草莓采后灰霉病生防菌Burkholderia contaminans培養(yǎng)基優(yōu)化分析

施俊鳳，孫常青，李靜,3

（1山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮研究所，太原030031；2山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，太原030031；3山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原030031）

草莓采后灰霉病生防菌Burkholderia contaminans培養(yǎng)基優(yōu)化分析

施俊鳳1，孫常青2，李靜1,3

（1山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮研究所，太原030031；2山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，太原030031；3山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原030031）

旨在研究洋蔥伯克霍爾德菌Burkholderia contaminans在搖瓶條件下的生物量最大培養(yǎng)基配方。試驗(yàn)采用多因素二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)的方法，通過對(duì)不同碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽種類和濃度對(duì)B. contaminans生長(zhǎng)的影響，確定拮抗菌濃度最大的培養(yǎng)基配方。篩選出的最佳培養(yǎng)基配方為：麥芽浸粉2.11%、酵母提取物1.90%、磷酸二氫鉀0.05%，硫酸錳0.05%。在該培養(yǎng)條件下，伯克氏菌Burkholderia contaminans B-1生物量達(dá)到最大值，且經(jīng)過進(jìn)一步驗(yàn)證，其優(yōu)化效果較好。拮抗菌株B.contaminans培養(yǎng)條件的優(yōu)化分析為該菌高產(chǎn)發(fā)酵工藝的建立奠定了基礎(chǔ)，促進(jìn)了該菌株在果蔬采后生物防治的應(yīng)用與產(chǎn)業(yè)化開發(fā)。

Burkholderia contaminans B-1；培養(yǎng)基；二次通用旋轉(zhuǎn)組合；優(yōu)化分析

0 引言

草莓(Fragaria ananassa Duch.)屬薔薇科草莓屬，果實(shí)顏色鮮艷，果肉酸甜適口，由于其組織嬌嫩，外部缺乏保護(hù)皮層，在采后貯運(yùn)中極易受損傷和病菌侵染，常溫下1～3天即會(huì)腐爛變質(zhì)，嚴(yán)重限制了其生產(chǎn)的產(chǎn)業(yè)化和規(guī)模化[1]。灰霉病是草莓采后常見病害，其病原菌灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)寄主范圍廣，耐低溫，所以在果實(shí)貯藏環(huán)境中極易發(fā)生，直接影響其商品價(jià)值及食用價(jià)值[2-3]。用微生物進(jìn)行采后病害的生物防治是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一個(gè)新的研究領(lǐng)域。自從20世紀(jì)50年代Gutter等[4]首次報(bào)道枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)對(duì)水果病原菌具有生防作用以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其采后病害的生物防進(jìn)行了廣泛研究[5-6]。因此，生防菌劑的研發(fā)對(duì)于延長(zhǎng)草莓貨架期以及草莓的生產(chǎn)具有重要意義。

Burkholder在1950年首次報(bào)道一株細(xì)菌可以引起洋蔥鱗莖發(fā)生腐爛，稱為洋蔥假單胞菌(Pseudomonas cepacia)[7]。近年來(lái)，隨著細(xì)菌分類技術(shù)的發(fā)展，洋蔥伯克霍爾德菌已不僅僅作為一個(gè)種，而是一組基因型不同、表型相近的復(fù)合物，稱為洋蔥霍爾德菌復(fù)合群（Burkholderia cepacia complex，簡(jiǎn)稱Bcc）[8]，目前洋蔥伯克霍爾德菌復(fù)合群共包括17個(gè)其因型[9]。有文獻(xiàn)報(bào)道，農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中洋蔥伯克霍爾德菌具有生物防治、生物降解以及促進(jìn)植物生長(zhǎng)等多種功能，有廣泛的應(yīng)用前景。目前已有一些Bcc用于果實(shí)采后領(lǐng)域的相關(guān)報(bào)道，如Parke[10]發(fā)現(xiàn)Bcc不僅可以有效抑制梨青霉病、蘋果灰霉病和桃褐腐病等采后病害，對(duì)其植株的莖葉病害的也有較強(qiáng)的抑制作作。范青等[11]發(fā)現(xiàn)Bcc對(duì)甜櫻桃褐腐病表現(xiàn)出顯著的抑制效果，謝關(guān)林等[12]發(fā)現(xiàn)在離體條件下Bcc菌株可顯著抑制水稻紋枯病菌和惡苗病菌的生長(zhǎng)。通過實(shí)驗(yàn)證明，生防菌的拮抗效力與其生物量濃度密切相關(guān)，濃度越大，生防效果越好。因此，研究不同碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽對(duì)伯克氏菌Burkholderia contaminans B-1的發(fā)酵生物量的影響，并優(yōu)化其配方，對(duì)于提高生防菌的拮抗效力和商業(yè)化應(yīng)用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

