-Rel和RelB共5個成員[6]．通常該轉錄因子與IκBα等抑制蛋白結合以“靜息狀態(tài)”存在于細胞質中．但是TNFα等細胞因子可以誘導激活NF-κB進入細胞核，并結合靶基因的特異DNA序列（κB位點）轉錄調控它們的表達[6]．在乳腺癌和肺癌等許多腫瘤組織中NF-κB被組成型激活[7]．NF-κB可能通過轉錄調控其靶基因在腫瘤進展中發(fā)揮關鍵作用．以往發(fā)現(xiàn)，p53缺失的小鼠胚胎成纖維細胞（Mouse embryonic fibroblast,MEF）中NF-κB轉錄上調SLC2A3基因[8]．此結果提示，人類癌癥中SLC2A3高表達原因可能是被NF-κB轉錄上調的．據(jù)此，本研究先后分析了NF-κB對SLC2A3基因的結合情況和調控情況．結果首次在宮頸癌和肝癌細胞中發(fā)現(xiàn)SLC2A3基因是NF-κB的靶基因，此結果揭示了癌細胞中SLC2A3上調表達的分子機制，為揭示NF-κB在癌癥中的分子功能提供了新視角．

1 材料與方法

1.1 主要試劑材料

人宮頸癌細胞株HeLa和人肝癌細胞株HepG2均購自中國科學院細胞庫，胎牛血清購自Hy?Clone，胰酶、青霉素和鏈霉素購自碧云天，TNFα購自Sigma公司，脂質體2000和Trizol試劑購自Invitrogen公司，RelA/p65 siRNA和control siRNA均購自Cell signaling Technology公司，兔抗人-NF-κB/p65抗體購自Abcam 7970公司，正常兔IgG購自Santa Cruz公司，逆轉錄試劑盒購自Takara公司，熒光實時定量PCR試劑盒購自Roche公司，本研究所用引物均為南京金斯瑞公司合成．

1.2 細胞培養(yǎng)及處理

人宮頸癌細胞HeLa和人肝癌細胞HepG2均用含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置5%CO2和37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)．首先接種3組HeLa細胞，次日采用脂質體2000向其中1組HeLa細胞轉染30 nM RelA/p65 siRNA，48 h后再用30 ng/mL TNFα處理1 h，作為siRNA干擾組．與此同時，向余下2組細胞轉染control siRNA，48 h后，將其中1組細胞用同量TNFα誘導1 h，作為TNFα誘導組；另一轉染control siRNA且未經(jīng)TNFα處理的細胞作為陰性對照組．本文使用的HepG2細胞也按類似的方法誘導處理．

1.3 ChIP-Seq數(shù)據(jù)及NF-κB結合峰分析

為了揭示NF-κB的分子功能，用染色質免疫共沉淀-測序（Chromatin Immunoprecipitation Se?quencing,ChIP-Seq）技術研究了NF-κB全基因組結合圖譜[9]．簡言之，首先用30 ng/mL TNFα誘導HeLa細胞1 h．用兔抗人-NF-κB/p65抗體富集NF-κB結合的DNA，正常兔IgG作陰性對照．隨后，用Illumina二代高通量測序儀檢測富集的NF-κB結合的DNA片段．測序獲得的reads數(shù)據(jù)用ELAND軟件mapping到人參考基因組（hg19），再經(jīng)ChIP-Peak在線軟件（http://ccg.vital-it.ch/chipseq）識別ChIP-Seq結合峰（即NF-κB結合峰）．ChIP-Peak軟件運行參數(shù)設置如下，窗口寬度：200；鄰近范圍：200；峰值閾值：1；計數(shù)閾值：10．之后采用基因組瀏覽器UCSC可視化NF-κB結合峰．由于NF-κB可以通過結合遠離靶基因的DNA元件并轉錄調控靶基因的表達[6，9]．因此根據(jù)以往的研究結果[6,9]，本文將SLC2A3基因的基因區(qū)設定為chr12：7 971 824～8 188 892（GRCh37/hg19），并用UCSC可視化該基因區(qū)內測序獲得的NF-κB結合峰，統(tǒng)計分析NF-κB結合峰特征．

