通心絡調控p38 MAPK通路抑制細胞外基質沉積的研究

仝宇 高彥彬 王曉磊 田年秀 耿建國

·論著·

通心絡調控p38 MAPK通路抑制細胞外基質沉積的研究

仝宇 高彥彬 王曉磊 田年秀 耿建國

目的 觀察通心絡對自發性2型糖尿病KK-Ay小鼠腎組織p38 MAPK信號通路、TGF-β1及細胞外基質FN、Col-Ⅳ的影響，探討其抑制糖尿病腎病腎臟纖維化的作用機制。方法采用自發性2型糖尿病KK-Ay小鼠建立糖尿病腎病模型，隨機分為模型組、通心絡組和纈沙坦組各15只，設C57BL/6J小鼠15只為正常組；造模組連續給藥12周，比較各組KK-Ay小鼠空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)、體重(body weight，BW)、腎重(kidney weight，KW)、腎重指數=KW/BW；24小時尿微量白蛋白(24 hours urinary microalbumin，24 h mALB)；血清肌酐(serum creatinine，SCr)、血清尿素(Urea)的水平；檢測轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、p38、P-p38、纖維連接蛋白(fibronectin，FN)，Ⅳ型膠原蛋白(Collagen in Serum-Ⅳ，Col-Ⅳ)等表達水平。結果與正常組比較，模型組空腹血糖、體重、腎重、腎重指數、24h mALB、SCr、Urea均明顯升高(P0.05)，腎組織P- p38、FN、Col-Ⅳ蛋白表達升高(P<0.05)。與模型組比較，通心絡組和纈沙坦組FBG無明顯變化(P> 0.05)；體重、腎重減輕、腎重指數、24h mALB、SCr、Urea均降低(P<0.05)，腎組織P-p38、FN、Col-Ⅳ蛋白表達減少(P<0.05)，但給藥組間無顯著差異(P>0.05)。各組間p38表達均無統計學差異(P>0.05)。結論提示通心絡無明顯降糖作用；通心絡可降低自發性2型糖尿病KK-Ay小鼠24 h mALB、SCr、Urea，保護腎功能；通心絡可抑制TGF-β1、P-p38蛋白的過度表達，減少FN、Col-Ⅳ等細胞外基質在腎組織的沉積，從而抑制腎臟的纖維化，延緩糖尿病腎病的發生發展。

通心絡； 糖尿病腎病； 細胞外基質； p38 MAPK信號轉導通路

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病嚴重的微血管并發癥之一，也是導致糖尿病患者死亡的主要原因之一，DN在歐美已經成為終末期腎病的首位原因，在國內也是終末期腎功能衰竭的主要病因[1-2]。

糖尿病腎病的病理改變主要有腎小球肥大、細胞外基質(extracellular matrix，ECM)積聚、腎小球硬化等。其中ECM沉積是腎小球纖維化的基礎，是DN發展為終末期腎病的關鍵。轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是重要的促纖維化因子，它可以促進腎小球系膜細胞過度增殖，增加細胞外基質蛋白合成并抑制其降解，最終導致細胞外基質的過度沉積。p38 MAPK通路(p38 mitogen-activated proteinkinase，p38 MAPK)可以通過調節TGF-β1、MMPs的表達等多種途徑影響細胞外基質成分生成，從而影響糖尿病腎病的進展[3]。通心絡是根據中醫絡病理論研制出的通絡新藥，在臨床治療心腦腎疾病方面取得了確切的療效[4-7]，但在治療DN方面機制尚未十分明確，故本課題通過觀察通心絡對自發性2型糖尿病KK-Ay小鼠腎組織p38 MAPK信號通路及細胞外基質FN、Col-Ⅳ的影響，探討其抑制糖尿病腎病腎臟纖維化的作用機制，為通心絡防治DN提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡SPF級雄性KK-Ay小鼠45只，生產許可證：SCXK(京)2014-004；8周齡SPF級雄性C57BL/6J小鼠15只，生產許可證：SCXK(京)2014-004，均購自北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.2 實驗藥品

通心絡超微粉(主藥為人參、水蛭、全蝎、土鱉蟲、蜈蚣、蟬蛻、赤芍等，河北以嶺藥業，實驗室專用藥，批號：20121215)；纈沙坦膠囊(北京諾華制藥有限公司，批號：X1964)。