生防菌：B.contaminans B-1分離自杏果實(shí)表面，經(jīng)純化后進(jìn)行分子和生理生化鑒定，保存于-80℃。供試病原菌：于草莓果實(shí)自然發(fā)病部位分離灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)，純化后PDA平板培養(yǎng)7天，刮取分生孢子，采用血球計(jì)數(shù)法配制成濃度為1.0×l05個(gè)/mL的霉菌孢子懸浮液。

草莓品種為‘紅顏’，采自山西省太谷縣東陽(yáng)鎮(zhèn)，達(dá)商品成熟度采收。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同濃度拮抗菌對(duì)草莓果實(shí)的抑制效果參照Bi等[13]的方法，挑選大小、成熟度一致、無(wú)機(jī)械傷的草莓果實(shí)，1.0%的次氯酸鈉溶液中浸泡1 min，無(wú)菌風(fēng)吹干，用無(wú)菌鐵釘在其赤道部位刺直徑3 mm深度約3 mm的傷口，在傷口處分別加30 μL B.contaminans B-1發(fā)酵原液、5倍發(fā)酵液、10倍發(fā)酵液和無(wú)菌水，以加無(wú)菌水處理作為對(duì)照，無(wú)菌風(fēng)吹干2 h后各傷口處再加15 μL霉菌孢子懸浮液，將各處理果實(shí)于16℃培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)5天后，檢查其發(fā)病情況。

1.2.2 最佳碳源篩選、氮源和無(wú)機(jī)鹽的篩選將生防菌株在LB固體培養(yǎng)基活化后，于LB液體培養(yǎng)基中接種一環(huán)B.contaminans B-1，于50/250mL三角瓶以28℃200 r/min搖瓶培養(yǎng)24 h制備種子液。以1%YNB為基礎(chǔ)氮源，分別添加1%的不同碳源，28℃200 r/min進(jìn)行篩選；以1%篩選出的最佳碳源為碳源，分別添加1%不同氮源進(jìn)行氮源的篩選；再分別以1%最佳碳源和最佳氮源為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加0.05%的8種無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行最佳無(wú)機(jī)鹽的篩選。每處理重復(fù)3次。

1.2.3 最佳培養(yǎng)基成分優(yōu)化分析采用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因子有碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽1和無(wú)機(jī)鹽2，每因子5個(gè)水平[14]。以B.contaminans B-1生長(zhǎng)稀釋10倍液的OD600值作為響應(yīng)值。試驗(yàn)因子水平與編碼見表1。每處理3次重復(fù)。

表1 試驗(yàn)因素水平與編碼表

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Desjgn-Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行31組處理組合，每處理組合設(shè)3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 B.contaminans B-1對(duì)草莓傷口接種抑制效果

采用不同處理液處理草莓果實(shí)見圖1，對(duì)照果草莓高度腐爛，病害嚴(yán)重，基本整果腐敗潰爛。而發(fā)酵原液和稀釋5倍的發(fā)酵液接種草莓后，草莓果無(wú)腐爛現(xiàn)象，稀釋10倍的發(fā)酵液處理可使草莓果實(shí)腐爛率下降14.63%，果實(shí)的病斑直徑降低了63.63%（表2）。由此可見，生防菌株可有效抑制草莓采后灰霉病的發(fā)生，而且其抑制活性與其濃度呈正相關(guān)，濃度越大，抑制效果越好。

圖1 B.contaminansB-1對(duì)草莓傷口接種灰霉病抑制效果(16℃5d)

表2 生防菌不同處理液對(duì)草莓果實(shí)灰霉病抑制作用(P＜0.05)

2.2 生防菌對(duì)碳源和氮源的利用能力

B.contaminans B-1對(duì)不同碳源和氮源的利用能力見表3。由表3可知，在供試的11種碳源中，B.contaminans對(duì)麥芽浸粉利用能力最強(qiáng)，顯著高于其他碳源，在氮源中對(duì)酵母提取物的利用能力最強(qiáng)，顯著高于其他氮源。

2.3 拮抗菌對(duì)無(wú)機(jī)鹽的利用能力

B.contaminans B-1對(duì)無(wú)機(jī)鹽的利用如表4所示。從表中可知，在7種無(wú)機(jī)鹽中，除了K2HPO4、MnSO4、KH2PO4外，其余4種無(wú)機(jī)鹽對(duì)B.contaminans的生長(zhǎng)均為負(fù)效應(yīng)，其中K2HPO4和MnSO4正效應(yīng)最強(qiáng)。因此，選取麥芽浸粉、酵母提取物、K2HPO4和MnSO4作為進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)的4個(gè)因素進(jìn)行配方篩選。