1.4 κB位點分析

本研究采用TRANSFAC在線軟件分析SLC2A3基因的NF-κB結合峰內的κB位點分布情況．一般認為TRANSFAC計算的核心匹配分值（core match score,CMS）和矩陣匹配分值（matrix match score，MMS）均超過0.75的κB位點為經(jīng)典的NF-κB結合位點[10]．為了提高分析結果的可靠性，將CMS和MMS的閾值均設置為0.80．分析κB位點分布情況所采用的NF-κB結合矩陣為M00208、M00194、M00054、M00051、M00052和M00053．

1.5 RNA抽提和qPCR

首先采用Trizol試劑抽提HeLa和HepG2細胞內總RNA．然后于10 μL反應體系中采用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA．最后使用1μL逆轉錄產物進行SYBR熒光實時定量PCR檢測（qPCR檢測），GAPDH為檢測內參．所檢測基因的引物見表1．

1.6 統(tǒng)計學分析

本研究熒光定量計算結果采用平均數(shù)±標準差表示，并采用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計T-檢驗．P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，用一個星號表示．P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計學意義，用兩個星號表示．P＜0.001為差異極顯著，用三個星號表示．

表1 熒光定量PCR的引物

2 結 果

2.1 SLC2A3基因區(qū)內NF-κB結合峰的特征

以往采用ChIP-Seq技術在TNFα誘導的HeLa細胞中鑒定出NF-κB全基因組結合圖譜[9]．此圖譜為揭示NF-κB新的靶基因提供了理論依據(jù)和線索．為了探索癌細胞中SLC2A3高表達的機制，進一步分析了NF-κB全基因組結合圖譜．結果見表2，SLC2A3基因區(qū)內富含大量NF-κB結合峰，其中富集倍數(shù)（Fold Enrichment，F(xiàn)E）大于1的結合峰158個，F(xiàn)E大于10的結合峰57個，F(xiàn)E大于20的結合峰5個．

表2 SLC2A3基因區(qū)內NF-κB結合峰分布情況

自SLC2A3基因區(qū)的3′端起依次將以上FE大于20的NF-κB結合峰命名為結合峰1～結合峰5．分析發(fā)現(xiàn)，結合峰1～3位于SLC2A3基因的3′端，結合峰4和5位于SLC2A3基因的5′端．結合峰1的FE最高，為29.34，結合峰3的FE次高，為26.413．最短和最長的結合峰分別為結合峰1和結合峰3（表3）．而且，結合峰1、3和4與DNase I超敏感位點（DNase I hypersensitive sites,DHSs）重合，結合峰1、2、3和4與H3K27Ac富集區(qū)重合（圖1）．以上結果表明，TNFα誘導NF-κB結合SLC2A3基因．

表3 SLC2A3基因區(qū)內富集倍數(shù)大于20的NF-κB結合峰特征

圖1 SLC2A3基因的NF-κB結合峰（FE＞20）

2.2 NF-κB結合峰內的κB位點特征

為了鑒定NF-κB是否直接結合SLC2A3基因，我們分析了NF-κB結合峰（FE大于20）內的κB位點分布情況．結果發(fā)現(xiàn)，NF-κB結合峰1～5分別含有3、4、6、8和4個κB位點（表4）．這些κB位點的CMS和MMS均超過0.8，被認為是經(jīng)典κB位點．并且結合峰2～5各含1個平均CMS為1的經(jīng)典κB位點，分別為“GGAAAACACT”（6～15）、“GGAAACTGCA”（1603～1612）、“GTGTATTTCC”（175～184）和“GGAAATTCGC”（589～598）．此結果表明這些κB位點與NF-κB結合矩陣的核心矩陣完全匹配（表4）．而且有些經(jīng)典κB位點同時被多個NF-κB結合矩陣匹配，比如結合峰3中的κB位點“GGGGGAAATCCCCTC”（700～713），被6個矩陣同時匹配（表4）．綜上所述，TNFα誘導NF-κB直接結合SLC2A3基因．此結果提示，TNFα可能誘導NF-κB調控SLC2A3基因表達．