1.3 試劑和儀器

TGF-β1抗體(Abcam，批號：ab64715)、p38抗體(Abcam，批號：ab31828)、P-p38抗體(CST，批號：9216S)、FN抗體(Abcam，批號：ab61213)、Col-Ⅳ抗體(Abcam，批號：ab6586)。

血糖儀(愛科來國際商貿有限公司，CareSens POP)、酶標儀(美國伯騰儀器有限公司，BioTek EXL800)、電泳儀(美國Wealtec，ELITE200)。

1.4 動物模型的建立與分組

本實驗采用8周齡2型糖尿病KK-Ay小鼠建立糖尿病腎病模型，予以高脂飼料喂養。設立C57BL/6J小鼠為正常組，予以普通飼料喂養。4周后，測定KK-Ay小鼠血糖≥16.7 mmol/L，且24小時尿微量白蛋白(24 hours urinary microalbumin，24 h mALB)與正常組比明顯升高(P< 0.05)則視為糖尿病腎病模型建立成功。將造模成功的KK-Ay小鼠隨機分為模型組、通心絡組、纈沙坦組各15只。通心絡組予以通心絡0.75 g/(kg·d)灌胃，纈沙坦組予以纈沙坦10 mg/(kg·d)灌胃，正常組及模型組予以等體積蒸餾水灌胃，連續給藥12周。

1.5 標本的收集與處理

連續給藥12周后，各組小鼠隔夜禁食8小時，次日清晨摘眼球取血，分離出血清4℃保存。摘取雙側腎臟，去包膜，左腎稱重，右腎部分保存于液氮，部分用4%多聚甲醛固定。

1.6 觀察指標及檢測方法

1.6.1 FBG、24h mALB、血肌酐(serum creatinine,SCr)、尿素(Urea)及KW/BW的測定 血糖儀測血糖，ELISA法測24h mALB，自動生化分析儀測定血清肌酐、血清尿素。電子天平測定體重和腎重，計算腎重指數=KW/BW。

1.6.2 Western Blot法檢測腎組織中TGF-β1、p38、P-p38、FN、Col-Ⅳ等表達水平 將腎組織研磨粉碎裂解后，離心取上清測定蛋白濃度。取相同含量蛋白在12%SDS-PAGE膠上電泳分離，轉膜，3% BSA-TBST封閉振蕩1小時，采用TGF-β1、p38、P-p38、FN、Col-Ⅳ抗體4℃孵育過夜，3次洗膜后，每次5分鐘加入二抗室溫振蕩1小時， TBS-T漂洗液3次洗膜,每次5分鐘。用ECL試劑暗室內膠片曝光。對掃描圖像的目的條帶進行灰度分析。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 各組小鼠空腹血糖、體重、腎重、腎重指數的比較

與正常組比較，模型組空腹血糖，體重、腎重、腎重指數均增加(P<0.05)。與模型組比較，通心絡組和纈沙坦組體重、腎重減輕，腎重指數降低(P<0.05)，給藥組組間比較無統計學差異(P>0.05)；FBG無明顯變化(P>0.05)。提示通心絡無明顯降糖作用，但可降低小鼠腎重，抑制腎臟肥大。如表1所示。

表1 各組小鼠血糖、體重、腎臟及腎重指數比較±s)

注：與正常組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05。

2.2 各組小鼠24 h mALB、SCr、Urea的比較

與正常組比較，模型組24 h mALB、SCr、Urea明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，通心絡組和纈沙坦組24 h mALB、SCr、Urea降低(P<0.05)，給藥組組間比較無統計學差異(P>0.05)。提示通心絡可降低小鼠24 h mALB、SCr、Urea，保護腎功能。如表2所示。

表2 各組小鼠24h mALB、SCr、Urea比較

注： 與正常組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05。

2.3 各組小鼠腎組織FN、Col-Ⅳ蛋白表達比較

與正常組相比，模型組小鼠FN、Col-Ⅳ蛋白顯著增加(P<0.05) ；與模型組相比，各給藥組小鼠FN、Col-Ⅳ蛋白表達減少(P<0.05) ，給藥組組間差異無統計學意義(P>0.05)。提示通心絡可減少腎組織細胞外基質堆積。如表3所示。

