穩(wěn)定表達(dá)人BACE1啟動(dòng)子及熒光素酶報(bào)告基因HEK293細(xì)胞株的建立*

鄧常青，朱炳林，龍 艷，羅 偉，陳國(guó)俊△

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016；2.重鋼總醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，重慶 400037)

論著·基礎(chǔ)研究

穩(wěn)定表達(dá)人BACE1啟動(dòng)子及熒光素酶報(bào)告基因HEK293細(xì)胞株的建立*

鄧常青1,2，朱炳林1，龍 艷1，羅 偉1，陳國(guó)俊1△

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016；2.重鋼總醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，重慶 400037)

目的 對(duì)人β位點(diǎn)裂解酶-1(BACE1)基因核心啟動(dòng)子進(jìn)行克隆，構(gòu)建攜帶BACE1基因啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告載體，篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株并分析其轉(zhuǎn)錄活性。方法 提取人胚腎HEK293細(xì)胞基因組DNA，以其為模板，PCR擴(kuò)增BACE1核心啟動(dòng)子(-691～+67)并克隆至熒光素酶報(bào)告載體pGL4.21中，構(gòu)建BACE1基因啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告載體pGL4.21-BACE1，將其轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞(無(wú)啟動(dòng)子的pGL4.21載體作陰性對(duì)照)，利用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)株后檢測(cè)其轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果 成功擴(kuò)增到758 bp的BACE1核心啟動(dòng)子，pGL4.21-BACE1載體經(jīng)雙酶切鑒定正確；HEK293細(xì)胞被該載體轉(zhuǎn)染后經(jīng)嘌呤霉素篩選得到6株穩(wěn)定表達(dá)BACE1啟動(dòng)子的細(xì)胞株，其轉(zhuǎn)錄活性分別是對(duì)照組(HEK293/pGL4.21)的(134.7±22.3)、(634.0±13.9)、(437.6±6.1)、(805.5±5.5)、(492.8±59.1)、(1 021.1±46.6)倍(P=0.001)。結(jié)論 成功構(gòu)建了人BACE1基因啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告載體。

β位點(diǎn)裂解酶-1；核心啟動(dòng)子；熒光素酶報(bào)告載體；高通量藥物篩選

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是一種神經(jīng)退行疾病，近年來(lái)其發(fā)病率不斷增高。現(xiàn)有許多證據(jù)支持淀粉樣蛋白(amyloid beta,Aβ)的沉積是AD主要致病機(jī)制之一[1]。因此，減少Aβ沉積成為治療AD的一條重要途徑。β位點(diǎn)裂解酶-1(BACE1)是體內(nèi)主要的β-分泌酶，是裂解淀粉樣前體蛋白(APP)產(chǎn)生Aβ的限速酶。Aβ具有神經(jīng)毒性，可引起神經(jīng)突觸功能障礙、神經(jīng)元丟失，進(jìn)而導(dǎo)致認(rèn)知功能受損[2]。研究表明，在小鼠腦內(nèi)注射BACE1的小干擾RNA可減輕APP轉(zhuǎn)基因小鼠的Aβ沉積和提高認(rèn)知功能[3-6]，這說(shuō)明抑制BACE1表達(dá)會(huì)改善Aβ相關(guān)的認(rèn)知功能障礙，因此β-分泌酶BACE1被作為開(kāi)發(fā)AD藥物的潛在靶點(diǎn)。

目前，BACE1基因單核苷酸多態(tài)性與AD發(fā)病是否相互作用尚未定論[7-8]，而針對(duì)BACE1分子的靶向治療有望為治療AD提供新思路，但對(duì)于BACE1分子的上游調(diào)控機(jī)制仍不清楚。為此本試驗(yàn)通過(guò)克隆人BACE1基因核心啟動(dòng)子區(qū)，構(gòu)建熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)并篩選其穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究BACE1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、多態(tài)性分析及其高通量藥物篩選提供有力工具。

1 材料與方法

1.1 材料 人胚腎HEK293細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存；Phanta HS高保真DNA聚合酶購(gòu)自Vazyme公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB公司；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒、熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL4.21、熒光素酶檢測(cè)試劑購(gòu)自Promega公司；TRIzol、脂質(zhì)體2000購(gòu)自Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；嘌呤霉素、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自Sigma公司；感受態(tài)細(xì)胞DH5α購(gòu)自北京鼎國(guó)公司；引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。其余試劑為進(jìn)口分析純。