表4 富集倍數(shù)大于20的NF-κB結合峰內κB位點特征

（續(xù)表4）

2.3 NF-κB轉錄活性的調節(jié)

利用GCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.gcbi.com.cn/gclib/html/index）分析發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，TNFα在很多類型的癌癥中高表達，比如TNFα在宮頸癌、食管癌和子宮內膜癌等癌癥中明顯高表達（圖2）．結合上述結果，推測TNFα誘導NF-κB轉錄調控SLC2A3可能是其在癌癥中高表達的分子機制．

圖2 TNFα的表達豐度

為了證明此推論，本研究用NF-κB活 性 誘 導 劑 （TNFα） 和 抑 制 劑（NF-κB/p65 siRNA）構建NF-κB轉錄活性差異的細胞模型．結果見圖3A，TNFα上調 HeLa細胞的 NF-κB，同時NF-κB/p65 siRNA 干 擾 TNFα 上 調 的NF-κB．

為了進一步驗證此細胞模型，我們檢測IL6、IL8和IL7R共3個已知NF-κB靶基因的表達情況．結果發(fā)現(xiàn)，TNFα誘導NF-κB顯著上調IL6、IL8和IL7R的表達，且此表達上調又能被NF-κB/p65 siRNA顯著干擾（圖4A）．這些檢測結果表明，我們已建立了NF-κB轉錄活性差異的HeLa細胞模型．采用類似的方法，我們還建立了NF-κB轉錄活性差異的HepG2細胞模型（圖3B和圖4B）．

圖3 qPCR檢測NF-κB的轉錄水平

圖4 qPCR檢測TNFα誘導NF-κB調控IL6，IL8和IL7R的情況

2.4 NF-κB轉錄調控SLC2A3表達

利用上述細胞模型檢測NF-κB對SLC2A3基因表達的調控情況，結果發(fā)現(xiàn)，HeLa細胞內TNFα誘導NF-κB上調SLC2A3的表達，NF-κB/p65 siRNA抑制TNFα誘導上調的SLC2A3（圖5A）．為了驗證此結果，我們又在NF-κB轉錄活性差異的HepG2細胞模型中進行類似的檢測并得出了一致的結果（圖5B）．以上檢測結果表明，TNFα誘導NF-κB上調SLC2A3基因的轉錄表達．換句話說，SLC2A3是NF-κB的上調靶基因．

圖5 qPCR檢測TNFα誘導NF-κB調控SLC2A3的情況

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)人類癌癥中高表達的SLC2A3基因起重要作用[11]．比如，高表達的SLC2A3與口腔癌的侵襲、大小、病理分期以及復發(fā)呈顯著正相關[12]，抑制SLC2A3的高表達能廢止mir-106a介導的膠質瘤細胞異常增殖和葡萄糖吸收[11]．因此，SLC2A3被認為是一個新的癌基因[11]．但是，至今SLC2A3高表達的機制不清．

分析NF-κB全基因組結合譜數(shù)據(jù)[9]，發(fā)現(xiàn)許多TNFα誘導的NF-κB結合峰分布于SLC2A3基因區(qū)．生物信息學方法分析表明，這些結合峰是由NF-κB結合產生的．而且這些NF-κB結合峰與DHSs等染色質上轉錄調控活躍區(qū)[13]重合或相鄰，提示NF-κB的結合可能對SLC2A3的轉錄表達有調控作用．而且我們也發(fā)現(xiàn)，TNFα在宮頸癌等多種癌癥中明顯高表達，因此推測TNFα誘導NF-κB轉錄調控SLC2A3可能是其在癌癥中高表達的分子機制．此后，我們構建并利用NF-κB轉錄活性差異的細胞模型研究發(fā)現(xiàn)，TNFα誘導NF-κB轉錄上調SLC2A3基因．此發(fā)現(xiàn)與在p53缺失的小鼠MEF細胞中檢測得到的結果相一致[8]．至此我們總結提出，NF-κB結合并轉錄調控SLC2A3基因．即，SLC2A3為NF-κB的靶基因．