2.4 回歸模型的建立

表3 伯克氏菌B.contaminans B-1對(duì)各種碳源和氮源的利用能力

以決策變量麥芽浸粉為X1，酵母提取物為X2，磷酸二氫鉀為X3，硫酸錳為X4，B.contaminans活菌數(shù)為目標(biāo)函數(shù)Y，所得3次重復(fù)93組試驗(yàn)數(shù)據(jù)如表5。通過數(shù)據(jù)建立拮抗菌與培養(yǎng)條件的回歸模型，回歸方程為：Y=1.35+0.099 X1+0.12 X2-0.013 X3-0.002486 X4-0.12X1X2+0.013 X1X3+0.004729 X1X4+0.022 X2X3-0.002687X2X4+0.019X3X4-0.14 X12-0.1 X22-0.075X32-0.098 X42。

表4 B.contaminans B-1對(duì)7種無(wú)機(jī)鹽的利用能力

表5 二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

決定系數(shù)R2=0.9786，回歸方程極顯著(P＜0.01)，對(duì)各項(xiàng)回歸系數(shù)檢驗(yàn)后（表6）可知：麥芽浸粉X1、酵母提取物X2及兩者二次項(xiàng)對(duì)B.contaminans的生長(zhǎng)均有極顯著的影響(P＜0.01)，磷酸二氫鉀X3、硫酸錳X4的二次項(xiàng)和麥芽浸粉與酵母提取物交互作用也具有極顯著影響(P＜0.01)，而2種無(wú)機(jī)鹽和其交互作用影響不顯著(P＞0.05)，由各因素F值可看出，對(duì)B.contaminans生長(zhǎng)影響作用依次為酵母提取物、麥芽浸粉、磷酸二氫鉀、硫酸錳。

2.5 單因子效應(yīng)分析

由表7可知麥芽浸粉、酵母提取物對(duì)B. contaminans B-1生長(zhǎng)均有極顯著影響(P＜0.01)，2種無(wú)機(jī)鹽則影響不顯著。將4因素中的3個(gè)固定在零水平降維分析，可得出以一個(gè)因素為變量的偏回歸模型，根據(jù)模型作單因素圖（圖2）。由圖2可知contaminansB-1的生長(zhǎng)隨著麥芽浸粉、酵母提取物、磷酸二氫鉀、硫酸錳濃度的增加表現(xiàn)出先增后減的趨勢(shì)，表明這4個(gè)因素均具有最佳值，濃度過低或過高都影響菌株的生長(zhǎng)。

續(xù)表5

表6 回歸方程各項(xiàng)回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

2.6 培養(yǎng)條件分析

在回歸模型中，將一個(gè)因素定在零水平，等高線圖、曲面圖則可體現(xiàn)兩個(gè)因素的交互作用（圖3）。圖中，當(dāng)麥芽浸粉固定在零水平時(shí)，B.contaminans B-1生長(zhǎng)隨酵母提取物濃度的升高，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；當(dāng)酵母提取物固定在零水平時(shí)，拮抗菌的生長(zhǎng)隨麥芽浸粉含量的升高呈現(xiàn)先逐步上升而后慢慢下降的變化，曲面的最高點(diǎn)出現(xiàn)在X1∈[0.5%，4%]，X2∈[0.75%，3%]區(qū)域。

2.7 培養(yǎng)條件的驗(yàn)證

利用Desjgn-Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件確定出各因素最佳水平為X1=0.115，X2=0.538，X3=-0.002，X4=-0.018，轉(zhuǎn)化成編碼前水平為：麥芽浸粉2.11%、酵母提取物1.9%、磷酸二氫鉀0.05%，硫酸錳0.05%，對(duì)應(yīng)Y值為1.38901。為驗(yàn)證此培養(yǎng)條件，用2.11%麥芽浸粉、1.9%酵母提取物、0.05%磷酸二氫鉀，0.05%硫酸錳搖瓶培養(yǎng)B.contaminans B-1，得到的菌液稀釋后OD600為1.31。誤差為5.0%，與模型值接近，說(shuō)明模型可用。

圖2 各單因子與contaminans B-1生物量的關(guān)系

圖3 麥芽浸粉與酵母提取物之間相互作用的等高線圖和曲面圖

3 討論與結(jié)論

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的優(yōu)化方法應(yīng)該能夠正確構(gòu)建考核指標(biāo)與其各影響因子的關(guān)系，即建立合適的數(shù)學(xué)模擬方程[15-16]。使用響應(yīng)面設(shè)計(jì)法克服了正交設(shè)計(jì)只能處理離散的水平值而無(wú)法找出整個(gè)區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值的缺陷，還可以分析幾種因素間的交互作用，以達(dá)到較全面反映各因子水平的效果[17-20]。該方法可使實(shí)驗(yàn)次數(shù)大大減少，因此廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)試驗(yàn)和科學(xué)研究[21-22]。