1.2 方法

1.2.1 人基因組模板的制備 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK293細(xì)胞，采用TRIzol法[9]提取基因組DNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 人BACE1基因啟動(dòng)子的擴(kuò)增 以基因組DNA為模板，采用 Phanta HS高保真DNA聚合酶以特異性引物擴(kuò)增BACE1基因上游約758 bp的核心啟動(dòng)子(-691～+67)區(qū)，上游引物：5′-CTA GCT AGC CAG CCA TTT CTC CTC AGT CTG-3′，下游引物：5′-CCG CTC CTC GAG TCA GGC CAC CAT AAT CCA GCT-3′，下劃線分別為NheI和XhoI酶切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)體系為：10×PCR緩沖液3.0 μL，dNTPs 1.0 μL，上下游引物各0.5 μL (10 μmol/L)，Phanta HS酶0.5 μL，基因組DNA 3.0 μL，加ddH2O補(bǔ)至30.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火60 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3 BACE1基因啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建 PCR產(chǎn)物和pGL4.21載體經(jīng)NheI和XhoI雙酶切后，在T4 DNA連接酶作用下16 ℃連接過(guò)夜并轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取2個(gè)氨芐青霉素篩選的陽(yáng)性克隆。再經(jīng)NheI和XhoI雙酶切鑒定后送上海英駿公司測(cè)序，測(cè)序正確的命名為pGL4.21-BACE1，提取質(zhì)粒后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)及穩(wěn)定表達(dá)株的篩選 HEK293細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和 100 μg/mL鏈霉素的 DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將匯合度約80%的HEK293細(xì)胞以4×105接種6孔板，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至約70%～80%匯合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用Opti-MEM培養(yǎng)基分別稀釋載體pGL4.21-BACE1(每孔5 μg)和脂質(zhì)體(每孔5 μL)(單獨(dú)轉(zhuǎn)染pGL4.21作為陰性對(duì)照組)，室溫孵育5 min，載體和脂質(zhì)體混合后室溫孵育20 min，加入HEK293細(xì)胞中，37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后48 h采用1 μg/mL濃度的嘌呤霉素篩選，篩選第14天時(shí)采用96孔板有限稀釋法克隆化，待單細(xì)胞長(zhǎng)滿后轉(zhuǎn)至24孔板繼續(xù)培養(yǎng)，然后依次轉(zhuǎn)至12孔板、6孔板及10 cm培養(yǎng)皿繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)(此過(guò)程2～3個(gè)月)。得到來(lái)自6株單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，用化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)其轉(zhuǎn)錄活性。選取熒光強(qiáng)度最高的進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)并命名為HEK293/pGL4.21-BACE1(陰性對(duì)照組命名為HEK293/pGL4.21)。

1.2.5 熒光素酶活性測(cè)定 熒光素酶活性測(cè)定按照熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，將HEK293/pGL4.21-BACE1和HEK293/pGL4.21(陰性對(duì)照組)細(xì)胞以2×104接種96孔板(各3個(gè)重復(fù)孔)，培養(yǎng)24 h后每孔加與培養(yǎng)基等體積的Luciferase Reagent，輕輕混勻。室溫裂解10 min后在化學(xué)發(fā)光儀Glomax 96(Promega)中測(cè)量螢火蟲(chóng)熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1 BACE1基因啟動(dòng)子擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定 提取HEK293細(xì)胞基因組DNA，以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增BACE1基因上游長(zhǎng)度758 bp的核心啟動(dòng)子(-691～+67)，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳可見(jiàn)大小約758 bp的條帶，與目的片段大小相符，見(jiàn)圖1。

M:DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 泳道1～5:BACE1基因啟動(dòng)子。

圖1 BACE1基因啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增

2.2 熒光素酶報(bào)告載體pGL4.21-BACE1的構(gòu)建與鑒定 758 bp的PCR產(chǎn)物與攜帶螢火蟲(chóng)熒光素酶基因的pGL4.21分別以NheI和XhoI雙酶切，連接并轉(zhuǎn)化DH5α后挑取2個(gè)陽(yáng)性克隆子。經(jīng)NheI和XhoI雙酶切后可見(jiàn)大小約5 532 bp(pGL4.21)與758 bp(BACE1啟動(dòng)子)的2個(gè)片段出現(xiàn)(圖2A)。測(cè)序驗(yàn)證也正確，這說(shuō)明本研究成功構(gòu)建攜帶BACE1啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告載體，見(jiàn)圖2B。

A:熒光素酶報(bào)告載體pGL4.21-BACE1的酶切鑒定；B:攜帶BACE1基因啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告載體結(jié)構(gòu)圖。Luc2P:螢火蟲(chóng)熒光素酶基因；PSV40:SV40啟動(dòng)子；Puro:嘌呤霉素抗性基因；1:1號(hào)克隆子；2:2號(hào)克隆子。

圖2 熒光素酶報(bào)告載體pGL4.21-BACE1的鑒定及結(jié)構(gòu)圖

2.3 構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)BACE1啟動(dòng)子的細(xì)胞系 pGL4.21-BACE1和陰性對(duì)照pGL4.21轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞(6孔板)后48 h，培養(yǎng)基中加入嘌呤霉素進(jìn)行穩(wěn)定篩選。培養(yǎng)第14天時(shí)采用有限稀釋法克隆化，最后篩選得到6株單克隆穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株HEK293/pGL4.21-BACE1(克隆子1～6)。

2.4 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株具有轉(zhuǎn)錄活性 本研究對(duì)篩選到的6株穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)(把陰性對(duì)照組HEK293/pGL4.21的熒光值看作1)。結(jié)果表明，克隆子1～6均具有較強(qiáng)的熒光活性，其熒光值分別為對(duì)照組(HEK293/pGL4.21)的(134.7±22.3)、(634.0±13.9)、(437.6±6.1)、(805.5±5.5)、(492.8±59.1)、(1 021.1±46.6)倍(P=0.001)。其中，6號(hào)克隆子熒光活性最強(qiáng)，作為后續(xù)試驗(yàn)使用。