表3 各組小鼠FN、Col-Ⅳ蛋白表達量的比較

注： 與正常組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP>0.05。

2.4 各組小鼠腎組織TGF-β1、p38、P-p38蛋白表達比較

與正常組相比，模型組小鼠TGF-β1表達顯著增加(P<0.05) ；與模型組相比，各給藥組小鼠TGF-β1表達下降(P<0.05)，給藥組間差異無統計學意義(P>0.05)。提示通心絡能夠抑制TGF-β1的過度表達。

p38表達組間均無差異(P>0.05)。與正常組相比，模型組小鼠P-p38蛋白表達量顯著增加(P<0.05) ；與模型組相比，各給藥組小鼠P-p38表達下降(P<0.05)，給藥組間差異無統計學意義(P>0.05)。提示通心絡可減少腎組織p38的磷酸化。如表4所示。

表4 各組小鼠TGF-β1、p38、P-p38蛋白表達量的比較

注： 與正常組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05。

3 討論

DN病理改變復雜仍未完全闡明。系膜細胞是腎小球內的固有細胞，可以分泌細胞外基質和細胞因子、吞噬并清除大分子物質，同時還具有類似血管平滑肌細胞的收縮功能[8]。在DN發病過程中，系膜細胞通過增殖和其功能結構的改變而致病，最終導致腎小球硬化，發生腎衰竭。控制系膜細胞增殖，減少細胞外基質的堆積，對于阻止DN出現、減緩DN的進展有重要意義。ECM是圍繞系膜細胞的非彌散的固相介質，可以調節系膜細胞的增生和分泌各種活性物質[9]，ECM增多可導致系膜增生系膜細胞增殖，系膜細胞增殖又可分泌ECM，進一步導致ECM的積聚。轉化生長因子是存在于細胞內或細胞間的一組調節細胞及基質生長、分化的細胞因子，被公認為是最強的致纖維化因子，具有獨特的促進ECM堆積的功能[10]。TGF-β1可刺激ECM成分，如Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原，FN等的表達增加。p38 MAPK信號通路是細胞信號傳遞系統的交匯點或共同道路,可以被細胞內外各種不同刺激所激活，其磷酸化表達增加，從而影響細胞的多種生物效應[11]。p38 MAPK在腎臟纖維化中發揮作用的可能機制有：(1)與轉化生長因子β1相互作用。p38 MAPK調節TGF-β1的轉錄與合成，TGF-β1又能激活p38 MAPK通路使其磷酸化，從而形成惡性循環加重腎小球的硬化；(2)通過調節炎性因子的表達，參與腎臟的炎癥和纖維化進程；(3)活化轉錄因子，從而調節目的基因的表達，導致細胞外基質合成增多[12]。因此，減少p38 MAPK的磷酸化，抑制TGF-β1的表達，能減緩系膜細胞的增殖，減少細胞外基質的堆積，從而延緩DN的進展。

中醫古籍中并沒有糖尿病腎病獨立病名記載，高彥彬教授[13]認為DN從尿中出現微量蛋白到終末期腎衰其病位始終不離腎臟，均屬于腎病范疇，而這種腎病繼發于消渴病，因此主張將其命名為“消渴病腎病”。根據中醫絡病理論，認為絡病是貫穿糖尿病腎病的整個過程的病理狀態。(1)發病之初，病在肝腎，氣陰兩虛，腎絡瘀滯。腎主水，司開闔，消渴病日久，腎陰虧損，陰損耗氣，而致腎氣虛損，固攝無權，開闔失司，可見尿頻尿多，尿濁而甜；肝腎陰虛，陰虛陽亢，則頭暈、耳鳴、血壓偏高。(2)病程遷延，陰損及陽，可致脾腎虛衰，腎絡瘀阻，致使水液代謝障礙，水濕潴留，泛溢肌膚，出現面足水腫，甚則胸水腹水；陽虛不能溫煦四末，則畏寒肢冷。(3)病變晚期，腎絡瘀結，腎體勞衰，腎用失司，濁毒內停，五臟受損，氣血陰陽衰敗。腎陽衰敗，水濕泛濫，濁毒內停，變證蜂起。濁毒上泛，胃失和降，則惡心嘔吐、食欲不振；脾腎衰敗，濁毒內停，血液化生無源，則見面色萎黃、唇甲舌淡等血虛之候；水濕濁毒上犯，凌心射肺，則心悸氣短，胸悶喘憋不能平臥；腎元衰竭，濁邪壅塞三焦，腎關不開，則少尿或無尿，發展為關格病終末階段[14-15]。DN各個時期病理環節雖有所不同，但是絡脈瘀阻是其共性特征，治療應采用化瘀通絡的方法。通心絡是根據中醫絡病理論研制出的通絡新藥，其主要成分包括人參、水蛭、全蝎、土鱉蟲、蜈蚣、蟬蛻、赤芍、降香、酸棗仁(炒)、冰片等，有益氣活血、化瘀通絡的功效，既能補絡虛又能通絡瘀。臨床應用發現通心絡可降低早期DN患者24小時尿蛋白、BUN以及Urea，改善腎功能[16-18]。

