全外顯子組測序在遺傳性乳腺癌易感基因發掘中的應用

周楠，楊康

全外顯子組測序在遺傳性乳腺癌易感基因發掘中的應用

周楠1，楊康2△

遺傳易感因素是誘發乳腺癌的重要原因之一。乳腺癌易感變異根據個體發病率可分為低外顯率、中外顯率和高外顯率3種。傳統方法限制了中外顯率和高外顯率乳腺癌易感基因的發掘，而全外顯子測序技術為乳腺癌易感基因的發掘提供了快速高效的方法。目前，利用全外顯子組測序發現了一些此前未發現的乳腺癌易感基因，這些易感基因對遺傳性乳腺癌發病的危險評估和發病機制的研究提供了有益指導。本文對遺傳性乳腺癌的全外顯子組測序研究進行綜述，對試驗設計、數據過濾策略、統計意義和關聯分析進行討論。

乳腺腫瘤；疾病遺傳易感性；序列分析；全外顯子組測序

遺傳易感因素是誘發乳腺癌的重要原因之一［1］，遺傳變異相對風險值常被作為評估遺傳因素的重要參數，高外顯率易感基因變異相對風險值大于4［2］，中外顯率易感基因變異相對風險值在2～4之間［3］，低外顯率易感基因變異相對風險值小于2［4］。近年來，全外顯子組測序技術得到了飛快發展，并在遺傳性乳腺癌的研究中得到廣泛應用。本文就全外顯子組測序技術在遺傳性乳腺癌中的研究進行綜述，對試驗設計、數據過濾策略和關聯分析進行討論。

1 發掘乳腺癌易感基因的方法

分析乳腺癌易感基因的傳統方法主要有遺傳連鎖分析法和候選基因分析法。乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2是利用遺傳連鎖分析法發現的［5］，但是之后利用該方法沒有發現其他乳腺癌易感基因。利用連鎖分析在染色體上的定位經常是厘摩（centimorgan,cM）級別，其中可能包含成百上千個基因，因此對于復雜疾病，連鎖分析只能提供部分參考性意見。利用候選基因分析法發現了很多BRCA通路中的基因，這些基因被認為是乳腺癌易感基因的候選基因［2］。這種方法的局限性在于對基因的選擇太依賴于已知的乳腺癌信號通路。

隨著二代測序技術的發展，全外顯子組測序已被廣泛應用于遺傳病和癌癥研究中［6］。全外顯子組測序是指利用高效的序列捕獲技術，將全基因組范圍內的外顯子區域DNA捕獲、富集后進行高通量測序的基因組分析方法［7］。相比全基因組測序，該方法能夠迅速獲得所有外顯子區域的遺傳信息，在大幅提升效率的同時也降低了成本，同時可在減少數據分析量的基礎上有針對性地得到大部分全基因組測序所能得到的信息［8］。在過去幾年里，全外顯子組測序技術得到飛快發展，并在遺傳性乳腺癌的研究中得到廣泛應用［9］。目前為止，至少有45個關于遺傳性乳腺癌的研究應用了全外顯子組測序的方法。

2 乳腺癌易感基因的全外顯子組分析策略

2.1 試驗設計 為檢測增加遺傳性乳腺癌風險的罕見變異，研究者通常選用兩種不同的策略。第一種方法是對患者家族進行全外顯子組測序［10］，通過不同個體間比較，得到遺傳變異位點，一些變異位點可能位于遺傳性乳腺癌易感基因中，隨后對候選變異位點進行關聯分析。第二種方法是對一些不具血緣關系的患者進行全外顯子組測序，這種方法能發現高度異質性的位點，進而為遺傳性乳腺癌的研究提供線索，當在不具有血緣關系的患者個體中發現遺傳重疊時，需通過相關性分析檢測遺傳重疊的顯著性。

研究表明：在特定基因中有一個或一組變異位點，該位點的變異與遺傳性乳腺癌的發生密切相關［11-12］。有學者對患者家族進行全外顯子組測序，6%（6/107）的患者家族檢測出新的遺傳變異位點，94%（101/107）的患者家族沒有發現與乳腺癌危險變異存在關聯的變異位點［13］。極少有研究利用二代測序進行已知乳腺癌易感基因的遺傳變異篩選，全外顯子組測序技術出現之前，多數研究僅在患者家族中進行乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的遺傳變異篩選，而篩選結果證明是擬表型［11-12］。因此，多數借助全外顯子組測序技術在患者家族中進行的研究均未提及已知乳腺癌易感基因的突變［13］。Cybulski等［14］對沒有血緣關系的患者個體進行全外顯子組測序研究，發現只有5例患者具有RECQL的截斷突變。Snape等［15］的研究發現只有4例患者存在已知的乳腺癌易感基因變異。因此，完善全外顯子組測序的試驗設計具有十分重要的意義。

2.2 數據過濾策略 利用全外顯子組測序技術，每個個體一共能得到20 000～30 000個單核苷酸多態性（SNP）和插入/缺失（insertion/deletion,Indel）變異位點［16-17］，因此如何篩選有效變異位點成為難題［18］。遺傳性乳腺癌的全外顯子組測序研究強調候選變異是具有潛在致病性且與癌癥相關的變異位點［19-25］。數據過濾策略主要目的是對不同變異位點進行優先級排序，主要有分離濾波消除變異和分層過濾兩種方法。