3 討 論

BACE1是人體內(nèi)唯一的β分泌酶，它能剪切APP生成Aβ，且在AD患者腦中，Aβ是淀粉樣炎癥斑的主要組成成分，Aβ沉積在AD的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。抑制BACE1活性以降低Aβ生成成為治療AD的靶點(diǎn)。目前對(duì)AD治療的研究均致力于開(kāi)發(fā)β-和γ-分泌酶抑制劑，以抑制Aβ的產(chǎn)生[10-13]，但是APP還可以被α-和γ-分泌酶裂解產(chǎn)生可溶性且具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用的sAPPα片段。所以非特異性地抑制γ-分泌酶會(huì)導(dǎo)致生理功能紊亂[14]。有報(bào)道稱在AD發(fā)病過(guò)程中，Aβ隨著B(niǎo)ACE1的上調(diào)而增多，并與AD發(fā)病呈正相關(guān)[15]；用BACE1 siRNA處理神經(jīng)干細(xì)胞后Aβ產(chǎn)生明顯減少[6]。BACE1過(guò)表達(dá)或活性增強(qiáng)可能導(dǎo)致Aβ過(guò)度產(chǎn)生，最終誘導(dǎo)認(rèn)知功能損傷。因此，針對(duì)BACE1的靶向治療可能成為治療AD的一種新途徑[10-12]。因此，構(gòu)建攜帶BACE1基因的熒光素酶報(bào)告載體來(lái)研究BACE1基因的調(diào)控和功能具有重要意義。

利用熒光素酶報(bào)告載體研究啟動(dòng)子對(duì)下游基因的調(diào)控，可以避免下游基因表達(dá)產(chǎn)物對(duì)啟動(dòng)子的干擾，能較好地反映外在因素對(duì)調(diào)控序列的影響。近年來(lái)，利用熒光素酶報(bào)告基因載體的藥物篩選方法得到廣泛應(yīng)用。本試驗(yàn)通過(guò)克隆人BACE1基因核心啟動(dòng)子，構(gòu)建螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告載體pGL4.21-BACE1，并成功篩選到6株穩(wěn)定表達(dá)該啟動(dòng)子的HEK293細(xì)胞株。本研究構(gòu)建的HEK293/pGL4.21-BACE1細(xì)胞株具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性，雖然比瞬時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)的轉(zhuǎn)錄活性低1～2個(gè)數(shù)量級(jí)，但是穩(wěn)定表達(dá)更利于藥物的高通量篩選，減少了組間差異。

綜上所述，本試驗(yàn)成功構(gòu)建BACE1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶報(bào)告載體，并篩選到了穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，將為高通量藥物篩選及進(jìn)一步研究BACE1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控提供重要的細(xì)胞學(xué)研究手段。

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Construction of HEK293 cell line stably expressing human BACE1 promoter and luciferase reporter gene*

DengChangqing1,2,ZhuBinglin1,LongYan1,LuoWei1,ChenGuojun1△

(1.KeyLaboratoryofNeurology,FirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China; 2.DepartmentofIntensiveMedicine,ChonggangGeneralHospital,Chongqing400037,China)

Objective To clone human β-site APP cleaving enzyme (BACE1) gene core promoter for constructing luciferase reporter gene vector carrying BACE1 gene promoter and screening stable expression cell line,and to investigate its transcriptional activity.Methods The human embryo kidney HEK293 cell genome DNA was extracted as the template,BACE1 core promoter(-691～+67) was amplified by PCR,then was inserted into luciferase reporter vector pGL4.21.BACE1 gene promoter luciferase reporter vector pGL4.21-BACE1 was constructed,which was transfected into HEK293 cell (pGL4.21 vector without promoter as the negative control),after screening stable expression cell line by puromycin,the transcriptional activity was detected.Results About 758 bp BACE1 gene core promoter was successfully amplified by PCR.pGL4.21-BACE1 vector was correct by double enzyme identification.After transfecting HEK293 cell by this vector,6 cell strains stably expressing BACE1 promoter were obtained,and their transcriptional activities were (134.7±22.3),(634.0±13.9),(437.6±6.1),(805.5±5.5),(492.8±59.1),(1 021.1±46.6) times(P=0.001) of the control group(HEK293/pGL4.21) respectively.Conclusion Luciferase reporter vector of BACE1 gene promoter is constructed successfully.

β-site APP cleaving enzyme-1;core promoter;luciferase reporter gene vector;high-throughput drug screening

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.03.005

國(guó)家自然科學(xué)基金國(guó)際合作重大項(xiàng)目(81220108010)；國(guó)家自然科學(xué)基金 (81171197)；重慶市衛(wèi)生局重點(diǎn)基金 (2011-1-018) 。 作者簡(jiǎn)介：鄧常青(1980- )，主治醫(yī)師，本科，主要從事阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制方面研究。△

Q291

A

1671-8348(2017)03-0302-03

2016-07-12

2016-10-06)