眾所周知，代謝重編程是腫瘤細胞標志之一．腫瘤細胞改變并增加了對葡萄糖吸收和消耗的方式來滿足其快速生長增殖所需的生物量[14]．最近研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞上調SLC2A家族基因可能是其高效利用葡萄糖的關鍵機制之一[5,15]．已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，p53缺失的小鼠MEF細胞中NF-κB通過其靶基因SLC2A3介導的糖酵解相關的信號調控回路可能促進H-Ras誘導MEF細胞惡性轉化[8]．因此，抑制NF-κB活性可降低癌細胞的代謝活性[16]．本研究同時在兩種人類癌細胞中證明SLC2A3為NF-κB的上調靶基因，提示NF-κB可能通過轉錄上調其靶基因SLC2A3參與人類癌癥的代謝過程，從而影響癌癥進展．因此，本研究為深入洞察NF-κB在人類癌癥發(fā)展中的分子功能提供了新的視角．

[1]Masin M,Vazquez J,Rossi S,et al.GLUT3 is induced during epithelial-mesenchymal transition and promotes tumor cell pro?liferation in non-small cell lung cancer[J].Cancer Metab,2014,2:11.

[2]Simpson I A,Dwyer D,Malide D,et al.The facilitative glucose transporter GLUT3:20 years of distinction[J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2008,295(2):E242-253.

[3]McKinnon B,Bertschi D,Wotzkow C,et al.Glucose transporter expression in eutopic endometrial tissue and ectopic endome?triotic lesions[J].J Mol Endocrinol,2014,52(2):169-179.

[4]Starska K,Forma E,Jozwiak P,et al.Gene and protein expression of glucose transporter 1 and glucose transporter 3 in human laryngeal cancer-the relationship with regulatory hypoxia-inducible factor-1alpha expression,tumor invasiveness,and pa?tient prognosis[J].Tumour Biol,2015,36(4):2309-2321.

[5]Krzeslak A,Wojcik K K,Forma E,et al.Expression of GLUT1 and GLUT3 glucose transporters in endometrial and breast can?cers[J].Pathol Oncol Res,2012,18(3):721-728.

[6]Zhou F,Xu X,Wang D,et al.Identification of novel NF-kappaB transcriptional targets in TNFalpha-treated HeLa and HepG2 cells[J].Cell Biol Int,2017,41(5):555-569.

[7]Gupta S C,Sundaram C,Reuter S,et al.Inhibiting NF-kappaB activation by small molecules as a therapeutic strategy[J].Bio?chim Biophys Acta,2010,1799(10-12):775-787.

[8]Kawauchi K,Araki K,Tobiume K,et al.p53 regulates glucose metabolism through an IKK-NF-kappaB pathway and inhibits cell transformation[J].Nat Cell Biol,2008,10(5):611-618.

[9]Xing Y,Yang Y,Zhou F,et al.Characterization of genome-wide binding of NF-kappaB in TNFalpha-stimulated HeLa cells[J].Gene,2013,526(2):142-149.

[10]Wong D,Teixeira A,Oikonomopoulos S,et al.Extensive characterization of NF-kappaB binding uncovers non-canonical mo?tifs and advances the interpretation of genetic functional traits[J].Genome Biol,2011,12(7):R70.

[11]Dai D W,Lu Q,Wang L X,et al.Decreased miR-106a inhibits glioma cell glucose uptake and proliferation by targeting SLC2A3 in GBM[J].BMC Cancer,2013,13:478.

[12]Estilo C L,O-charoenrat P,Talbot S,et al.Oral tongue cancer gene expression profiling:Identification of novel potential prognosticators by oligonucleotide microarray analysis[J].BMC Cancer,2009,9:11.

[13]Deng T,Zhu Z I,Zhang S,et al.Functional compensation among HMGN variants modulates the DNase I hypersensitive sites at enhancers[J].Genome Res,2015,25(9):1295-1308.

[14]Renner K,Singer K,Koehl G E,et al.Metabolic Hallmarks of Tumor and Immune Cells in the Tumor Microenvironment[J].Front Immunol,2017,8:248.

[15]Ha T K,Chi S G.CAV1/caveolin 1 enhances aerobic glycolysis in colon cancer cells via activation of SLC2A3/GLUT3 tran?scription[J].Autophagy,2012,8(11):1684-1685.

[16]Zhou F,Xu X,Wu J,et al.NF-kappaB controls four genes encoding core enzymes of tricarboxylic acid cycle[J].Gene,2017,621:12-20.