分離濾波消除變異基于“被過濾掉的變異是不致病的”這樣一種假設［18］。基于罕見變異增加患癌風險的假設，利用最小等位基因頻率進行分析是常用的方法。高外顯率乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2在人群中的等位基因頻率為0.125%～0.25%［26］，最小等位基因頻率小于1%；中外顯率乳腺癌易感基因TP53和CHEK2的最小等位基因頻率也均低于1%［27］。因此，最小等位基因頻率小于1%、具有潛在致病性且與癌癥相關的基因可作為遺傳性乳腺癌易感基因。目前，至少有4項乳腺癌全外顯子組研究采取這種分析方法［19-22］。遺傳性乳腺癌易感基因在普通人群中以較低的等位基因頻率存在，在全外顯子組研究中設置較低的最小等位基因頻率閾值（＜1%）對于高效、快速地發掘遺傳性乳腺癌易感基因更有利［21］。

在個體20 000～30 000個遺傳變異中，如何有效地從非風險等位變異中發現風險等位變異仍困難重重。為了進行有效篩選，基于基因功能進行分層過濾是常用的方法。大多數已知的遺傳性乳腺癌風險等位基因參與基因組的完整性或者DNA修復，因此，可重點關注參與DNA修復過程相關基因的有害突變，同時刪除無義突變，以減少測試壓力［22］。分層過濾策略雖然可以快速識別有效變異位點，但它基于已有的基因功能研究，有時會導致疏漏。

2.3 統計意義和關聯分析 在全基因組關聯分析中，顯著性閾值為5×10-8；但在全外顯子組測序分析中，罕見變異的研究仍處于起步階段，顯著性閾值尚不統一［24］。在全外顯子組測序分析中1個基因是1個基本單位，顯著性閾值可設置為1.7×10-6，該值非常保守，是利用多重檢驗Bonferroni校正30 000個獨立測試得到的，目前多個全外顯子組研究均使用這一顯著性閾值［24-27］。

目前，全外顯子組研究雖然存在一些不足，但是利用這種手段仍可發現一些罕見的變異位點，然后通過關聯分析對結果進行初步驗證。Cybulski等［14］在波蘭和魁北克人群中發現了乳腺癌易感基因變異位點，最終確定2個RECQL基因中的截斷突變與遺傳性乳腺癌之間存在顯著關聯。樣本量大能提高權重（power）、降低P值，利于發現更多遺傳性乳腺癌易感基因。Gracia-Aznarez等［12］發現FANCM基因發生無義突變時和遺傳性乳腺癌之間不存在關聯，但Peterlongo等［25］對8 635例遺傳性乳腺癌患者和6 625例正常人進行基因分型分析，提供了足夠的權重，P值為0.017，證明兩者之間存在關聯。

3 展望

許多危險因素可誘導乳腺癌的發生，平均每8名婦女中就有1名患乳腺癌［1］。發現新的乳腺癌易感基因對于風險評估、遺傳咨詢和疾病機制研究有十分重要的意義。對于那些不是因為乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2變異而引發乳腺癌的患者，其發病原因可能與SNP有關［16］。因此，挖掘與乳腺癌發病相關的SNP位點的全外顯子組測序方法被廣泛應用。目前為止，至少70個SNP位點與乳腺癌的發病有關［20-27］，發現更多遺傳性乳腺癌易感基因及其變異位點對于乳腺癌的治療和預防具有十分重要的意義。在遺傳性乳腺癌的研究中，利用全外顯子組測序已獲得大量數據，為遺傳性乳腺癌的研究提供了豐富的資源。

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（2016-12-26收稿 2017-04-21修回）

（本文編輯 李國琪）

Whole exome sequencing in the application of hereditary breast cancer susceptibility gene discovery

ZHOU Nan1,YANG Kang2△
1 Department of Radiotherapy,the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Huhehaote 010050,China;2 School of Life Science,Tianjin University△

E-mail:Sunny20160826@163.com

Genetic susceptibility factor is one of the important reasons to induce breast cancer.Breast cancer risk variants are divided into three categories including high,moderate and low penetrances.Traditional BC susceptibility gene discovery approaches limit the search for breast cancer susceptibility genes with high and moderate risk variants.Whole exome sequencing technology provides a quick and efficient method to discover breast cancer susceptibility genes.At present,a number of breast cancer susceptibility genes have been identified by whole exome sequencing method,which provides useful guidance for the risk assessment and pathogenesis of hereditary breast cancer.In this paper,we reviewed the whole exome sequencing technology and discussed the experimental design,data filtering strategy,statistical significance and correlation analysis.

breast neoplasms;genetic predisposition to disease;sequence analysis;whole exome sequencing

R737.9

：A

10.11958/20161587

內蒙古青年創新科技計劃項目（2015FB051）；天津市自然科學基金青年項目（16JCQMJC09800）

1內蒙古醫科大學附屬醫院放療科（郵編010050）；2天津大學生命科學學院

周楠（1986），女，本科，護師，主要從事腫瘤方向研究

△通訊作者 E-mail:Sunny20160826@163.com