近年來(lái)微生物菌劑的研發(fā)應(yīng)用受到廣大研究者的普遍重視，其微生物制劑種類也較多，如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、假單胞菌(Pseudomonas spp.)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)等。但是在生產(chǎn)應(yīng)用中，常常存在發(fā)酵液活菌數(shù)量不高的問題，這樣不僅限制了應(yīng)用效果，也限制了產(chǎn)品推廣[23]。關(guān)于洋蔥伯克霍爾德菌的不同基因型近年也有一些研究，如吳義飛等[24]發(fā)現(xiàn)洋蔥伯克霍爾德菌NSM-05的最適培養(yǎng)基為玉米粉、蛋白胨、氯化鈉和硫酸鎂，與本研究中篩選的碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽不盡相同，其原因可能是由于2個(gè)菌株基因型不同，所以對(duì)其不同營(yíng)養(yǎng)條件的需求有差異。本試驗(yàn)通過對(duì)拮抗菌株B.contaminans B-1培養(yǎng)基的優(yōu)化篩選，其抑菌活性和活菌數(shù)量得到明顯提高，對(duì)草莓采后灰霉病有很好的防治效果。由于本實(shí)驗(yàn)是在實(shí)驗(yàn)室搖瓶條件下進(jìn)行，要實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，還需進(jìn)行發(fā)酵罐條件放大實(shí)驗(yàn)，在優(yōu)化的發(fā)酵條件下隨時(shí)檢測(cè)pH變化、溶氧量變化、還原糖和氨基酸變化，在適當(dāng)時(shí)滿足生防菌的營(yíng)養(yǎng)需求，以提高生防菌發(fā)酵菌量和抑菌物質(zhì)產(chǎn)量[25-26]。

綜上，本試驗(yàn)首先考察了不同碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽等因素對(duì)伯克氏菌B.contaminans B-1生長(zhǎng)的影響，根據(jù)篩選出的4個(gè)主要因素進(jìn)一步進(jìn)行二次通用旋轉(zhuǎn)組合法，確定其最佳培養(yǎng)基配方為：麥芽浸粉2.11%、酵母提取物1.9%、磷酸二氫鉀0.05%和硫酸錳0.05%，并對(duì)其可行性做了進(jìn)一步驗(yàn)證，為B.contaminans B-1的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用了提供理論依據(jù)。

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Medium Optimization Analysis of Biocontrol Bacteria Burkholderia contaminans B-1 Against Fruit Postharvest Grey Mould

Shi Junfeng1,Sun Changqing2,Li Jing1,3

(1Institute of Agricultural Product Storage and Fresh Keeping,Shanxi Academy of Agricultural Sciences,Taiyuan 030031,Shanxi, China;2Institute of Crop Sciences,Shanxi Academy of Agricultural Sciences,Taiyuan,030031,Shanxi,China;
3College of Life Science,Shanxi University,Taiyuan 030006,Shanxi,China)

This objective was to discover the culture medium formulation of Burkholderia contaminans with the biggest biomass yield under shake flask conditions.In this experiment,we used the multi-factor quadratic general rotary unitized design method to study the effects of varied carbon sources,nitrogen sources and inorganic salt types&concentrations on strain growth,and finally determined the proper formulation.The optimal medium formulation was as follows:malt powder 2.11%,yeast extract 1.90%,KH2PO40.05%and MnSO40.05%.It had been proved that the biomass of B.contaminans reached the maximum under this condition and showed better optimization effects by further detection.This optimization analysis will pave the way for establishing high yield fermentation process of B.contaminans,and facilitate its application in afterharvest biocontrol of fruits and vegetables,and industrialized development as well.

Burkholderia contaminans B-1;Culture Medium;Quadratic General Rotary Combination; Optimization Analysis

S476

A論文編號(hào)：cjas16060005

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目“拮抗菌Burkholderia contaminans對(duì)草莓采后生防技術(shù)的研究”(20140311025-2)；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士基金“拮抗菌Burkholderia contaminans對(duì)草莓采后生防潛力研究”(YBSJJ1414)；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后基金“生防菌株對(duì)果實(shí)采后灰霉病防治機(jī)理研究”(BSH-2015JJ-003)。

施俊鳳，女，1977年出生，山西代縣人，副研究員，博士，主要從事果蔬采后病害及其生物防治研究。通信地址：030031山西省太原市小店區(qū)龍城大街79號(hào)省農(nóng)科院保鮮所，Tel：0351-7126730，E-mail：sjfty@126.com。

2016-06-01，

2016-07-21。