前期實驗發現，通心絡調控降解酶系MMP-9/TIMP-1抑制細胞外基質沉積[19-20]。本課題采用自發性2型糖尿病KK-Ay小鼠建立糖尿病腎病模型，觀察通心絡對小鼠腎組織p38 MAPK通路、TGF-β1和細胞外基質FN、Col-Ⅳ表達的影響。結果顯示，通心絡可以保護腎功能，抑制TGF-β1的過度表達，減少p38的磷酸化，從而減少FN、Col-Ⅳ等ECM在腎組織的沉積，抑制腎臟纖維化，延緩DN的發生發展，闡明了通心絡影響細胞外基質積聚的又一有效作用機制，為通心絡用于DN的防治提供科學依據。

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(本文編輯： 韓虹娟)

Research ofTongxinluoregulates and controls the expressions of p38 MAPK and extracellular matrix deposition

TONGYu，GAOYanbin，WANGXiaolei，etal.

CapitalMedicalUniversitySchoolofTraditionalChineseMedicine&BeijingKeylaboratoryofTCMCollateralDiseaseTheoryResearch，Beijing100069，ChinaCorrespondingauthor:GAOYanbin，E-mail:dfyynfm@163.com

Objective To investigate the influence ofTongxinluo(TXL) on renal tissue p38 MAPK signaling pathway, transforming growth factor β1(TGF-β1), extracellular matrix FN and Col-Ⅳ in spontaneous T2DM KK-Ay mice, and to explore the mechanism of TXL inhibiting renal fibrosis in diabetic nephropathy. Methods 45 spontaneous T2DM KK-Ay mice were used to induced diabetic nephropathy models, and randomly divided into model group, TXL group and western medicine group, 15 mice in each group. 15 C57BL/6J mice were chosen as the normal group. Diabetic nephropathy models were treated for 12 weeks. Blood glucose(FBG), body weight(BW), kidney weight(KW), index of kidney weight= KW/BW, renal function(Scr, Urea) as well as urinary micro-albumin biochemical parameters(mALB) were detected; TGF-β1, p38, P-p38, FN, Col-Ⅳ were detected with Western blot. Results Comparing with the normal group, the expressions of FBG, urinary micro-albumin, Scr, Urea were significantly increased(P<0.05), and the expressions of TGF-β1, P-p38, FN, Col-Ⅳ were increased(P<0.05). On the other hand, comparing with the model group, the expressions of FBG, urinary micro-albumin, Scr, Urea were decreased in both administration groups(P<0.05). However, the expression of FBG stayed unchanged(P<0.05). Moreover, there were no differences in all groups in the expressions of p38(P<0.05). Conclusion TXL had no effect on blood glucose, but it could reduce the expressions of TGF-β1, inhibit the phosphorylation of p38 and affect extracellular matrix deposition, which might become one of the mechanisms for its treatment of DN.

Tongxinluo； Diabetic nephropathy； Extracellular matrix； p38 MAPK pathway

國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)(2012CB518602)

100069 北京，首都醫科大學中醫藥學院[仝宇(碩士研究生)、高彥彬、王曉磊(博士研究生)、田年秀(博士研究生)、耿建國]；中醫絡病研究北京市重點實驗室[仝宇(碩士研究生)、高彥彬、王曉磊(博士研究生)、田年秀、耿建國]

仝宇(1990- )，女，2014級在讀碩士研究生。研究方向：中醫藥防治糖尿病及其并發癥研究。E-mail：ty_tonya@sina.com

高彥彬(1960- )，博士，教授，主任醫師，博士生導師。研究方向：中醫藥防治糖尿病及其并發癥的臨床和基礎研究。E-mail：dfyynfm@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.02.004

2016-10-23)